本發(fā)明涉及高分子材料和組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種新型的脂肪干細(xì)胞(Adipose stem cells,ASCs)結(jié)合POC-PLA(聚檸檬酸酯-聚乳酸)電紡絲生物補(bǔ)片，修復(fù)缺損組織的新方法，及其將該補(bǔ)片和方法在修復(fù)胸壁全層缺損中的研究應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大面積的全層胸壁缺損重建仍然是困擾整形科、心胸外科的難題，臨床上此類手術(shù)往往需要心胸外科醫(yī)生重建封閉胸腔，重建骨性支架，同時(shí)軟組織的缺損則需要整形外科醫(yī)生靈活運(yùn)用合適的皮瓣進(jìn)行移植修復(fù)。目前影響胸壁缺損重建效果的因素還是在于合適的選擇胸壁重建的材料。雖然目前臨床上有鈦板、人工骨、各種補(bǔ)片可供選擇，但是尚無一種能完全達(dá)到胸壁重建的理想要求。臨床前研究正不停尋找新的更接近正常胸壁形態(tài)與功能的材料，隨著材料學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，一種更合適的重建材料勢必將更顯著地改善此類患者的術(shù)后生存質(zhì)量。一種理想的胸壁替代材料需要有極佳的抗張力和彈性、來源廣泛使用方便、具有很好的生物相容性。此外，最佳的材料在術(shù)后不會造成組織的粘連，同時(shí)能夠促進(jìn)胸壁修補(bǔ)處的組織重塑。

POC是具有極佳彈性的可吸收材料，最初設(shè)計(jì)用于組織工程小血管的支架材料[J Yang，WA R.，AG A.Novel Citric Acid‐Based Biodegradable Elastomers for Tissue Engineering.Advanced Materials,2004,16(6):511-516]。POC合成過程中對環(huán)境的要求不高，甚至在37℃，就可以合成，這使得POC材料可以和藥物或者蛋白結(jié)合成為復(fù)合體。此外還可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)力學(xué)強(qiáng)度和分解率，固有表面容易被細(xì)胞附著。目前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了內(nèi)皮祖細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞的體外共培養(yǎng)，各種細(xì)胞和POC材料都有很好的相容性[Hidalgo-Bastida LA,Barry JJ,Everitt NM,er al.Cell adhesion and mechanical properties of a flexible scaffold for cardiac tissue engineering.Acta Biomater.2007Jul；3(4):457-62.；MP Prabhakaran，AS Nair，K Dan，et al.Electrospun composite scaffolds containing poly(octanediol-co-citrate)for cardiac tissue engineering&dagger.Biopolymers,2012,97(7):529&ndash；538.；Claire G.Jeong,Huina Zhang,Scott J.Hollister.Three-dimensional poly(1,8-octanediol–co-citrate)scaffold pore shape and permeability effects on sub-cutaneous in vivo chondrogenesis using primary chondrocytes.Acta Biomaterialia,2011；505–514.]。

靜電紡絲技術(shù)就是高分子流體靜電霧化這樣的一種形式，此時(shí)霧化分裂出的物質(zhì)是聚合物微小射流，可以在干燥的環(huán)境內(nèi)運(yùn)行相當(dāng)長的距離，最終固化成納米級別的聚合物纖維。靜電紡絲制成的支架有很好的孔隙率，適合細(xì)胞的生長。PLA則是目前臨床常用的可降解材料。我們通過POC與PLA等比例混合用，用電紡絲技術(shù)制備成具有3D結(jié)構(gòu)的生物膜片用于胸壁重建。

