本申請(qǐng)涉及一種促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的植入式電極材料，特別涉及一種能利用外源電刺激促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的高效神經(jīng)修復(fù)材料。

背景技術(shù)：

隨著生物材料學(xué)的發(fā)展，神經(jīng)電極的各種性能在不斷提高，但是其生物相容性問題嚴(yán)重地阻礙了植入式神經(jīng)電極的發(fā)展。為了增強(qiáng)植入式電極的組織相容性，減輕炎癥反應(yīng)，研究者研究了很多新的電極材料和電極界面的修飾技術(shù)。目前，尚未見報(bào)道采用氧化銥作為導(dǎo)電涂層，利用聚多巴胺作為黏性因子，將細(xì)胞粘附蛋白（laminin）固定到氧化銥表面制備神經(jīng)電極的方法。

氧化銥具有良好的抗腐蝕性能和生物相容性，它的可逆電化學(xué)反應(yīng)特性可提供高安全注入電荷量和低電極阻抗。多巴胺在堿性水溶液條件下能發(fā)生氧化自聚合反應(yīng)，在聚合物、金屬、陶瓷、玻璃等一系列固體材料表面能形成一層薄的、強(qiáng)黏性的聚多巴胺包覆層。聚多巴胺層富含的官能團(tuán)還能與含有氨基（-NH2）、巰基（-SH）等基團(tuán)的生物活性分子發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)或希夫堿反應(yīng)，有利于生物活性分子的固定，使材料表面進(jìn)一步功能化。尤其是將生物活性分子細(xì)胞粘附蛋白（laminin）連接在聚多巴胺層后，可使材料表面獲得促細(xì)胞粘附的能力，并且能誘導(dǎo)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的繁殖及神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)，可用于神經(jīng)組織修復(fù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于促神經(jīng)修復(fù)的植入式神經(jīng)電極的制備方法。 本發(fā)明的制備方法包括如下步驟：

（1）采用射頻磁控濺射在導(dǎo)電玻璃（ITO）基底材料上制備銥薄膜：將經(jīng)過(guò)丙酮，無(wú)水乙醇，去離子水分別超聲清洗8 ~ 20 min之后的導(dǎo)電玻璃放于射頻磁控濺射鍍膜儀的濺射腔室，將濺射腔室抽真空。通入氬氣，輸入功率使氬氣電離、起輝，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)膲毫?，開始銥薄膜的濺射。制備所得銥電極。

（2）利用循環(huán)伏安掃描活化得到氧化銥涂層：將步驟（1）中所得的銥電極清洗干燥后，放于電解槽的活化溶液中。通過(guò)參比電極與輔助電極以及待活化銥電極構(gòu)成的回路，施加極化?時(shí)間三角波形進(jìn)行活化處理?；罨眉礊檠趸炿姌O。

（3）通過(guò)多巴胺的氧化自聚合在氧化銥表面形成納米級(jí)聚多巴胺包覆層：將步驟（2）中所得的氧化銥電極清洗干燥后，浸泡于新鮮配制的多巴胺溶液中（pH = 8 ~ 9），室溫放置，經(jīng)過(guò)特定時(shí)間的氧化聚合反應(yīng)，得到的即為表面包覆聚多巴胺的氧化銥復(fù)合電極。

（4）配制1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）混合溶液：分別將EDC和NHS溶于pH為7 ~ 8的磷酸鹽緩沖溶液，室溫下混合均勻，得到10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液。

（5）配制細(xì)胞粘附蛋白（laminin）溶液：將laminin溶于上述步驟（5）中所配制的10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液，室溫下混合均勻，得到一定濃度的laminin溶液。

（6）連接細(xì)胞粘附蛋白于表面包覆聚多巴胺的氧化銥復(fù)合電極上：將所制備的氧化銥復(fù)合電極清洗干燥后，室溫浸泡于上述步驟（5）中所配制的細(xì)胞粘附蛋白（laminin）溶液中，經(jīng)過(guò)特定時(shí)間的二次功能化反應(yīng)，得到的即為具有生物活性的氧化銥復(fù)合電極。

本發(fā)明使具有良好的抗腐蝕性能和生物相容性的氧化銥材料和具有超強(qiáng)黏附性能的多巴胺，以及細(xì)胞粘附蛋白laminin復(fù)合在一起，形成了表面均勻且具有良好生物活性的復(fù)合電極，極大程度上實(shí)現(xiàn)了性能互補(bǔ)，成為了一種很有應(yīng)用價(jià)值的新型生物醫(yī)用材料，尤其可應(yīng)用于利用外源電刺激調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的定向分化。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例二的以導(dǎo)電玻璃為基底，以氧化銥為導(dǎo)電涂層，以聚多巴胺為介質(zhì)連接有濃度為20 μg/mL 的細(xì)胞粘附蛋白（laminin）的電極的場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡圖。

圖2分別為實(shí)施例一、例二、例三的以導(dǎo)電玻璃為基底，以氧化銥為導(dǎo)電涂層，以聚多巴胺為介質(zhì)連接有濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的細(xì)胞粘附蛋白（laminin）的氧化銥復(fù)合電極上神經(jīng)元細(xì)胞貼附圖片。由圖可見，隨著細(xì)胞粘附蛋白（laminin）的濃度的增大，細(xì)胞貼附的數(shù)目逐漸增多，且細(xì)胞狀態(tài)逐漸舒展。說(shuō)明所制備的電極材料的促細(xì)胞貼附性能較好。

