本發(fā)明屬植物提取物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種甜葉菊酚類提取物及其在降血糖制品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甜葉菊(Stevia rebaudiana)屬菊科多年生草本植物，原產(chǎn)于南美巴拉圭和巴西，是目前已知甜度較高的糖料植物之一，已成為繼蔗糖、甜菜糖之后的第三種天然糖源。目前，中國(guó)是世界最大的甜菊糖苷生產(chǎn)及供應(yīng)國(guó)，占全球總量的80％以上。甜葉菊中除甜菊糖苷外還含有黃酮、綠原酸等多種成分，且這些成分具有重要的生物活性，如抗菌、降血壓、降血脂等，在其發(fā)源地作為甜茶、藥茶飲用已有一百多年的歷史。
甜菊糖苷生產(chǎn)現(xiàn)多采用熱水浸提，提取液經(jīng)絮凝、樹脂純化和干燥制得。甜葉菊酚類物質(zhì)在甜菊糖苷生產(chǎn)過程中作為雜質(zhì)存在，需在后續(xù)工藝中將其去除，不僅造成資源的浪費(fèi)，還對(duì)環(huán)境造成了極大的污染。本專利中，申請(qǐng)人對(duì)甜葉菊酚類提取物的降血糖活性進(jìn)行了考察，該甜葉菊酚類提取物能夠改善小鼠耐糖量異常(IGT)，改善小鼠糖調(diào)節(jié)受損作用顯著，并能夠很好的提高小鼠對(duì)胰島素敏感性，具有良好的降血糖功效，為其在制備降血糖制品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，亦為甜葉菊綜合應(yīng)用開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為提高甜葉菊綜合利用價(jià)值，本發(fā)明提供了一種甜葉菊酚類提取物，本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供甜葉菊酚類提取物的降血糖活性及其在制備降血糖制品中的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種甜葉菊酚類提取物，所述提取物是以黃酮和綠原酸為主要成分的多酚類化合物。
本發(fā)明所述甜葉菊酚類提取物中包括黃酮含量為5.0-85.0wt％，綠原酸含量為10.0-90.0wt％。
本發(fā)明所述甜葉菊酚類提取物中黃酮成分為槲皮素、槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-[4”'-O-反式-咖啡?；?α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]、芹菜素、芹菜素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷中的任意一種或幾種，苷元為槲皮素、山奈酚、芹菜素和木犀草素中的任意一種或幾種。
本發(fā)明該甜葉菊酚類提取物中綠原酸成分為咖啡酸、3-咖啡酰基奎尼酸、4-咖啡?；崴帷?-咖啡?；崴?、3,4-二咖啡酰基奎尼酸、3,5-二咖啡酰基奎尼酸、4,5-二咖啡酰基 奎尼酸、5-阿魏?；崴嶂械娜我庖环N或幾種。
本發(fā)明所述甜葉菊酚類提取物制備方法如下：
(1)取甜菊葉原料，加水提取，提取液過陶瓷膜；
提取用水量為原料的10-30倍，提取溫度為15-85℃，傳統(tǒng)間歇提取三次或采用三級(jí)連續(xù)逆流提取，陶瓷膜選用膜管為5-100nm膜管；
(2)陶瓷膜透過液上大孔吸附樹脂1吸附，堿洗，乙醇解析，解析液濃縮回收乙醇后分別過脫鹽、脫色、精脫樹脂，干燥得甜菊糖苷產(chǎn)品；
選用的吸附樹脂為P20、ADS-4、69M、T28、DM30、001×6、001×8、201-H、SQ338、330中的任意一種或幾種；堿洗液為NaOH、KOH、氨水中的一種或任意組合，質(zhì)量濃度為0.2-2％的或pH 8.5-9.5，堿洗液用量為1-3BV，速度為1-3BV/h；
(3)下注水和調(diào)酸后堿洗液混合，上吸附樹脂2，水洗，乙醇水溶液解析，濃縮回收溶劑，干燥得甜葉菊酚類提取物；