脂肪干細(xì)胞是成體間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，從脂肪之中獲取。它具有向三個(gè)胚層分化的能力，可在不同的誘導(dǎo)因子作用下分化為多種細(xì)胞，同時(shí)可以分泌多種細(xì)胞因子[Schaffle A，Buchler C.Concise review:adipose tissue-derived stromal cells—bisic and clinical implications for novel cell-based therapies.Stem Cells,2007,25(4)；818-827.]。研究表明脂肪干細(xì)胞可以通過多種機(jī)制加快創(chuàng)面的愈合，包括旁分泌作用、多向分化能力、促進(jìn)血管新生等[張?jiān)?、邢新、楊超。脂肪來源干?xì)胞修復(fù)創(chuàng)面的研究進(jìn)展。中國美容整形外科雜志。2014,25(12)：742-44.]。ASCs表面僅表達(dá)非常少量的主要組織兼容性復(fù)合物-Ⅰ(Major histocompability complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ)，而主要組織兼容性復(fù)合物-Ⅱ(Major histocompability complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ)、CD80、CD86和CD40則不表達(dá)[Le Blanc,K.and O.Ringden.Immunosuppression by mesenchymal stem cells and clinical experience.J Intern Med,2007.265(5):509-525.]，因此不會激活異體的淋巴免疫反應(yīng)。ASCs也被證實(shí)可以抑制T和B淋巴細(xì)胞的活化和增生[Corcione,A.et al.Human mesenchymal stem cells modulate B-cell function.Blood,2006,107:367-72.]。此外，ASCs還能分泌白介素6(Interleukin-6，IL-6)、集落刺激因子(Colony stimulating Factor，CSF)等影響樹突狀細(xì)胞的分化、成熟和功能[Djouad,F.et al.mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of dendritic cells through an interleukin-6dependent mechanism.Stem Cells,2007,25:2025-32.]?？梢夾SCs有較低的免疫源性，能減輕炎癥反應(yīng)，異種動物使用也不會引起宿主的免疫反應(yīng)。因此脂肪干細(xì)胞的運(yùn)用對于加速創(chuàng)傷的愈合，減少炎癥反應(yīng)都將為一系列疾病的治療提供新的方法。

中國專利文獻(xiàn)CN 103877622A公開了一種靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，制備方法包括如下步驟：S1.制備生物降解材料的靜電紡絲纖維膜，所述生物降解材料為聚己內(nèi)酯、左旋聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物；S2.將步驟S1制得的靜電紡絲纖維膜平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)容器中，用培養(yǎng)基浸泡，然后接種干細(xì)胞，于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～10天，每隔2～3天更換培養(yǎng)基，接著進(jìn)行脫細(xì)胞處理，最后干燥即可得到靜電紡絲納米纖維-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合材料。

目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)ASCs膜片結(jié)合POC-PLA補(bǔ)片復(fù)合體修復(fù)胸壁缺損的研究及應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的生物補(bǔ)片材料，本發(fā)明的另一目的在于提供一種修復(fù)組織缺損的方法，以及該生物補(bǔ)片材料和方法在胸壁全層缺損中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一方面，提供一種ASCs結(jié)合POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體，由POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片和ASCs細(xì)胞膜片組成，所述的POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片中POC和PLA的質(zhì)量比為1：1；所述的ASCs細(xì)胞膜片是采用細(xì)胞膜片技術(shù)將ASCs均勻的種植于POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片之上。

本發(fā)明的第二方面，提供上述ASCs結(jié)合POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體的制備方法，包括以下步驟：

A)POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片的制備：制備POC預(yù)聚體，以三氟乙醇為溶劑，按質(zhì)量比1：1的配比配制POC預(yù)聚體與PLA的溶液，其中PLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％，用上述溶液進(jìn)行靜電紡絲，靜電紡絲得到的纖維膜進(jìn)行固化、滅菌，得到POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片；

B)ASCs膜片結(jié)合POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體的制備：分離培養(yǎng)ASCs，取第3代ASCs制備附著在纖維蛋白薄片上的細(xì)胞膜片，將纖維蛋白薄片含細(xì)胞膜片一側(cè)向下放于補(bǔ)片之上，在培養(yǎng)箱內(nèi)37℃下孵育30分鐘；輕輕掀去纖維蛋白薄片，取出膜片復(fù)合體；將膜片復(fù)合體置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24小時(shí)；取出膜片復(fù)合體，用PBS輕輕沖洗去除培養(yǎng)基，得到所述的靜電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體。

優(yōu)選的，所述的步驟A中POC預(yù)聚體的制備方法包括：按摩爾比1：1將檸檬酸和1,8-辛二醇加入到容器中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在油浴中加熱至160℃，攪拌10min至粉末全部熔融；然后在140℃、常壓下聚合約40min，得到預(yù)聚體；趁熱迅速將預(yù)聚體移出，依次加入乙醇溶解預(yù)聚體及蒸餾水沉淀出預(yù)聚體，反復(fù)清洗數(shù)次，以完全除去未反應(yīng)的單體，得到較為純凈的POC預(yù)聚體。

