本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及EGCG功能化的殼多糖衍生物、其載和厚樸酚納米顆粒及制備方法。

背景技術(shù)：

納米藥物因具有靶向性、緩釋性、低毒性等特殊性質(zhì)而成為近些年的研究熱點。殼多糖，大量存在于甲殼類動物外殼中，其部分或全部脫乙酰基產(chǎn)物殼聚糖具有大量的陽離子，具有良好的生物相容性和生物降解性，基于殼多糖脫乙?；a(chǎn)物的納米粒在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域都得到了實際應(yīng)用。脫乙酰殼多糖載藥納米粒體現(xiàn)出了較好的增溶或緩釋效果，但是，現(xiàn)有載藥納米?；旧鲜侵苯硬捎脷ぞ厶?脫乙酰殼多糖)作為載體，并未對殼多糖進行結(jié)構(gòu)修飾，導(dǎo)致無法提升載藥體系中被負(fù)載分子的生物活性。因此基于殼多糖的進一步修飾，使修飾產(chǎn)物具有殼多糖易納米化性質(zhì)的同時具有增強藥物療效的作用，具有重要的意義。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從中國綠茶中提取的一種成份，它是綠茶主要的活性和水溶性成份，是兒茶素中含量最高的組分，占綠茶毛重的9％-13％，由于具有特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，EGCG具有非常強的抗氧化活性，在抗癌和心血管疾病方面擔(dān)當(dāng)了重要的角色，其具有明顯的抗肺癌和肝癌作用并且不損傷正常體細(xì)胞。

Fei Lei等制備了一種殼聚糖-EGCG的共價結(jié)合物(見Journal of Applied Polumer Science,2014,131,39732)，直接采用脫乙酰的殼多糖與EGCG反應(yīng)共價結(jié)合，其存在的不足是脫乙酰殼多糖的氨基并未被完整保留，大部分的氨基都接枝了一些EGCG，這會嚴(yán)重影響殼多糖-EGCG的納米化性能，難以形成納米顆粒，無法用于納米載藥體系。

和厚樸酚(Honokiol)是從中藥厚樸中分離的木脂素類成分。和厚樸酚具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化、及抗腫瘤活性，但由于水溶性極差，在體內(nèi)的生物利用度低，因而需要加大用量且長期服用，這極大的限制了其臨床應(yīng)用。CN 104095817 A公開了一種直接用脫乙酰殼多糖負(fù)載厚樸酚及和厚樸酚的納米粒，該納米粒提高了和厚樸酚溶解性及溶出度，但其生物活性并未得到提升。

基于上述技術(shù)現(xiàn)狀，若能開發(fā)出易于納米化的EGCG修飾的殼多糖衍生物，并基于該易于納米化的衍生物開發(fā)出具有緩釋性能且能有效提高和厚樸酚生物活性的納米顆粒，對生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒎e極的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供EGCG功能化的殼多糖衍生物、EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒及制備方法，以提高EGCG修飾的殼多糖衍生物的納米成型性能，并有效提高和厚樸酚的生物活性。

本發(fā)明提供的EGCG功能化的殼多糖衍生物，結(jié)構(gòu)式如下：

上述結(jié)構(gòu)式中，EGCG含量為10％～60％，脫乙酰度為50％～98％，氨基含量為50％～98％。

本發(fā)明提供的EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒，該納米顆粒由上述EGCG功能化的殼多糖衍生物與和厚樸酚組成，和厚樸酚與EGCG功能化的殼多糖衍生物通過電荷作用形成納米顆粒，和厚樸酚包裹在納米顆粒內(nèi)部。

上述納米顆粒中，和厚樸酚含量為10～500μg/mg，即每毫克納米顆粒中含有和厚樸酚10～500微克。

上述納米顆粒的粒徑為20～300nm。

上述納米顆粒的分散性指數(shù)為0.091～0.253。

本發(fā)明還提供了上述EGCG功能化的殼多糖衍生物的制備方法，步驟如下：

(1)將殼多糖溶解在鹽酸中形成殼多糖濃度為2～20mg/mL的殼多糖鹽酸溶液，將表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)溶解在水中形成濃度為2～15mg/mL的表沒食子兒茶素沒食子酸酯水溶液；

(2)將殼多糖鹽酸溶液100重量份加入容器中，然后加入5～30重量份溶解有氧化保護劑的氧化劑，于20～50℃下攪拌至少10min，再加入表沒食子兒茶素沒食子酸酯溶液15～80份，攪拌30～120min，將所得反應(yīng)液透析并冷凍干燥得到中間產(chǎn)物；