所用吸附樹脂2為L(zhǎng)X-200B、LX-2007、SD-300、LSA-21、HZ841中的一種或任意組合；下注水和調(diào)酸后堿洗液上柱流速1-3BV/h，調(diào)酸用鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、檸檬酸中的一種或幾種，酸性溶液為摩爾濃度為0.1-18mol/L，調(diào)pH至0.5-6.5；水洗用量1-3BV，水洗流速1-3BV/h，解析用乙醇濃度為10-85％，用量為1-5BV，洗脫流速為1-3BV/h；濃縮采用薄膜濃縮、減壓濃縮中的一種或組合；干燥采用噴霧干燥、脫味鍋真空干燥、回轉(zhuǎn)罐真空干燥、烘箱干燥中的一種或組合。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述的甜葉菊酚類提取物在制備降血糖的藥物或食品中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的一種甜葉菊酚類提取物在制備改善耐糖量異常的藥物或食品中的應(yīng)用
本發(fā)明所述的一種甜葉菊酚類提取物在制備改善糖調(diào)節(jié)受損的藥物或食品中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的一種甜葉菊酚類提取物在制備提高胰島素敏感性的藥物或食品中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述藥物或食品是以甜葉菊酚類提取物為活性成分制備而成的口服劑、注射劑或外用制劑。
本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路是：本發(fā)明從甜葉菊中提取得到的甜葉菊酚類提取物在制備降血糖制品中的應(yīng)用，該甜葉菊酚類提取物包括黃酮含量為5.0-85.0wt％，綠原酸含量為10.0-90.0wt％。本發(fā)明證實(shí)，該甜葉菊酚類提取物能夠改善小鼠IGT，改善小鼠糖調(diào)節(jié)受損作用顯著，并能夠很好的提高小鼠對(duì)胰島素敏感性，具有良好的降血糖功效。
本發(fā)明甜葉菊酚類提取物中黃酮和綠原酸的檢測(cè)方法參考專利201510339325.7中提供的黃酮和綠原酸的檢測(cè)方法。
采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果是：本發(fā)明提供的甜葉菊酚類提取物具有原料來(lái)源豐富、易于產(chǎn)業(yè)化、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，作為降血糖制品其開發(fā)及應(yīng)用的前景廣闊。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了甜葉菊酚類提取物對(duì)糖調(diào)節(jié)受損小鼠的糖耐量的影響。
實(shí)驗(yàn)方案
1)脂肪乳的制備
豬油40g，膽固醇2.5g，豬膽鹽0.5g，吐溫-80 7mL，加水定容至100mL，配成灌胃脂肪乳。
2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及基本操作
采用高脂高糖飲食建立小鼠糖調(diào)節(jié)受損模型(IGR)，雄性ICR小鼠平均分成7組，每組12只，如表1所示。
表1各組小鼠基本操作
表1各組小鼠基本操作
3)試驗(yàn)期基本操作
試驗(yàn)第4，8，12周末，各組小鼠禁食不禁水12h，測(cè)定空腹血糖、血清胰島素、糖耐量。
4)空腹血糖測(cè)定及糖耐量測(cè)定
小鼠禁食(不禁水)12h，割尾靜脈采血，測(cè)定小鼠血糖。各組小鼠經(jīng)口給予2.5g/kg b.w.葡萄糖溶液，分別在0、30、60、120min測(cè)定各組小鼠血糖，并計(jì)算糖耐量曲線下面積。
5)甜葉菊酚類提取物的制備
稱取100kg甜菊葉，加1.5m3水，65℃提取，重復(fù)提取三次，合并提取液，過5nm陶瓷膜。透過液上201-H吸附樹脂，1BV水洗，水洗流速1BV/h，1.5BV 0.4％NaOH水溶液洗，流速1BV/h，乙醇解析，解析液濃縮回收乙醇后分別過脫鹽、脫色、精脫樹脂，干燥得甜菊糖苷 產(chǎn)品。
