本發(fā)明涉及中藥提取物領(lǐng)域，具體涉及一種重樓提取物及含有該提取物的藥物制劑，該提取物可以應(yīng)用于治療病毒性感冒。

背景技術(shù)：

重樓屬植物是一類極具藥用價(jià)值的植物，全世界共有24種，我國擁有19種，其中西南各省區(qū)種類和資源極為豐富。國內(nèi)外學(xué)者很重視對(duì)重樓的研究，其具有較強(qiáng)的生理活性及獨(dú)特的藥用價(jià)值。重樓在李時(shí)珍所著的《本草綱目》中以蚤休之名收載，為下品；并以重臺(tái)根等異名被歷代本草古籍記載?！吨腥A人民共和國藥典》收載該藥為云南重樓Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七葉一枝花P.polyphyllaSimth var.chinensis(F.)Hara的干燥根莖。又名蚤休、七葉一枝花、草河車。主產(chǎn)于長(zhǎng)江流域及南方各省。秋季采挖，除去須根，洗凈，曬干。切片生用。

重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于臃腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、涼風(fēng)抽搐等癥。現(xiàn)已從該屬植物中分離鑒定了50余種化合物，主要有C27甾體皂苷、C21孕甾烷苷、脂肪酸酯、甾醇及其苷、黃酮苷、Β2蛻皮激素及多糖。其中甾體皂苷44種，占總化合物的80％以上，甾體皂苷元為螺甾烷醇類、異螺甾烷醇類、味甾烷醇類以及變形螺甾類，均有很強(qiáng)的生理和藥理活性?，F(xiàn)代藥理研究重樓有止血、祛痰和抑菌、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗早孕殺滅精子、抗細(xì)胞毒等作用，臨床用于治療功能性子宮出血、神經(jīng)性皮炎、外科炎癥以及腫瘤等，都有顯著的療效。在我國，重樓是著名的中成藥云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧膠囊等的主要組成藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種重樓提取物，其制備方法和液相分析方法，含有該提取物的藥物制劑及利用該提取物制備治療病毒性感冒的藥物的用途。

本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種重樓提取物，該提取物由以下方法制備：

(a)將干燥的重樓根莖用55％乙醇溶液熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液；(b)將步驟(a)所得乙醇提取濃縮液用水稀釋，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(c)正丁醇萃取物用水溶解，過濾，用大孔樹脂富集活性成分，先用10％乙醇沖洗8個(gè)柱體積除去大極性成分，再用70％乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮即得。

進(jìn)一步地，步驟(c)中所述大孔樹脂為AB-8型大孔樹脂。

為了能夠通過建立HPLC指紋圖譜的方法控制不同批次制備的提取物的批間差異，所述提取物的液相分析方法為：

色譜柱：Agilent Zorbax Extent-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.5％磷酸溶液；

梯度洗脫程序：0.01～5min，A 10％→15％；5～10min，A 15％→48％；10～25min，A 48％→78％；25～30min，A 78％→10％；

流動(dòng)相流速：1.0mL·min^-1；

檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：10μL。

藥物制劑，含有治療有效量的所述提取物和藥學(xué)上可接受的載體。

所述的提取物在制備治療病毒性感冒的藥物中的應(yīng)用。

所述的藥物制劑在制備治療病毒性感冒的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提取物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物制劑的形式使用。

所述藥物制劑含有治療有效量的本發(fā)明重樓提取物，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì)人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。

所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物制劑以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明提取物可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過對(duì)干燥的重樓根莖進(jìn)行提取、除雜、富集處理，能得到具有治療病毒性感冒的提取物；本發(fā)明提供的液相分析方法可以用于建立該提取物的指紋圖譜，用于控制不同批次制備的提取物的批間差異。

附圖說明

圖1為重樓提取物HPLC液相圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

實(shí)施例1：提取物制備

藥材來源：重樓購自安徽亳州中藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地云南。

主要試劑：食品級(jí)乙醇購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；醫(yī)藥級(jí)AB-8大孔樹脂購自天津波鴻樹脂有限公司；乙腈為HPLC級(jí)，購于TEDIA；85％磷酸為HPLC級(jí)，購于TEDIA；色譜用純凈水為哇哈哈純凈水。