(3)將步驟(2)所得中間產(chǎn)物溶解在40wt％～60wt％氫氧化鈉溶液中，在100～180℃，0.5～1MPa蒸煮8～16h，然后瀝干，將所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物。

上述EGCG功能化的殼多糖衍生物的制備方法中，所述鹽酸的濃度為0.5wt％～10wt％。

上述EGCG功能化的殼多糖衍生物的制備方法中，所述氧化劑為H₂O₂或者二甲基亞砜(DMSO)，上述氧化保護劑為抗壞血酸，通常，溶解有氧化保護劑的氧化劑的制備方法為：將1～20重量份的氧化保護劑溶解在1～40重量份的氧化劑中。

本發(fā)明還提供了一種EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的制備方法，步驟如下：

(1)將殼多糖溶解在鹽酸中形成殼多糖濃度為2～20mg/mL的殼多糖鹽酸溶液，將表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)溶解在水中形成濃度為2～15mg/mL的表沒食子兒茶素沒食子酸酯水溶液，將和厚樸酚溶解在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30％～80％的乙醇-水溶液中形和厚樸酚濃度為2～20mg/mL溶液；

(2)將殼多糖鹽酸溶液100重量份加入容器中，然后加入5～30重量份溶解有氧化保護劑的氧化劑，于20～50℃下攪拌至少10min，再加入表沒食子兒茶素沒食子酸酯溶液15～80份，攪拌30～120min，將所得反應(yīng)液透析并冷凍干燥得到中間產(chǎn)物；

(3)將步驟(2)所得中間產(chǎn)物溶解在40wt％～60wt％氫氧化鈉溶液中，在100～180℃，0.5～1MPa蒸煮8～16h，然后瀝干，將所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物；

(4)將步驟(3)所得EGCG功能化的殼多糖衍生物溶解在乙酸溶液中形成EGCG功能化的殼多糖衍生物為2～10mg/mL的EGCG功能化的殼多糖衍生物乙酸溶液，向10～50重量份EGCG功能化的殼多糖衍生物乙酸溶液中加入和厚樸酚溶液10～50重量份，調(diào)節(jié)pH值為2～6.5，攪拌10～40min，滴加5～20重量份濃度為1～5mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，攪拌30～120min，將所得懸浮液離心，棄掉上清液后加入凍干保護劑，冷凍干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒。

上述EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的制備方法中，所述凍干保護劑為甘露醇、山梨醇、乳酸或者明膠，通常，凍干保護劑的加入量應(yīng)使離心棄掉上清液后的物料與凍干保護劑的體積比達到5:3～20:1。

上述EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的制備方法中，離心操作的條件為12000～16000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10～60min。

上述EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的制備方法中，所述乙酸溶液的濃度為0.5wt％～5wt％，所述鹽酸的濃度為0.5wt％～10wt％。

上述EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的制備方法中，所述氧化劑為H₂O₂或者二甲基亞砜(DMSO)，上述氧化保護劑為抗壞血酸，通常，溶解有氧化保護劑的氧化劑的制備方法為：將1～20重量份的氧化保護劑溶解在1～40重量份的氧化劑中。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明提供了一種新型結(jié)構(gòu)的EGCG功能化的殼多糖衍生物及其制備方法，由于該方法先用EGCG與殼多糖反應(yīng)，再對產(chǎn)物進行脫乙?；?，從而制備的EGCG功能化的殼多糖衍生物中保留了脫乙酰殼多糖中的氨基，其中氨基含量高達50％～98％，高氨基含量有利于其形成納米顆粒，因而該衍生物具有易于納米化的特點。

2.試驗表明，本發(fā)明提供的EGCG功能化的殼多糖衍生物對人體正常肝、腎、肺體細(xì)胞無毒性，生物相容性好。

3.試驗表明，本發(fā)明提供的EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒具有明顯的緩釋性能，和厚樸酚的生物活性得到了有效提高，尤其是和厚樸酚的抗肝癌和肺癌活性被顯著增強。

4.本發(fā)明提供的EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的粒徑分布均一，分散性指數(shù)可達0.091～0.253，有利于納米顆粒的質(zhì)量控制。

附圖說明

圖1是實施例3制備的EGCG功能化的殼多糖衍生物的FT-IR圖；

圖2是實施例3制備的EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的TEM圖；

圖3是實施例5中EGCG功能化的殼多糖衍生物對LO2，MRC-5，HK-2細(xì)胞存活率的影響圖；

圖4是實施例5中經(jīng)過空白對照組和2mg/mL的衍生物組處理后的LO2，MRC-5，HK-2細(xì)胞生長情況的顯微鏡照片；

圖5實施例6中和厚樸酚以及實施例3制備的EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒中和厚樸酚的釋放曲線；