優(yōu)選的，所述的步驟B包括以下步驟：

(1)取分離培養(yǎng)的第3代ASCs，按照傳代相同的方法消化細(xì)胞后，以1×10⁶接種于溫敏培養(yǎng)皿，加入含10％FBS的完全培養(yǎng)基；

(2)細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱5％CO₂，37℃條件下培養(yǎng)；

(3)待細(xì)胞融合長滿后，吸走溫敏培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基，加適量PBS濕潤細(xì)胞膜片。將配套的纖維蛋白薄片輕輕放置于細(xì)胞膜片表面，注意不要產(chǎn)生氣泡，溫敏培養(yǎng)皿置于25℃孵化10分鐘；

(4)用無菌鑷子輕輕掀起纖維蛋白薄片，鏡下觀察溫敏培養(yǎng)皿是否有殘余的細(xì)胞；

(5)POC-PLA補(bǔ)片剪裁4×4cm大小，在PBS中浸泡2小時(shí)后，將纖維蛋白薄片含細(xì)胞膜片一側(cè)向下放于補(bǔ)片之上，加1ml培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱內(nèi)37℃下孵育30分鐘；

(6)輕輕掀去纖維蛋白薄片，取出膜片復(fù)合體；

(7)將膜片復(fù)合體置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24小時(shí)；

(8)取出膜片復(fù)合體，用PBS輕輕沖洗去除培養(yǎng)基，得到所述的靜電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體。

本發(fā)明的第三方面，提供上述ASCs結(jié)合POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體在制備胸壁缺損重建材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明的構(gòu)思如下：本發(fā)明基于ASCs來源廣泛，具有向多胚層分化、促進(jìn)組織修復(fù)的能力，與彈性良好的可吸收材料POC-PLA合成生物補(bǔ)片復(fù)合體，通過肉眼及鏡下的形態(tài)學(xué)觀察，及相關(guān)炎癥指標(biāo)和增殖凋亡的檢測其生物相容性，并建立動物模型，研究運(yùn)用此生物補(bǔ)片復(fù)合體修復(fù)胸壁缺損對機(jī)體的影響。

本發(fā)明的主要技術(shù)方案包括三個(gè)部分：

第一部分，rASCs分離與鑒定。我們?nèi)⊥妙i背部的脂肪，采用酶消化法分離出rASCs。在分離的過程中，需要注意的是對消化前期脂肪的預(yù)處理，在獲取脂肪之后，對脂肪組織充分的沖洗和修剪可以有效提高獲取的ASCs純度。用流式細(xì)胞術(shù)對上述方法分離成功的ASCs進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定，結(jié)果表明CD29、CD44、CD90的陽性表達(dá)率分別為92％、38％、93.5％(見圖1)。證明用酶消化法能非常高效的獲得較高純度的ASCs。

實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)ASCs的細(xì)胞增值能力會隨著傳代數(shù)的增多而漸漸下降，因此在使用rASCs時(shí)往往使用代數(shù)較低的細(xì)胞。我們?nèi)〉?代rASCs進(jìn)行了多向分化的檢測?？梢钥吹皆谡T導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，rASCs向軟骨、骨和脂肪都有較高的轉(zhuǎn)化率。前三代MTT檢測和細(xì)胞生長曲線都表明，第3代rASCs細(xì)胞活性佳，有很好的干性(見圖2)。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將取第3代ASCs作為種子細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

第二部分，rASCs膜片結(jié)合POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體的建立與材料安全性檢測。將POC與PLA等比例混合后，靜電紡絲形成具有一定力學(xué)性能的可降解膜片作為全層胸壁重建的材料(見圖3)。在膜片靠近胸腔側(cè)，種植一層脂肪干細(xì)胞膜片，防止補(bǔ)片與肺臟之間的粘連。

