本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品及其制備方法。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型 ( Porcine circovirus type 2，PCV2)引起豬的一種新的傳染病，其主要特征為仔豬消瘦、生長發(fā)育不良、呼吸困難、腹瀉、母豬返情率增加、產(chǎn)木乃伊胎或弱仔、流產(chǎn)、內(nèi)臟器官及皮膚的廣泛病理變化，此外，本病還可導(dǎo)致豬群產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制，從而容易導(dǎo)致繼發(fā)感染或并發(fā)其他傳染。該病已給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是繼豬繁殖與呼吸綜合征之后新發(fā)現(xiàn)的又一重要疫病，疫苗免疫是預(yù)防PCV-2感染的主要措施之一。

脂質(zhì)體是一種具有同生物膜性質(zhì)類似的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)載體，而中藥脂質(zhì)體系指將中藥的有效成分包封于類脂質(zhì)雙分子層而制成的一種超微型球狀藥物載體制劑。該藥物載體具有靶向、緩釋給藥的優(yōu)勢，而且脂質(zhì)體對(duì)正常細(xì)胞和組織無損害和抑制作用，還可以表現(xiàn)出良好的細(xì)胞親和性和組織相容性。脂質(zhì)體在體內(nèi)易降解、無毒性和無免疫原性，其作為一種藥物載體不僅可以提高藥物治療指數(shù)，還能夠降低藥物毒性和減少藥物毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。

黃芪是一味重要的中藥，具有益衛(wèi)固表、利水清腫、托毒生肌、補(bǔ)中益氣等功效，民間常用于治療自汗、盜汗、血痹、浮腫、痛疽不潰或潰久不斂、內(nèi)份帶虛、脾虛泄瀉及一切氣衰血虛之癥。黃芪皂苷為黃芪的主要活性成分之一，黃芪皂苷不僅可以促進(jìn)淋巴增殖和抗體的增加，還能促進(jìn)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。

多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)。多糖類物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的能力

獸用生物制品質(zhì)量評(píng)定最重要的指標(biāo)之一就是批次間的穩(wěn)定性，然而在實(shí)際生產(chǎn)過程中難以控制半成品的批次間穩(wěn)定性，究其原因主要是在接種活體生物時(shí)的比例不確定，也就是說接種量不穩(wěn)定導(dǎo)致生產(chǎn)出半成品有較大的差異。本發(fā)明宗旨在于解決豬圓環(huán)病毒增殖過程中批次間差異大以及病毒含量過低的難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品及其制備方法的技術(shù)方案。

所述的一種豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品，其特征在于每1000mlPBS溶液含有以下組分：蟲草多糖5-10g、番茄紅素5-10g、人參皂苷Rh2 1-5g、脂質(zhì)體6-12g、蔗糖10-15g和甘露醇10-15g。

所述的一種豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品，其特征在于每1000mlPBS溶液含有以下組分：蟲草多糖6-8g、番茄紅素6-8g、人參皂苷Rh2 2-4g、脂質(zhì)體8-10g、蔗糖12-14g和甘露醇12-14g。

所述的一種豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品，其特征在于所述的脂質(zhì)體通過以下步驟制得：稱取大豆卵磷脂、膽固醇，用氯仿進(jìn)行溶解，并使其混合均勻，將該溶液在37℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，形成磷脂膜；向膜中加入pH值7.0的PBS溶液，水浴旋轉(zhuǎn)水化，所得混懸液進(jìn)行超聲處理，最后用勻漿機(jī)脫水后制備成脂質(zhì)體。

所述的一種豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品，其特征在于所述的PBS溶液通過以下步驟制得：取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.05-0.2g；將以上各成分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116℃，高壓滅菌30分鐘即得。

所述的一種豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備方法，其特征在于包括以下步驟：將所述重量的組分充分混合后，加入到1000ml pH 7 PBS溶液中振蕩水化，形成均一溶液；經(jīng)過0.22um的濾器進(jìn)行過濾后,先放置于-40℃低溫冰箱快速冷凍，室溫緩慢融化，反復(fù)進(jìn)行四次，再置于-40℃預(yù)凍4-8h；最后在真空凍干機(jī)中進(jìn)行干燥，即得到豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

所述的一種豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備方法，其特征在于所述的PBS溶液通過以下步驟制得：取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.05-0.2g；將以上各成分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116℃，高壓滅菌30分鐘即得。