圖6是實施例7中和厚樸酚及實施例3制備的納米顆粒對人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞存活率的影響圖；

圖7是實施例7中經(jīng)過空白對照組、20μg/mL的和厚樸酚用藥組以及20μg/mL實施例3制備的納米顆粒用藥組處理后的人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞生長情況的顯微鏡照片。

具體實施方式

以下通過實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明所述EGCG功能化的殼多糖衍生物、其載和厚樸酚納米顆粒及制備方法作進一步說明。

實施例1

本實施例中，提供EGCG功能化的殼多糖衍生物以及EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的制備方法，步驟如下：

(1)將殼多糖溶解在0.5wt％的鹽酸中形成殼多糖濃度為2mg/mL的殼多糖鹽酸溶液，將表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)溶解在水中形成濃度為2mg/mL的EGCG水溶液，將和厚樸酚溶解在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇-水溶液中形和厚樸酚濃度為2mg/mL溶液。

(2)將殼多糖鹽酸溶液100重量份加入容器中，然后加入5重量份溶解有抗壞血酸的H₂O₂(將1重量份抗壞血酸溶解在8重量份H₂O₂中)，于20℃下磁力攪拌10min，再加入EGCG溶液15份，磁力攪拌30min，將所得反應(yīng)液透析2次并冷凍干燥得到中間產(chǎn)物。

(3)將步驟(2)所得中間產(chǎn)物溶解在40wt％氫氧化鈉溶液中，在100℃，0.5MPa蒸煮8h，然后瀝干，將所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物，該衍生物的結(jié)構(gòu)式如下：

該結(jié)構(gòu)式中，EGCG含量為12％，脫乙酰度為80％，氨基含量為80％。

(4)將步驟(3)所得EGCG功能化的殼多糖衍生物溶解在0.5wt％的乙酸溶液中形成EGCG功能化的殼多糖衍生物為2mg/mL的EGCG功能化的殼多糖衍生物乙酸溶液，向10重量份EGCG功能化的殼多糖衍生物乙酸溶液中加入和厚樸酚溶液10重量份，調(diào)節(jié)pH值為2，攪拌10min，滴加5重量份濃度為1mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，攪拌30min，將所得懸浮液離心，棄掉上清液后加入凍干保護劑甘露醇，離心棄掉上清液后的樣品與甘露醇的體積比為20:1，冷凍干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒。

本實施例制備的EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的平均粒徑約為300nm，納米顆粒的分散性指數(shù)為0.253，該納米顆粒中和厚樸酚的含量為140.5μg/mg，其包封率為68.3±3.2％。

實施例2

本實施例中，提供EGCG功能化的殼多糖衍生物以及EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的制備方法，步驟如下：

(1)將殼多糖溶解在5wt％的鹽酸中形成殼多糖濃度為8mg/mL的殼多糖鹽酸溶液，將EGCG溶解在水中形成濃度為6mg/mL的EGCG水溶液，將和厚樸酚溶解在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30％的乙醇-水溶液中形和厚樸酚濃度為6mg/mL溶液。

(2)將殼多糖鹽酸溶液100重量份加入容器中，然后加入10重量份溶解有抗壞血酸的DMSO(將1重量份抗壞血酸溶解在15重量份DMSO中)，于30℃下磁力攪拌60min，再加入EGCG溶液30份，磁力攪拌60min，將所得反應(yīng)液透析5次并冷凍干燥得到中間產(chǎn)物。

(3)將步驟(2)所得中間產(chǎn)物溶解在50wt％氫氧化鈉溶液中，在130℃，0.7MPa蒸煮10h，然后瀝干，將所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物，該衍生物的結(jié)構(gòu)式如下：

該結(jié)構(gòu)式中，EGCG含量為23％，脫乙酰度為90％，氨基含量為90％。

(4)將步驟(3)所得EGCG功能化的殼多糖衍生物溶解在3wt％的乙酸溶液中形成EGCG功能化的殼多糖衍生物為6mg/mL的EGCG功能化的殼多糖衍生物乙酸溶液，向20重量份EGCG功能化的殼多糖衍生物乙酸溶液中加入和厚樸酚溶液10重量份，調(diào)節(jié)pH值為4，攪拌20min，滴加10重量份濃度為3mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，攪拌60min，將所得懸浮液在13000rpm下離心20min，棄掉上清液后加入凍干保護劑甘露醇，離心棄掉上清液后的樣品與甘露醇的體積比為5:3，冷凍干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒。