在補(bǔ)片的力學(xué)測試中，相比較目前臨床常用的e-PTFE補(bǔ)片，厚度較厚的POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片與薄層的e-PTFE補(bǔ)片表現(xiàn)出相似的彈力系數(shù)。而通過抗張強(qiáng)度和楊氏模量的比較，可以發(fā)現(xiàn)POC-PLA材料較e-PTFE有更好的彈力(見圖4)。而在使用靜電紡絲技術(shù)同樣賦予補(bǔ)片很好的三維結(jié)構(gòu)，在電鏡掃描的結(jié)果中，我們可以看到補(bǔ)片的孔隙直徑約在納米級別。這樣的三維孔隙結(jié)構(gòu)使得ASCs能很好的粘附于材料表面。在ASCs細(xì)胞種植于材料的24小時(shí)內(nèi)，就能觀察到細(xì)胞粘附于材料表面。在移植入體內(nèi)后，我們可見看到補(bǔ)片在體內(nèi)被組織所包裹，材料內(nèi)部孔隙可見細(xì)胞長入。植入第一周的補(bǔ)片CD31染色就可以看到周邊有大量新生的血管，在第四周的組織化學(xué)染色我們可以看見更多的血管生成以及長入(見圖5)。這些特性能夠證明補(bǔ)片能很好的作為支架，參與到組織的重建。

在組織相容性的測試中，我們可以發(fā)現(xiàn)，組織移植入的早期存在輕度的異物反應(yīng)，膜片表面可以看到巨噬細(xì)胞的浸潤，IL-6、TGFβ與TNFα等指標(biāo)都顯示升高。在早期膜片附近的細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的增殖信號水平，對caspase-3組織化學(xué)染色我們可以發(fā)現(xiàn)，膜片周邊細(xì)胞凋亡水平較正常增強(qiáng)，這可能是因?yàn)樵缙诘难装Y反應(yīng)所致，TUNEL染色可以看到少量的凋亡細(xì)胞。而一個(gè)月左右的樣本我們可以發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)已經(jīng)很輕，增殖與凋亡也接近于正常水平。(見圖6、7)

我們比較了使用細(xì)胞膜片技術(shù)和直接種植細(xì)胞于材料表面，結(jié)果證明細(xì)胞膜片技術(shù)能在很短的時(shí)間內(nèi)將大量的ASCs種植于材料之上，形成膜片樣結(jié)構(gòu)覆蓋材料表面。共培養(yǎng)方式種植ASCs制備時(shí)間更長，而且細(xì)胞容易形成局部生長的，相比較而言，膜片技術(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞生長更為均勻。(見圖8)

綜上所述，POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片有著極佳力學(xué)彈性的可吸收補(bǔ)片。細(xì)胞膜片技術(shù)則將大量的脂肪干細(xì)胞均勻的種植于補(bǔ)片之上。這樣形成的補(bǔ)片復(fù)合體既有很好的力學(xué)彈性，又可以促進(jìn)機(jī)體的重建，減輕炎癥反應(yīng)帶來的粘連。下面我們將使用這種補(bǔ)片復(fù)合體來重建兔的胸壁全層缺損。

第三部分，rASCs膜片結(jié)合POC-PLA電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體修復(fù)兔全層胸壁缺損的研究。我們的動物模型選用新西蘭兔。新西蘭兔體型相對狹長，胸壁保護(hù)胸腔內(nèi)器官與部分腹腔器官。新西蘭兔胸廓面積約5×10cm，參照文獻(xiàn)制備模型，缺損部位位于右側(cè)胸壁，面積約3×3cm，按正常成人的胸壁面積換算，約為10×10cm缺損面積，需要使用補(bǔ)片來加固胸壁。(見圖9)

我們可以觀察到，在一個(gè)月的樣本中，補(bǔ)片已經(jīng)被自身組織所包裹，在兩個(gè)月開始補(bǔ)片慢慢開始裂解，在六個(gè)月的樣本中，可見補(bǔ)片已經(jīng)完全吸收完畢，被自身組織所取代(見圖10)。組織的力學(xué)測試可以看出在8周后彈力系數(shù)已經(jīng)接近正常的胸壁肋間肌的彈性。