本發(fā)明中蟲草多糖由武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)銷售，番茄紅素由湖南綠蔓生物科技有限公司生產(chǎn)銷售，人參皂苷Rh2由百靈威科技有限公司生產(chǎn)銷售。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明所制備的脂質(zhì)體稀釋液凍干制品可以降低半成品的批次間差異。

2、本發(fā)明所制備的脂質(zhì)體稀釋液凍干制品可以促進(jìn)豬圓環(huán)病毒2型的繁殖，提高病毒含量，增強(qiáng)疫苗免疫原性。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

實(shí)施例1：PBS溶液的制備

取氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g、含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.05-0.2g；將以上各成分混合后，溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116℃，高壓滅菌30分鐘即得。

實(shí)施例2：脂質(zhì)體的制備

稱取大豆卵磷脂6g、膽固醇2g，用500ml氯仿進(jìn)行溶解，并使其混合均勻，將該溶液在37℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，形成磷脂膜；向膜中加入200ml、pH值7.0的PBS溶液（實(shí)施例1制得），水浴旋轉(zhuǎn)水化，所得混懸液進(jìn)行超聲處理，最后用勻漿機(jī)脫水后制備成脂質(zhì)體。

實(shí)施例3：脂質(zhì)體的制備

稱取大豆卵磷脂4g、膽固醇4g，用500ml氯仿進(jìn)行溶解，并使其混合均勻，將該溶液在37℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，形成磷脂膜；向膜中加入200ml、pH值7.0的PBS溶液（實(shí)施例1制得），水浴旋轉(zhuǎn)水化，所得混懸液進(jìn)行超聲處理，最后用勻漿機(jī)脫水后制備成脂質(zhì)體。

實(shí)施例4：豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備

取蟲草多糖5g、番茄紅素5g、人參皂苷Rh2 1g、脂質(zhì)體（實(shí)施例2制得）6g、蔗糖10g和甘露醇10g；

將所述重量的組分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液（實(shí)施例1制得）中振蕩水化，形成均一溶液；經(jīng)過0.22um的濾器進(jìn)行過濾后,先放置于-40℃低溫冰箱快速冷凍，室溫緩慢融化，反復(fù)進(jìn)行四次，再置于-40℃預(yù)凍6h；最后在真空凍干機(jī)中進(jìn)行干燥，即得到豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

實(shí)施例5：豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備

取蟲草多糖8g、番茄紅素8g、人參皂苷Rh2 4g、脂質(zhì)體（實(shí)施例3制得）10g、蔗糖12g和甘露醇14g；

將所述重量的組分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液（實(shí)施例1制得）中振蕩水化，形成均一溶液；經(jīng)過0.22um的濾器進(jìn)行過濾后,先放置于-40℃低溫冰箱快速冷凍，室溫緩慢融化，反復(fù)進(jìn)行四次，再置于-40℃預(yù)凍4h；最后在真空凍干機(jī)中進(jìn)行干燥，即得到豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

實(shí)施例6：豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品的制備

取蟲草多糖10g、番茄紅素10g、人參皂苷Rh2 5g、脂質(zhì)體（實(shí)施例3制得）12g、蔗糖15g和甘露醇15g；

將所述重量的組分充分混合后，加入到1000ml pH 7的 PBS溶液（實(shí)施例1制得）中振蕩水化，形成均一溶液；經(jīng)過0.22um的濾器進(jìn)行過濾后,先放置于-40℃低溫冰箱快速冷凍，室溫緩慢融化，反復(fù)進(jìn)行四次，再置于-40℃預(yù)凍8h；最后在真空凍干機(jī)中進(jìn)行干燥，即得到豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品。

試驗(yàn)例1 本發(fā)明的應(yīng)用

1材料

1.1豬圓環(huán)病毒2型脂質(zhì)體稀釋液凍干制品

按本發(fā)明實(shí)施例4-6制得

1.2 豬圓環(huán)病毒2型，PK15-B1細(xì)胞

1.3 5-6周齡健康雌性清潔級(jí)Balb/c小鼠，PCV2 ELISA抗體檢測為陰性（≤1:50）

2 方法

2.1包封率的測定

分別取空白的凍干脂質(zhì)體和包封藥物的脂質(zhì)體凍干粉，在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行復(fù)溶，超速離心，取上清按一定比例稀釋后，測定其吸光度（參考獸藥典），平均每個(gè)樣品測3次，算其平均值。