本實施例制備的EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的平均粒徑約為90nm，納米顆粒的分散性指數(shù)為0.205，該納米顆粒中和厚樸酚的含量為130.5μg/mg，其包封率為75.6±5.5％。

實施例3

本實施例中，提供EGCG功能化的殼多糖衍生物以及EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的制備方法，步驟如下：

(1)將殼多糖溶解在10wt％的鹽酸中形成殼多糖濃度為15mg/mL的殼多糖鹽酸溶液，將EGCG溶解在水中形成濃度為10mg/mL的EGCG水溶液，將和厚樸酚溶解在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇-水溶液中形和厚樸酚濃度為12mg/mL溶液。

(2)將殼多糖鹽酸溶液100重量份加入容器中，然后加入20重量份溶解有抗壞血酸的H₂O₂(將10重量份抗壞血酸溶解在30重量份H₂O₂中)，于40℃下磁力攪拌50min，再加入EGCG溶液60份，磁力攪拌90min，將所得反應(yīng)液透析8次并冷凍干燥得到中間產(chǎn)物。

(3)將步驟(2)所得中間產(chǎn)物溶解在55wt％氫氧化鈉溶液中，在160℃，0.9MPa蒸煮13h，然后瀝干，將所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物，該衍生物的FT-IR圖如圖1所示，該衍生物的結(jié)構(gòu)式如下：

該結(jié)構(gòu)式中，EGCG含量為40％，脫乙酰度為95％，氨基含量為95％。

(4)將步驟(3)所得EGCG功能化的殼多糖衍生物溶解在5wt％的乙酸溶液中形成EGCG功能化的殼多糖衍生物為10mg/mL的EGCG功能化的殼多糖衍生物乙酸溶液，向40重量份EGCG功能化的殼多糖衍生物乙酸溶液中加入和厚樸酚溶液30重量份，調(diào)節(jié)pH值為4.5，攪拌30min，滴加15重量份濃度為5mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，攪拌90min，將所得懸浮液在15000rpm下離心40min，棄掉上清液后加入凍干保護劑甘露醇，離心棄掉上清液后的樣品與甘露醇的體積比為10:1，冷凍干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒。

本實施例制備的EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的平均粒徑約為60nm，納米顆粒的分散性指數(shù)為0.091，該納米顆粒的TEM照片如圖2所示，該納米顆粒中和厚樸酚的含量為190.5μg/mg，其包封率為88.3±5.1％。

實施例4

本實施例中，提供EGCG功能化的殼多糖衍生物以及EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的制備方法，步驟如下：

(1)將殼多糖溶解在10wt％的鹽酸中形成殼多糖濃度為20mg/mL的殼多糖鹽酸溶液，將EGCG溶解在水中形成濃度為15mg/mL的EGCG水溶液，將和厚樸酚溶解在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇-水溶液中形和厚樸酚濃度為20mg/mL溶液。

(2)將殼多糖鹽酸溶液100重量份加入容器中，然后加入30重量份溶解有抗壞血酸的H₂O₂(將1重量份抗壞血酸溶解在40重量份H₂O₂中)，于50℃下磁力攪拌60min，再加入EGCG溶液80份，磁力攪拌90min，將所得反應(yīng)液透析10次并冷凍干燥得到中間產(chǎn)物。

(3)將步驟(2)所得中間產(chǎn)物溶解在60wt％氫氧化鈉溶液中，在180℃，1MPa蒸煮16h，然后瀝干，將所得固相水洗中洗出液呈中性，干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物，該衍生物的結(jié)構(gòu)式如下：

該結(jié)構(gòu)式中，EGCG含量為55％，脫乙酰度為96％，氨基含量為96％。

(4)將步驟(3)所得EGCG功能化的殼多糖衍生物溶解在5wt％的乙酸溶液中形成EGCG功能化的殼多糖衍生物為10mg/mL的EGCG功能化的殼多糖衍生物乙酸溶液，向50重量份EGCG功能化的殼多糖衍生物乙酸溶液中加入和厚樸酚溶液10重量份，調(diào)節(jié)pH值為6.5，攪拌40min，滴加20重量份濃度為3mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，攪拌120min，將所得懸浮液在16000rpm下離心60min，棄掉上清液后加入凍干保護劑甘露醇，離心棄掉上清液后的樣品與甘露醇的體積比為20:1，冷凍干燥即得EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒。

本實施例制備的EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒的平均粒徑約為130nm，納米顆粒的分散性指數(shù)為0.195，該納米顆粒中和厚樸酚的含量為110.5μg/mg，其包封率為56.2±4.2％。