成長期的胸壁重建，容易出現(xiàn)胸壁的畸形。在單純進(jìn)行肌皮瓣重建的兔子，在8周以上的大體樣本上很容易發(fā)現(xiàn)胸壁的畸形，包括胸壁塌陷和胸廓移位，這可能跟肌皮瓣萎縮有關(guān)。而ePTFE重建和POC-PLA重建在早期均為出現(xiàn)胸廓的異常，24周以后少量的ePTFE重建胸壁出現(xiàn)了輕微的胸骨移位。在早期創(chuàng)面邊緣的組織增生減少了創(chuàng)面的面積，但是隨著體型增長與胸廓生長速度超過組織增生的量以后，ePTFE又會拉扯胸廓引起胸骨的移位。在POC-PLA材料重建的樣本中，均未出現(xiàn)胸壁的畸形和移位。這可能與較輕的炎癥反應(yīng)和自體細(xì)胞的重建有關(guān)。在連續(xù)的觀察中可以看到早期炎癥細(xì)胞的浸潤與成纖維細(xì)胞的長入，到后期材料邊緣有軟骨細(xì)胞的長入，而表面除了成纖維細(xì)胞之外，還可以看到肌纖維樣的組織參與了重建。(見圖11、12)

在術(shù)后效果的評估中，我們把肺功能也引入作為一項(xiàng)重要的評估指標(biāo)。盡管所有動物均沒有出現(xiàn)呼吸衰竭、反式呼吸等并發(fā)癥，但是進(jìn)行肺功能的檢測還是能夠發(fā)現(xiàn)差異。單純進(jìn)行肌皮瓣重建的兔子肺功能在術(shù)后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢查中，都表現(xiàn)的最差，F(xiàn)VC、FEF25～75％、0.4秒和0.6秒同期率都顯著低于其他組。ePTFE作為臨床常用的補(bǔ)片，在術(shù)后肺功能的恢復(fù)有較好的作用，各項(xiàng)指標(biāo)都接近正常。單純的POC-PLA補(bǔ)片術(shù)后肺功能的恢復(fù)介于單純皮瓣修復(fù)和使用ePTFE補(bǔ)片之間。盡管組織學(xué)檢測POC-PLA補(bǔ)片修復(fù)胸壁進(jìn)行了較好的重建，但是修補(bǔ)區(qū)域較為嚴(yán)重的粘連，可能是導(dǎo)致肺功能減少的原因。結(jié)合干細(xì)胞的POC-PLA補(bǔ)片復(fù)合體在所有組別中肺功能恢復(fù)的表現(xiàn)最好。在術(shù)后第24周的肺功能檢測中，已經(jīng)接近于正常水平。(見圖13)

POC-PLA在體內(nèi)的降解率較體外更快。在術(shù)后4周的樣本中，大體可見補(bǔ)片已經(jīng)局部出現(xiàn)了裂縫；12周的樣本中，大部分補(bǔ)片已經(jīng)出現(xiàn)龜裂；術(shù)后24周的樣本中，補(bǔ)片已經(jīng)被分解為小塊的碎片。CD31免疫組織化學(xué)染色可見補(bǔ)片周邊有密集的血管新生，在術(shù)后12周可以看見有血管長入補(bǔ)片裂痕間隙之中。復(fù)合了干細(xì)胞膜片的樣本可見到早期的血管密度更高，這可能加速了胸壁重建的速度(見圖14)。

ePTFE補(bǔ)片有較好的防粘連效果，粘連評分接近單純肌皮瓣修復(fù)，僅僅在少數(shù)樣本里發(fā)現(xiàn)比較嚴(yán)重的粘連。POC-PLA補(bǔ)片比較容易產(chǎn)生胸膜粘連，在所有的樣本中，均存在著不同程度的粘連情況。這種粘連的產(chǎn)生，可能與早期的炎癥反應(yīng)有關(guān)。Western Blot以及免疫組化均表現(xiàn)出TGFβ、IL6、TNFα等炎癥指標(biāo)的升高。而在應(yīng)用干細(xì)胞膜片之后，胸膜粘連的狀況明顯改善，炎癥指標(biāo)也相應(yīng)的下調(diào)。此外，POC-PLA較好的細(xì)胞附著性[Hidalgo-Bastida LA,Barry JJ,Everitt NM,et al.Cell adhesion and mechanical properties of a flexible scaffold for cardiac tissue engineering.Acta Biomater.2007 Jul；3(4):457-62.]，也可能是造成胸膜粘連的原因之一。干細(xì)胞膜片有效的阻止了臟層胸膜與材料早期的直接接觸，減少材料對胸腔內(nèi)氣管的吸附。同時(shí)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，也可能加速了內(nèi)皮樣細(xì)胞和纖維細(xì)胞對材料的包裹，減少后期粘連的產(chǎn)生。(圖15、16)