制備方法：將8kg干燥的重樓根莖用55％乙醇溶液熱回流提取(25L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液(2L)；將所得乙醇提取濃縮液用水稀釋至3L，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水飽和的正丁醇(3L×3次)萃取，減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物232g；(c)正丁醇萃取物用1.5L水溶解，醫(yī)用脫脂棉過濾，用AB-8大孔樹脂(2kg，柱體積1.5L)富集活性成分，先用10％乙醇沖洗8個(gè)柱體積(12L)除去大極性成分，再用70％乙醇洗脫12個(gè)柱體積(18L)，收集70％洗脫液，減壓濃縮，即得重樓提取物105g。

實(shí)施例2：液相色譜分析

供試品溶液配制：取實(shí)施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中，加30mL 10％乙腈水溶液超聲溶解，冷卻至室溫后，繼續(xù)加10％乙腈水溶液定容。

分析方法：

高效液相色譜儀：Agilent 1260，二元泵；

色譜柱：Agilent Zorbax Extent-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.5％磷酸溶液；

梯度洗脫程序：0.01～5min，A 10％→15％；5～10min，A 15％→48％；10～25min，A 48％→78％；25～30min，A 78％→10％；

流動(dòng)相流速：1.0mL·min^-1；

檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：10μL。

用制備的10批次的重樓提取物進(jìn)行分析，進(jìn)行色譜峰匹配，結(jié)果1～12號(hào)峰在10批樣品色譜圖中均出現(xiàn)。因此標(biāo)定12個(gè)峰為共有色譜峰，據(jù)此建立該提取物的HPLC質(zhì)量控制圖譜，結(jié)果見圖1。該10批次的重樓提取物藥理活性相似。

實(shí)施例3：提取物藥理試驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)材料

1、細(xì)胞株及病毒：狗腎傳代細(xì)胞(madin darby canine kidney，MDCK)、甲型流感病毒(濟(jì)防90-15)、乙型流感病毒(濟(jì)防97-13)、流感病毒鼠肺適應(yīng)株P(guān)R8均購自中國預(yù)防醫(yī)科院病毒研究所，病毒經(jīng)雞胚傳代后-70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2、樣品與試劑：重樓提取物制備方法見實(shí)施例1。陽性對(duì)照藥利巴韋林片，0.1g/片，國藥準(zhǔn)字H20033538，江西匯仁藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1411025。DMEM液體培養(yǎng)基，批號(hào)：701998，GIBCO公司；細(xì)胞培養(yǎng)液，含10％胎牛血清的DMEM液體培養(yǎng)基。維持液，除不含胎牛血清外，其他均同細(xì)胞培養(yǎng)液。洗液為含有2％雙抗硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素的MEM培養(yǎng)液。

3、動(dòng)物：清潔級(jí)昆明種小鼠120只，體質(zhì)量16-20g，雌雄各半，由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(新)2013-0002。

4、儀器：BHC-1300IIA/B3型生物安全柜，蘇凈集團(tuán)安泰公司；HH.CP-01型CO2培養(yǎng)箱，上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司；XDS-1B倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠；MDF-382E型超低溫冰箱，日本三洋電器；UPH-II-5型純水儀，成都超純科技有限公司。

二、方法與結(jié)果

1、體外抗病毒實(shí)驗(yàn)

(1)測(cè)定對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性

取重樓提取物用維持液配成5mg/mL的原液，利巴韋林配成4mg/mL的原液再用維持液稀釋成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256共8個(gè)濃度，加到接種MDCK細(xì)胞并已長(zhǎng)成單層的96孔培養(yǎng)板中，100μL/孔，每稀釋度4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。將培養(yǎng)板置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，觀察4d，確定細(xì)胞不出現(xiàn)明顯退變的最低稀釋倍數(shù)為最大無毒濃度TC₀，并按Reed-Muench法計(jì)算50％毒性濃度TC₅₀。見表1。

