本發(fā)明涉及反式肉桂醛的應(yīng)用，特別涉及反式肉桂醛作為治療缺血性腦卒中藥物的用途。
背景技術(shù)：
缺血性腦病(ischemic brain disease)又稱缺血性中風(fēng)，在世界范圍內(nèi)，是成人死亡的第三大原因，致殘的首位原因。目前，靜脈溶栓療法被認為是唯一有效而可行的卒中治療措施，但是由于其嚴格的治療時間窗以及顱內(nèi)出血的風(fēng)險，從此項治療中獲益的患者十分有限。因此，為腦卒中治療尋找新的方案就顯得尤為重要。
有關(guān)腦缺血再灌注損傷發(fā)生機制的研究近年來進展迅速，研究普遍認為腦缺血時大腦實質(zhì)發(fā)生缺血缺氧,而缺血、缺氧造成的能量代謝障礙,興奮性神經(jīng)介質(zhì)釋放、鈣過量內(nèi)流、自由基損傷等惡性級聯(lián)反應(yīng),是導(dǎo)致腦缺血性損傷的中心環(huán)節(jié)。腦缺血損傷后,主要造成神經(jīng)元的損傷,同時又存在著血流對腦組織的再灌注,這些會使腦組織產(chǎn)生更加嚴重的損傷級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡或壞死。
其中氧化應(yīng)激不僅是缺血性腦病的重要病理生理反應(yīng)，同時又在缺血性腦病的各個階段起著不同程度的作用。因此抗氧化應(yīng)激損傷已成為治療缺血性腦血管病的重要途徑之一。
反式肉桂醛是樟科植物肉桂的干皮及樹皮經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油(肉桂油)中的主要成分，研究表明反式肉桂醛具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗凋亡、抗病毒、抗細菌等多種生物學(xué)作用，并且毒副作用低。但其對腦缺血神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性疾病等神經(jīng)損傷性疾病的保護作用目前尚未見報道，將其發(fā)展為缺血性腦卒中治療藥物具有極高的潛在價值與社會意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是通過對反式肉桂醛藥理作用的研究，提供反式肉桂醛作為治療缺血性腦卒中藥物的用途。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)發(fā)明目的：
反式肉桂醛作為治療缺血性腦卒中藥物的用途，所述反式肉桂醛的分子結(jié)構(gòu)式如式(1)所示
具體地，所述缺血性卒中為急性期或修復(fù)期的缺血性腦卒中。
具體地，所述反式肉桂醛的單次應(yīng)用量僅限于不引起血糖降低的劑量。
具體地，所述反式肉桂醛的在細胞中單次應(yīng)用量為0.1μmol/L～10μmol/L。
優(yōu)選地，所述反式肉桂醛在細胞中單次應(yīng)用量為1μmol/L～10μmol/L。
優(yōu)選地，所述反式肉桂醛的在細胞中單次應(yīng)用量為10μmol/L。
具體地，所述藥物的劑型為藥劑學(xué)上允許的口服劑型、注射劑型或粉針劑型。
本發(fā)明公開的反式肉桂醛作為治療缺血性腦卒中藥物的用途，具有如下有益效果：
本發(fā)明通過建立氧糖剝奪模型從而探究反式肉桂醛對氧糖剝奪后的PC-12細胞的保護作用及可能的機制，在氧糖剝奪再灌注之后，它增加了細胞存活率，降低了細胞內(nèi)的活性氧含量，反式肉桂醛的保護作用可能與抗氧化有關(guān)，并且反式肉桂醛可以穩(wěn)定線粒體膜電位，降低PC-12細胞的凋亡率，對缺血性損傷有保護作用。
具體實施方式：
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明
實施例1
反式肉桂醛作為治療缺血性腦卒中藥物的用途，其中，反式肉桂醛的分子結(jié)構(gòu)式如式(1)所示
缺血性卒中為急性期或修復(fù)期的缺血性腦卒中，反式肉桂醛在細胞中應(yīng)用采用藥劑學(xué)上允許的粉針劑型，單次應(yīng)用量為0.1μmol/L。
實施例2
反式肉桂醛作為治療缺血性腦卒中藥物的用途，其中，反式肉桂醛的分子結(jié)構(gòu)式如式(1)所示
缺血性卒中為急性期或修復(fù)期的缺血性腦卒中，反式肉桂醛在細胞中應(yīng)用采用藥劑學(xué)上允許的注射液劑型，單次應(yīng)用量為1μmol/L。
實施例3
反式肉桂醛作為治療缺血性腦卒中藥物的用途，其中，反式肉桂醛的分子結(jié)構(gòu)式如式(1)所示
缺血性卒中為急性期或修復(fù)期的缺血性腦卒中，反式肉桂醛在細胞中應(yīng)用采用藥劑學(xué)上允許的口服劑型，單次應(yīng)用量為10μmol/L。
反式肉桂醛的效果可以通過下面的細胞實驗得到驗證：
1實驗材料
培養(yǎng)的PC-12細胞，甲氮甲唑藍(MTT)購自廣州化學(xué)試劑廠；酶標(biāo)儀購自Thermo公司；ROS測定試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；MMP試劑盒：碧云天試劑公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒：上海貝博生物公司。NO抑制劑L-NAME、PI3K抑制劑LY294002(Sigma公司)激光共聚焦顯微鏡(TCS-SP，德國LEICA公司)。流式分析儀(美國BD FACSCalibur)。
2實驗方法