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明采用了彈性體POC材料為主體，加入等比例的PLA，通過靜電紡絲技術(shù)共紡出具有3D納米孔隙結(jié)構(gòu)的補(bǔ)片，與ASCs細(xì)胞膜片復(fù)合構(gòu)建成補(bǔ)片復(fù)合體，POC-PLA制成的補(bǔ)片有良好的生物相容性和可控的力學(xué)效應(yīng)，細(xì)胞膜片技術(shù)則將大量的脂肪干細(xì)胞均勻的種植于補(bǔ)片之上，這樣形成的補(bǔ)片復(fù)合體既有很好的力學(xué)彈性，又可以促進(jìn)機(jī)體的重建，減輕炎癥反應(yīng)帶來的粘連，促進(jìn)胸壁的重構(gòu)過程。

附圖說明

圖1.rASCs細(xì)胞的表型鑒定。

圖2.rASCs MTT檢測。

圖3.(A)POC-PLA電紡絲補(bǔ)片大體形態(tài)。(B)POC-PLA電紡絲補(bǔ)片電鏡下形態(tài)，放大倍數(shù)2000倍。

圖4.(A)POC-PLA電紡絲補(bǔ)片降解率(B)POC-PLA電紡絲補(bǔ)片拉伸系數(shù)檢測。

圖5.H&E組織染色(200×)。

圖6.SD大鼠免疫組化，從上到下分別為CD68、IL-6、TNFα和TGF-β(200×)。

圖7.SD大鼠免疫組化，從上到下分別為Ki67、PCNA、caspase3和TUNEL(200×)。

圖8.上排圖為細(xì)胞與材料種植后混合培養(yǎng)5天后電鏡照片，放大倍數(shù)從左到右分別為2000 1000 500；下排圖為ASCs膜片復(fù)合補(bǔ)片細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2h后電鏡照片，放大倍數(shù)從左到右分別為2000×1000×500×。

圖9.圖全層胸壁缺損模型建立與重建。(A)設(shè)計(jì)手術(shù)切口(B)切開皮膚剝離胸大肌至胸壁(C)切除3×3cm大小胸壁，含2-3根肋骨(D)ePTFE補(bǔ)片封閉胸壁缺口(E)POC-PLA補(bǔ)片封閉胸部缺口(F)胸大肌皮瓣覆蓋補(bǔ)片，縫合創(chuàng)面。

圖10.兔組織樣本H&E染色。

圖11.兔組織樣本masson染色。

圖12.兔組織樣本EVG染色。

圖13.術(shù)后呼吸功能指標(biāo)，左圖為術(shù)后FVC，有圖為術(shù)后FEV0.4/FVC％。

圖14.兔組織樣本CD31免疫組化染色。

圖15.肺粘連解剖所見。

圖16.胸膜粘連指數(shù)。

圖17.POC預(yù)聚體反應(yīng)式，R1、R2、R3和R4為檸檬酸和1,8-辛二醇。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

實(shí)施例1：rASCs的分離與鑒定

1、脂肪組織的處理：無菌獲取的脂肪組織用PBS沖洗兩次，洗去表面殘留的脂肪組織、血凝塊、紅細(xì)胞等。然后把脂肪組織呈放在10cm的培養(yǎng)皿中，加入20ml PBS溶液，在室溫的條件下處理5-10min，即用眼科剪刀和醫(yī)用鑷子仔細(xì)除去殘余的真皮、結(jié)締組織、血管等。再次清洗脂肪組織，然后移到一個(gè)新的培養(yǎng)皿，用整形剪刀剪成體積1mm³不規(guī)則的組織塊。

2、I型膠原酶配置：電子天平稱取100mgI型膠原酶，溶于100mlDMEM培養(yǎng)基，用0.22um濾器除菌。

3、脂肪組織的酶解：在剪碎成漿糊狀的脂肪組織中加入等體積0.1％I型膠原酶，37℃恒溫水浴振蕩消化50min。

4、離心：消化完全后，加入等量體積的完全培養(yǎng)基(低糖DMEM+10％胎牛血清+1％雙抗)中和，500g高速離心10min，取離心后的細(xì)胞沉淀層。

5、加入PBS吹打成細(xì)胞懸液后，放入離心機(jī)1000r/min低速離心，棄上清。此步驟需重復(fù)洗滌兩次。

6、過濾：加入PBS吹打成細(xì)胞懸液后，用70目濾網(wǎng)過濾結(jié)締組織至新離心管，離心后加入完全培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液。