圖3為實(shí)施例二的以導(dǎo)電玻璃為基底，以氧化銥為導(dǎo)電涂層，以聚多巴胺為介質(zhì)連接有濃度為20 μg/mL的細(xì)胞粘附蛋白（laminin）的氧化銥復(fù)合電極上神經(jīng)元細(xì)胞活死染色圖片。通過(guò)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及實(shí)驗(yàn)組材料的細(xì)胞毒性結(jié)果的對(duì)比，由圖可見，種植在所制備的電極材料的表面的細(xì)胞在分別增殖至24 h，48 h時(shí)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。說(shuō)明所制備的電極材料具有相當(dāng)好的生物相容性。

具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例一

將經(jīng)過(guò)丙酮，無(wú)水乙醇，去離子水分別超聲清洗15 min之后的導(dǎo)電玻璃放于射頻磁控濺射鍍膜儀的濺射腔室，將濺射腔室抽真空至3×10^-5 torr。通入氬氣，流量大小控制在50 sccm，調(diào)節(jié)壓力至3.2×10^-3 torr，開始濺射銥薄膜，濺射15 min。制備所得銥電極。將清洗干燥后的待活化的銥電極放于電解槽中0.1 M H₂SO₄活化溶液中。利用循環(huán)伏安掃描活化得到氧化銥涂層。稱取鹽酸多巴胺粉末20 mg于10 mL 10 mM的Tris溶液中配制，配制所得的濃度為2 mg/mL （pH = 8.5）。將所制備的氧化銥清洗干燥后，浸泡于新鮮配制的多巴胺溶液中，室溫放置18 h，得到的氧化銥電極所包覆的聚多巴胺膜厚度為30 nm。

將EDC和NHS溶于pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液，室溫下?lián)u晃后，得到10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液。將laminin溶于所配制的10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液，室溫下?lián)u晃后，得到10 μg/mL laminin溶液。將所制備的包覆有聚多巴胺薄膜的氧化銥復(fù)合電極清洗干燥后，室溫浸泡于新鮮配制的laminin溶液中18 h。用去離子水輕輕沖洗樣品1 min，隨后用氮?dú)獯蹈?。得到具有生物活性的?fù)合電極材料。

將神經(jīng)元細(xì)胞種植在所制備的復(fù)合電極材料表面，培養(yǎng)后觀察細(xì)胞貼附情況。

實(shí)施例二

將經(jīng)過(guò)丙酮，無(wú)水乙醇，去離子水分別超聲清洗10 min之后的導(dǎo)電玻璃放于射頻磁控濺射鍍膜儀的濺射腔室，將濺射腔室抽真空至3×10^-5 torr。通入氬氣，流量大小控制在40 sccm，調(diào)節(jié)壓力至3×10^-3 torr，開始濺射銥薄膜，濺射10 min。制備所得銥電極。將清洗干燥后的待活化的銥電極放于電解槽中0.1 M H₂SO₄活化溶液中。利用循環(huán)伏安掃描活化得到氧化銥涂層。稱取鹽酸多巴胺粉末20 mg于10 mL 10 mM的Tris溶液中配制，配制所得的濃度為2 mg/mL （pH = 8.5）。將所制備的氧化銥清洗干燥后，浸泡于新鮮配制的多巴胺溶液中，室溫放置24 h，得到的氧化銥電極所包覆的聚多巴胺膜厚度為37 nm。

將EDC和NHS溶于pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液，室溫下?lián)u晃后，得到10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液。將laminin溶于所配制的10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液，室溫下?lián)u晃后，得到20 μg/mL laminin溶液。將所制備的包覆有聚多巴胺薄膜的氧化銥復(fù)合電極清洗干燥后，室溫浸泡于新鮮配制的laminin溶液中24 h。用去離子水輕輕沖洗樣品2 min，隨后用氮?dú)獯蹈?。得到具有生物活性的?fù)合電極材料。

將神經(jīng)元細(xì)胞種植在所制備的復(fù)合電極材料表面，培養(yǎng)后觀察細(xì)胞貼附情況以及細(xì)胞毒性檢測(cè)。

實(shí)施例三

將經(jīng)過(guò)丙酮，無(wú)水乙醇，去離子水分別超聲清洗20 min之后的導(dǎo)電玻璃放于射頻磁控濺射鍍膜儀的濺射腔室，將濺射腔室抽真空至3×10^-5 torr。通入氬氣，流量大小控制在50 sccm，調(diào)節(jié)壓力至3.2×10^-3 torr，開始濺射銥薄膜，濺射20 min。制備所得銥電極。將清洗干燥后的待活化的銥電極放于電解槽中0.1 M H₂SO₄活化溶液中。利用循環(huán)伏安掃描活化得到氧化銥涂層。稱取鹽酸多巴胺粉末20 mg于10 mL 10 mM的Tris溶液中配制，配制所得的濃度為2 mg/mL （pH = 8.5）。將所制備的氧化銥清洗干燥后，浸泡于新鮮配制的多巴胺溶液中，室溫放置24 h，得到的氧化銥電極所包覆的聚多巴胺膜厚度為37 nm。

將EDC和NHS溶于pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液，室溫下?lián)u晃后，得到10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液。將laminin溶于所配制的10 mM的EDC和25 mM的NHS混合溶液，室溫下?lián)u晃后，得到40 μg/mL laminin溶液。將所制備的包覆有聚多巴胺薄膜的氧化銥復(fù)合電極清洗干燥后，室溫浸泡于新鮮配制的laminin溶液中24 h。用去離子水輕輕沖洗樣品3 min，隨后用氮?dú)獯蹈伞５玫骄哂猩锘钚缘膹?fù)合電極材料。

將神經(jīng)元細(xì)胞種植在所制備的復(fù)合電極材料表面，培養(yǎng)后觀察細(xì)胞貼附情況。