2.2 形態(tài)觀察和粒徑

脂質(zhì)體稀釋液凍干粉在PBS緩沖液復(fù)溶后，在透射電鏡（×20000）下觀察

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及接毒

用含10%犢牛血清的MEM細(xì)胞營養(yǎng)液，置于37℃下含5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)20-26h，待細(xì)胞長成單層，棄去培養(yǎng)液，加入EDTA-胰酶消化液，作用數(shù)分鐘，按1:2-1:3比例傳代，均分4組，每組3瓶。將本發(fā)明實(shí)施例4-6制備的脂質(zhì)體稀釋液凍干制品置于PH7磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行復(fù)溶后，分別把14160723、14160724、14160725 三種不同批次的病毒各稀釋成1000 TCID₅₀/ml、1500 TCID₅₀/ml、2000 TCID₅₀/ml 3種不同的濃度。A組，采用本發(fā)明實(shí)施例4制備的脂質(zhì)體稀釋液對(duì)3種不同批次的PCV-2進(jìn)行稀釋接種；B組，采用本發(fā)明實(shí)施例5制備的脂質(zhì)體稀釋液對(duì)3種不同批次PCV-2進(jìn)行稀釋接種；C組，采用本發(fā)明實(shí)施例6制備的脂質(zhì)體稀釋液對(duì)3不同批次PCV-2進(jìn)行稀釋接種；D組，對(duì)照組，采用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)3不同批次PCV-2進(jìn)行稀釋接種，每組均按5%接種于細(xì)胞單層，置37℃吸附30min,加入含4%犢牛血清細(xì)胞維持液，于 37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，凍融2-3次后，進(jìn)行收毒。

2.4 TCID₅₀測定

將收獲的四組病毒液分別10倍系列稀釋，取10^-5、10^-6、10^-7三個(gè)稀釋度，，分別接種于PK15-B1細(xì)胞單層的細(xì)胞培養(yǎng)板中，按0.1ml/孔進(jìn)行接種，置于37℃，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用MEM維持液進(jìn)行換液，再繼續(xù)培養(yǎng)24h，用冷丙酮固定細(xì)胞，用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）測定每個(gè)稀釋度含有PCV2陽性細(xì)胞（呈綠色）的孔數(shù)，根據(jù)Karber法計(jì)算病毒TCID50。

2.5免疫原性測定

將收獲2.3提到的培養(yǎng)72h 14160723批次四組病毒液經(jīng)檢驗(yàn)合格，分別進(jìn)行滅活、乳化后制作成疫苗成品用來測定疫苗的免疫原性。將5-6周齡Balb/c小鼠分為4組，每組5只，第Ⅰ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例4制備的脂質(zhì)體稀釋液處理過的PCV-2滅活乳化后制成的疫苗進(jìn)行免疫；第Ⅱ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例5制備的脂質(zhì)體稀釋液處理過的PCV-2滅活乳化后制成的疫苗免疫；第Ⅲ組為采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例6制備的脂質(zhì)體稀釋液處理過的PCV-2滅活乳化后制成的疫苗免疫；第Ⅳ組，疫苗對(duì)照組，未經(jīng)脂質(zhì)體處理滅活后制成的疫苗免疫；先后免疫2次，每只0.2ml，兩周后按相同途徑和劑量進(jìn)行免疫。在首免5周后開始采血，分離血清，測定血清中的PCV-2 ELISA抗體。

3 結(jié)果

3.1包封率結(jié)果

按照公式：包封率（％）＝系統(tǒng)中包封的藥量（A1）/ 系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量（A2）×100％，結(jié)果見表1。

表1包封率測定結(jié)果

3.2 形態(tài)觀察和粒徑測定

脂質(zhì)體稀釋液凍干制品為單室脂質(zhì)體，粒度規(guī)則，為圓形，粒徑基本一致，結(jié)果見表2。

表2 形態(tài)觀察和粒徑測定結(jié)果

3.3 TCID₅₀測定結(jié)果

表3 TCID₅₀測定結(jié)果

3.4 血清抗體檢測結(jié)果

表4抗體測定結(jié)果

4 結(jié)論

綜上所述，本發(fā)明豬圓環(huán)病毒脂質(zhì)體稀釋液凍干制品具有良好的包封率，且粒度規(guī)則，粒徑基本一致；能夠很好的保證半成品接種量的穩(wěn)定性，降低豬圓環(huán)病毒滅活疫苗半成品間的批次差異；提高疫苗的血清抗體效價(jià)，增強(qiáng)疫苗的免疫原性。