7、細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按1.0×10⁵/ml密度接種在培養(yǎng)皿內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下培養(yǎng)，5％CO₂，37℃。

8、24小時(shí)后半量更換培養(yǎng)基，棄去未貼壁的細(xì)胞。

9、rASCs的培養(yǎng)：當(dāng)看見培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化需要進(jìn)行換液，細(xì)胞移液管吸去變色的陳舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿后加入適量新培養(yǎng)基。

10、rASCs的傳代：細(xì)胞長至密度80％進(jìn)行傳代，用PBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿洗去失活細(xì)胞，加入0.25％胰酶消化至細(xì)胞半貼壁狀態(tài)后，加入全培養(yǎng)基終止消化后，輕輕吹打下細(xì)胞。移送至離心機(jī)以1000r/min低速離心，棄上清。加入PBS吹打成細(xì)胞懸液后，放入離心機(jī)1000r/min低速離心，棄上清。加入適量全培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液后移植新培養(yǎng)皿。

本實(shí)驗(yàn)中，分離的rASCs細(xì)胞使用鏡下形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞技術(shù)和多向誘導(dǎo)分化來鑒定rASCs純度。

鏡下形態(tài)學(xué)觀察，取第三代rASCs置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞外形，注意細(xì)胞的形態(tài)、大小、細(xì)胞核狀態(tài)等。

實(shí)施例2：rASCs膜片結(jié)合POC-PLA電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體的建立

(一)POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片制備

POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片制備由東華大學(xué)材料學(xué)院吉亞麗教授、朱蕾完成，制備方法如下：

1、預(yù)聚體的制備：

按摩爾比1：1將檸檬酸和1,8-辛二醇加入到三口圓底燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在油浴中加熱至160℃，電動攪拌10min至粉末全部熔融。然后在140℃、常壓下聚合約40min，得到具有一定分子量的預(yù)聚體。趁熱迅速將預(yù)聚體移出三口燒瓶，轉(zhuǎn)移至大燒杯中，依次加入乙醇(溶解預(yù)聚體)及蒸餾水(沉淀出預(yù)聚體)，反復(fù)清洗數(shù)次，以完全除去未反應(yīng)的單體，可得到較為純凈的POC預(yù)聚體。反應(yīng)式見圖17。

2、預(yù)聚體的靜電紡絲：

以三氟乙醇為溶劑，按質(zhì)量比1：1的配比配制POC預(yù)聚體與PLA的溶液，其中PLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％，用上述溶液進(jìn)行靜電紡絲。紡絲之前，需用磁力攪拌器對溶液進(jìn)行24小時(shí)的充分?jǐn)嚢?，以確保溶解完全。將配制完成的溶液裝入5mL塑料注射器中，靜置以去除注射器中的氣泡，然后將注射器置于推進(jìn)器之上，針尖部分連接靜電發(fā)生器的正極，接收裝置上包裹鋁箔紙，固定軸承處接地，調(diào)節(jié)針尖與接收器之間的距離。開啟推進(jìn)器電源，設(shè)置流速，待針尖內(nèi)溶液穩(wěn)定均勻流出后，開啟靜電發(fā)生器電源，調(diào)節(jié)到合適電壓，開始紡絲。紡絲結(jié)束后，關(guān)閉電源。將靜電紡絲所得到的覆蓋有纖維膜的鋁箔取下，置于真空干燥箱中于一定溫度下固化。

3、膜片的滅菌：

膜片采用環(huán)氧乙烷消毒法滅菌，將膜片剪成合適形狀，與環(huán)氧乙烷指示條一同裝入密封袋，送入儀器滅菌，指示條變色表示滅菌完成。

(二)rASCs膜片結(jié)合POC-PLA靜電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體的制備

1、rASCs的分離和培養(yǎng)：

具體過程見第一部分相應(yīng)內(nèi)容。

2、細(xì)胞膜片的制備：

(1)取第3代rASCs，按照傳代相同的方法消化細(xì)胞后，以1×10⁶接種于溫敏培養(yǎng)皿，加入含10％FBS的完全培養(yǎng)基。

(2)細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱5％CO₂，37℃條件下培養(yǎng)。

(3)待細(xì)胞融合長滿后，吸走溫敏培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基，加適量PBS濕潤細(xì)胞膜片。將配套的纖維蛋白薄片輕輕放置于細(xì)胞膜片表面，注意不要產(chǎn)生氣泡，溫敏培養(yǎng)皿置于25℃孵化10分鐘。