2.1實驗分為模型組，反式肉桂醛不同濃度組(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)，尼莫地平陽性對照組和正常組，制作細胞氧糖剝奪再灌注模型組：PC-12細胞于培養(yǎng)第3d換以無糖Earle’s平衡鹽溶液充分沖洗若干次，使葡萄糖終濃度小于1mol/L，加入EBSS液，并放入缺氧盒內(nèi)，持續(xù)緩慢通入含有N2的混合氣體4h，取出并吸棄平衡鹽緩沖液，換以完全培養(yǎng)基置入CO2培養(yǎng)箱孵育，模擬體內(nèi)缺血再灌注的過程，孵育24h；反式肉桂醛不同濃度組：換以無糖EBSS液建立缺糖缺氧模型，在再灌注時間點前分別加入高、中、低(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)三個濃度的反式肉桂醛，其他處理同氧糖剝奪再灌注模型組；尼莫地平陽性對照組：換以無糖EBSS液以建立氧糖剝奪模型，在再灌注時間點前加入尼莫地平，其他處理同氧糖剝奪再灌注模型組；正常組：對細胞不做任何處理。
2.2反式肉桂醛對缺糖缺氧再灌注損傷PC-12細胞的細胞活力影響：給予不同藥物處理的細胞經(jīng)氧糖剝奪恢復(fù)氧糖正常培養(yǎng)24h后，再加入5mg/mL MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。小心吸棄上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜DMSO混勻，選擇490nm波長測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。細胞活力(％)＝實驗組光吸收值/對照組光吸收值×100％。
2.3反式肉桂醛對缺糖缺氧再灌注損傷PC-12細胞保護作用的機制分析：PC-12細胞，每組8例，于培養(yǎng)第3d，制備各實驗組缺糖缺氧再灌注損傷模型，依檢測指標(biāo)要求，進行預(yù)處理。熒光分光光度計檢測ROS熒光強度，激光共聚焦顯微鏡(CLSM)測定PC12細胞內(nèi)線粒體膜電位水平(MMP)，用流式分析儀檢測細胞凋亡程度。
2.4NO抑制劑、PI3K抑制劑對反式肉桂醛保護作用的影響：細胞于氧糖剝奪后，加入反式肉桂醛及NO抑制劑(1mmol·L-1)、PI3K抑制劑(10μmol·L-1)，隨后進行再灌注處理。酶標(biāo)儀檢測各組細胞活力。
3結(jié)果
3.1反式肉桂醛對氧糖剝奪后PC-12細胞的存活率的影響
表1反式肉桂醛對氧糖剝奪后PC-12細胞的存活率的影響
(與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)
由表1結(jié)果可見，反式肉桂醛降低了氧糖剝奪再灌注后對PC-12細胞的損傷率，與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，說明反式肉桂醛對其有保護作用。
3.2反式肉桂醛對氧糖剝奪再灌注損傷PC-12細胞MMP的影響
表2反式肉桂醛對氧糖剝奪再灌注損傷PC-12細胞MMP的影響
(與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01,*P＜0.05；mean±S.E.M，n＝6)
檢測到的線粒體膜電位(MMP)越大，紅綠熒光比值越小，細胞損傷的越嚴重，由表4結(jié)果可見，與模型組比較，反式肉桂醛可以穩(wěn)定線粒體膜電位(MMP)，與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05。
3.3反式肉桂醛對氧糖剝奪再灌注損傷PC-12細胞凋亡的影響
表3反式肉桂醛對氧糖剝奪再灌注損傷PC-12細胞凋亡的影響
(與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)
通過流式檢測到氧糖剝奪后PC-12細胞的凋亡越低說明細胞活性越強，由表3結(jié)果可知，與模型組相比，反式肉桂醛組提高了抗細胞凋亡能力，與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01。
3.4反式肉桂醛對氧糖剝奪再灌注損PC-12細胞總活性氧(ROS)影響
表4反式肉桂醛對氧糖剝奪再灌注損傷PC-12細胞總活性氧(ROS)的影響
(與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)
檢測氧糖剝奪后PC-12細胞的活性氧，活性氧含量越大，細胞損傷越大，由表4的實驗結(jié)果可見，與模型組相比，反式肉桂醛組可以降低PC-12細胞總活性氧(ROS)的含量，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著反式肉桂醛濃度的升高，對PC-12細胞總活性氧(ROS)含量降低得越多，與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01。
3.5NO抑制劑對反式肉桂醛保護作用的影響
表5NO抑制劑對反式肉桂醛保護作用的影響
(與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)
3.6PI3K抑制劑對反式肉桂醛保護作用的影響
表6PI3K抑制劑對反式肉桂醛保護作用的影響
(與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01；mean±S.E.M，n＝6)
由表5和表6結(jié)果可見，反式肉桂醛加用NO抑制劑及PI3K抑制劑不能降低氧糖剝奪再灌注后對PC-12細胞的損傷率，與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01，說明反式肉桂醛發(fā)揮保護作用的機制可能與NO和PI3K有關(guān)。
上述所有實驗結(jié)果都證明反式肉桂醛對氧糖剝奪后的PC-12細胞具有保護作用，其保護機制與抗氧化有關(guān)。
以上所述的僅是本發(fā)明的一些實施方式。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。