實施例5

本實施例中，EGCG功能化的殼多糖衍生物對正常人體肝、腎、肺體細(xì)胞的毒性。

將實施例3制備的EGCG功能化的殼多糖衍生物用DMSO分散，并用DMEM培養(yǎng)液稀釋至一定濃度形成衍生物溶液。分別取對數(shù)生長期LO2，MRC-5，HK-2細(xì)胞株，制備密度約為4×10⁴/L的細(xì)胞懸液，以每孔體積100μL接種于96孔培養(yǎng)板上，在CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁以后，加入前述衍生物溶液，使EGCG功能化的殼多糖衍生物的終濃度為0mg/mL(空白對照組)，0.5、1、2mg/mL(衍生物組)，各孔中DMSO含量均小于0.5％，每個濃度設(shè)6個平行孔，在CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，按照每孔50μL的量加入加入2mg/mL的MTT，在CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μLDMSO液，充分振蕩，使藍紫色沉淀充分溶解，在30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定490nm波長處的光吸收值，計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(％)＝(A-A₀)×100％，A₀為空白對照組的吸光度值，A為衍生物組的吸光度值，結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，EGCG功能化的殼多糖衍生物對LO2，MRC-5，HK-2細(xì)胞均無生長抑制作用。經(jīng)過空白對照組和2mg/mL的衍生物組處理后的LO2，MRC-5，HK-2細(xì)胞生長情況的顯微鏡照片如圖4所示，由圖4可知，EGCG功能化的殼多糖衍生物對LO2，MRC-5，HK-2細(xì)胞均無生長抑制作用。上述內(nèi)容說明本發(fā)明提供的EGCG功能化的殼多糖衍生物具有良好的生物相容性。

實施例6

分別稱取5mg和厚樸酚及實施例3制備的載有5mg和厚樸酚的納米顆粒，將它們分別分散于5mLpH值為6.8的溶出介質(zhì)(根據(jù)中國藥典配制)中，然后轉(zhuǎn)移到截留分子量為12000～14000的透析袋中，將透析袋置于50mL溶出介質(zhì)中，在37℃下攪拌，在第0.5,1,2,3,4,8,12,16,20,24小時從50mL溶出介質(zhì)中取出2mL溶液，測量其紫外吸光度值并計算和厚樸酚的濃度，繪制和厚樸酚釋放曲線，結(jié)果如圖5所示，由圖5可知，單一和厚樸酚具有很低的溶出速率，而制備成納米顆粒之后，和厚樸酚溶出度大大改善，同時納米顆粒顯示出明顯的和厚樸酚緩釋作用。

實施例7

本實施例中，測試EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒肝癌和肺癌細(xì)胞增殖抑制活性。

將和厚樸酚及實施例3制備的EGCG功能化的殼多糖衍生物載和厚樸酚納米顆粒分散于DMSO中，配制成一定濃度的儲備液。取對數(shù)生長期人肺癌A549細(xì)胞株和人肝癌HepG2細(xì)胞株，加入25g/L胰蛋白酶消化，吹打制成單個細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整約4×10⁴/L，以每孔體積100μL接種于96孔培養(yǎng)板上，置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，向各孔分別加入不同濃度的和厚樸酚及實施例3制備的納米顆粒溶液，使和厚樸酚及負(fù)載和實施例3制備的納米顆粒的終濃度分別為0μg/mL(空白對照組)，5、10、15、20、30、40μg/mL(和厚樸酚用藥組、納米顆粒用藥組)，每個濃度設(shè)6個平行孔，培養(yǎng)48h后，按照每孔50μL的量加入2mg/mL的MTT，置于CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO，充分振蕩，使藍紫色沉淀充分溶解，在30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定490nm波長處的吸光度值。不同濃度的和厚樸酚及實施例3制備的納米顆粒對人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制率＝(對照組吸光度值-用藥組吸光度值)/對照組吸光度值×100％，結(jié)果分別如圖6(A)和(B)所示，由圖6可知，與和厚樸酚相比，實施例3制備的納米顆粒對人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞具有更高的癌細(xì)胞生長抑制率。經(jīng)過空白對照組、20μg/mL的和厚樸酚用藥組以及20μg/mL實施例3制備的納米顆粒用藥組處理后的人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞生長情況的顯微鏡照片如圖7所示，由圖7可知，納米顆粒用藥組對人肺癌A549細(xì)胞的生長抑制作用明顯強于和厚樸酚，納米顆粒用藥組對人肝癌HepG2細(xì)胞的生長抑制作用也強于和厚樸酚。以上內(nèi)容說明將和厚樸酚負(fù)載在本發(fā)明所述EGCG功能化的殼多糖衍生物中形成納米顆粒，能夠提高和厚樸酚的生物活性。