(4)用無菌鑷子輕輕掀起纖維蛋白薄片，鏡下觀察溫敏培養(yǎng)皿是否有殘余的細(xì)胞。

(5)POC-PLA補(bǔ)片剪裁4×4cm大小，在PBS中浸泡2小時(shí)后，將纖維蛋白薄片含細(xì)胞膜片一側(cè)向下放于補(bǔ)片之上，加1ml培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱內(nèi)37℃下孵育30分鐘。

(6)輕輕掀去纖維蛋白薄片，取出膜片復(fù)合體。

(7)將膜片復(fù)合體置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24小時(shí)。

(8)取出膜片復(fù)合體，用PBS輕輕沖洗去除培養(yǎng)基。

實(shí)施例3：rASCs膜片結(jié)合POC-PLA電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體修復(fù)兔全層胸壁缺損

選取健康新西蘭兔雌性，兔齡為4～5月，體重為2.5-3kg。構(gòu)建動物模型。

1、麻醉：完成抓取固定后，用電子秤稱取兔體重，把配置好的1％戊巴比妥鈉溶液按0.3ml/Kg的用量耳緣靜脈注射麻醉兔。

2、固定：將麻醉成功的兔仰臥固定于兔解剖板，四肢固定于固定器，兔充分舒展，暴露整個(gè)胸部。

3、備皮：用動物剃毛推剔除胸部的毛，上至下顎，下至肋弓，兩側(cè)至側(cè)胸壁近上肢關(guān)節(jié)處，右側(cè)胸壁手術(shù)區(qū)域可適量剔除右側(cè)上肢毛，充分暴露手術(shù)區(qū)。

4、消毒：兔脫毛區(qū)域和其下方相應(yīng)的解剖臺區(qū)域用碘伏常規(guī)消毒3遍，最后用75％酒精消毒1遍脫色。

5、標(biāo)記鋪單：在右側(cè)胸壁第5肋骨與胸骨交界處為起點(diǎn)，沿肋骨做一長約6cm切口線，常規(guī)鋪單(圖9)。

6、氣管插管：將兔頭部向上抬起，保持氣管呈水平狀態(tài)。使用3.0嬰兒氣管導(dǎo)管盲視下經(jīng)兔口腔插入氣管，插入深度為12.5±1.5cm。插入到位后，使用注射器向氣囊注入1ml空氣，觀察氣囊鼓起。氣管導(dǎo)管接小動物呼吸機(jī)，維持潮氣量12ml/kg，頻率50次/min。

7、全層胸壁缺損模型制作：沿切口線切開皮膚，暴露胸大肌，順著胸大肌肌肉走向切開胸大肌，沿胸壁表面分離胸大肌與深面的胸小肌，充分暴露胸壁。在胸壁表面設(shè)計(jì)3×3cm大小的創(chuàng)面，創(chuàng)面內(nèi)含至少2根肋骨。沿標(biāo)記線切除胸壁，包括肋骨、肋間肌、壁層胸膜等，出血點(diǎn)燒灼止血，形成缺損面積3×3cm的胸壁缺損創(chuàng)面。

8、根據(jù)缺損面積，將rASCs膜片結(jié)合POC-PLA電紡絲補(bǔ)片復(fù)合體剪成約4×4cm大小，注意將補(bǔ)片四角修剪成鈍圓。將細(xì)胞膜片側(cè)朝向胸腔，用4-0縫線將補(bǔ)片固定于創(chuàng)面相鄰的胸骨后縫合補(bǔ)片與創(chuàng)緣，注意嚴(yán)密封閉胸腔，縫合過程中注意不要損傷肺臟。分層縫合傷口。檢查胸腔引流無液體和氣體流出后，拔除引流管。

9、傷口用酒精消毒，膠布固定紗布包扎。

10、術(shù)后6h開始給予飲食。

11、術(shù)后常規(guī)注射青霉素鈉，一天一次，一次40萬u，連續(xù)7天。

12、每組兔術(shù)后7天打開外敷料進(jìn)行觀察，胸壁切口拆線。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。