表1重樓提取物細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果

(2)樣品對(duì)病毒致細(xì)胞病變(CPE)的影響

取接種MDCK細(xì)胞并已長(zhǎng)成單層的培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，甲型流感病毒和乙型流感病毒分別接種100倍半數(shù)組織感染濃度(TCID₅₀)的病毒液100μL，置35℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中吸附1h后，吸棄病毒液，用洗液洗細(xì)胞表面2次，設(shè)14個(gè)組，分別為細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、利巴韋林取62.5μg/mL及以下5個(gè)2倍稀釋度(31.3、15.6、7.8、3.9、2.0μg/mL)共6個(gè)濃度給藥組、重樓提取物TC₀(312.5μg/mL)及以下5個(gè)2倍稀釋度(156.3、78.1、39.1、19.5、9.8μg/mL)共6個(gè)濃度的給藥組，4孔/組。利巴韋林和重樓提取物各6個(gè)給藥組分別加入不同稀釋度的藥液，細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組加維持液，100μL/孔。培養(yǎng)板置35℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)病毒對(duì)照組細(xì)胞病變達(dá)4級(jí)時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC₅₀，選擇指數(shù)SI＝TC₅₀/IC₅₀，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，重樓提取物樣品對(duì)甲型流感病毒的IC₅₀平均為74.6μg/mL，SI為16.8，對(duì)乙型流感病毒的IC₅₀平均為98.6μg/mL，SI為12.7。見表2。

表2重樓提取物對(duì)病毒致細(xì)胞病變的影響

2、體內(nèi)抗病毒實(shí)驗(yàn)

(1)對(duì)小鼠流感病毒性肺炎模型的保護(hù)作用

取小鼠60只，體質(zhì)量16-18g，按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分為模型組、利巴韋林(60mg/kg)組和重樓提取物100、200、400mg/kg 3個(gè)劑量(根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定)的給藥組，重樓提取物組和利巴韋林組按上述劑量灌胃給藥，模型組灌胃等量的蒸餾水，每天2次，連續(xù)6d，對(duì)照組灌胃等量的蒸餾水。于第3天給藥后，各組小鼠用乙醚輕度麻醉，以2LD₅₀濃度的流感病毒鼠肺適應(yīng)株P(guān)R8滴鼻感染，0.05mL/只。記錄感染后各組小鼠的死亡情況，計(jì)算死亡率、死亡保護(hù)率及平均存活天數(shù)、生命延長(zhǎng)率。結(jié)果，重樓提取物200、400mg/kg劑量組對(duì)流感病毒性肺炎小鼠有明顯的保護(hù)作用(P<0.05)。見表3，與模型組比較，^△P<0.05，^△△P<0.01。

表3對(duì)小鼠流感病毒性肺炎模型的保護(hù)作用(n＝12)

(2)對(duì)流感病毒性肺炎小鼠肺指數(shù)的抑制作用

取小鼠60只，體質(zhì)量18-20g，按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、利巴韋林(60mg/kg)組和重樓提取物100、200、400mg/kg 3個(gè)劑量的給藥組，重樓提取物組和利巴韋林組按上述劑量灌胃給藥，模型組灌胃等量的蒸餾水，每天2次，連續(xù)6d，對(duì)照組灌胃等量的蒸餾水。于第3天給藥后，除對(duì)照組外，各組小鼠用乙醚輕度麻醉，以5LD₅₀濃度的PR8滴鼻感染，每只0.05mL。第7天稱取小鼠體質(zhì)量后解剖，摘取全肺稱重，計(jì)算肺指數(shù)值及抑制率。結(jié)果顯示，重樓提取物400mg/kg劑量組對(duì)流感病毒性肺炎小鼠肺指數(shù)有明顯的抑制作用。見表4，與對(duì)照組比較，^**P<0.01；與模型組比較，^△P<0.05，^△△P<0.01。

表4對(duì)流感病毒性肺炎小鼠肺指數(shù)的抑制作用(n＝10)

實(shí)施例4：片劑的制備

按實(shí)施例1方法制得提取物，按其與賦形劑重量比為1:10的比例加入賦形劑，制粒壓片。

實(shí)施例5：口服液的制備

按實(shí)施例1方法先制得提取物，按常規(guī)口服液制法制成口服液。

實(shí)施例6：膠囊劑或顆粒劑的制備

按實(shí)施例1方法先制得提取物，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。

實(shí)施例7：注射液的制備

按實(shí)施例1方法制得提取物，加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。

實(shí)施例8：無菌粉針的制備

按實(shí)施例1方法先制得提取物，溶于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。