堿洗液用1mol/L的鹽酸水溶液調(diào)pH至3.5，和下注水混合，上吸附樹脂SD-300，上柱流速1.5BV/h。2BV水洗，水洗流速1.5BV/h。2BV 50％乙醇水溶液解析，解析流速1BV/h。減壓濃縮，回收乙醇溶劑，脫味鍋真空干燥得甜葉菊多酚提取物2.0kg。檢測(cè)甜葉菊酚類提取物總黃酮和總綠原酸含量分別為20％和75％，黃酮類成分為槲皮素、槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷、芹菜素、芹菜素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷；綠原酸成分為咖啡酸、3-咖啡酰基奎尼酸、4-咖啡酰基奎尼酸、5-咖啡?；崴?、3,4-二咖啡酰基奎尼酸、3,5-二咖啡?；崴?、4,5-二咖啡?；崴?、5-阿魏?；崴?。
6)統(tǒng)計(jì)分析
每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，其中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，結(jié)果用平均值±SD表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。
7)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
7.1)干預(yù)3周后糖耐量
由表2可知，脂肪乳聯(lián)合果糖飲食3周后模型對(duì)照組小鼠出現(xiàn)IGT，口服葡萄糖耐量(OGTT)曲線下面積(AUC)增加，與正常對(duì)照組比較有顯著差異。陽(yáng)性對(duì)照組二甲雙胍能明顯的改善小鼠IGT，AUC與正常對(duì)照組比較有極顯著差異。甜葉菊多酚提取物高劑量和低劑量組使30min血糖值降低，改善小鼠IGT，AUC與正常對(duì)照組比較有顯著差異。茶多酚和銀杏黃酮對(duì)小鼠糖耐量沒有顯著影響，未能改善小鼠的IGR狀態(tài)。
表2干預(yù)3周后小鼠的糖耐量
表2干預(yù)3周后小鼠的糖耐量
注：NC，正常對(duì)照組；MC，模型對(duì)照組；PC，陽(yáng)性對(duì)照組；H，高劑量；L，低劑量。與MC比較，*P<0.05,**P<0.01。
7.2)干預(yù)6周后糖耐量
OGTT發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組經(jīng)過6周的脂肪乳聯(lián)合果糖誘導(dǎo)，其30min血糖值進(jìn)一步升高，與 正常對(duì)照組比較有極顯著差異，60min血糖值也高于正常對(duì)照組，AUC與正常對(duì)照組比較有極顯著差異，表明模型對(duì)照組IGR程度進(jìn)一步加重。二甲雙胍在灌胃6周后仍然保持較好的干預(yù)效果，顯著改善小鼠飲食誘導(dǎo)的IGR。各樣品灌胃6周后，其干預(yù)效果普遍降低。其中，甜葉菊多酚提取物高劑量組仍能夠使30min血糖值降低，改善小鼠IGT，AUC與正常對(duì)照組比較有顯著差異。
表3干預(yù)6周后小鼠的糖耐量
表3干預(yù)6周后小鼠的糖耐量
注：NC，正常對(duì)照組；MC，模型對(duì)照組；PC，陽(yáng)性對(duì)照組；H，高劑量；L，低劑量。與MC比較，*P<0.05,**P<0.01。
7.3)干預(yù)9周后糖耐量
表4干預(yù)9周后小鼠的糖耐量
表4干預(yù)9周后小鼠的糖耐量
注：NC，正常對(duì)照組；MC，模型對(duì)照組；PC，陽(yáng)性對(duì)照組；H，高劑量；L，低劑量。與MC比較，*P<0.05,**P<0.01。
對(duì)脂肪乳聯(lián)合果糖誘導(dǎo)的IGR小鼠進(jìn)行干預(yù)，9周后的糖耐量結(jié)果如表5所示。模型對(duì)照組在飲食誘導(dǎo)9周后表現(xiàn)出聯(lián)合糖耐量受損(CGI)，空腹血糖比正常對(duì)照組升高，有極顯著差異，其AUC與正常對(duì)照組比較存在極顯著差異。二甲雙胍使小鼠的空腹血糖降低，改善了IGT，說(shuō)明作為目前應(yīng)用廣泛的降糖藥對(duì)小鼠的IGR表現(xiàn)出持久有效的預(yù)防效果。甜葉菊多酚提取物高劑量和低劑量組、茶多酚、銀杏黃酮均能夠降低糖調(diào)節(jié)受損小鼠的初始空腹 血糖值，具有顯著性差異。其中，甜葉菊多酚提取物高劑量組能夠使AUC降低，改善小鼠IGT。
改善小鼠糖耐量異常。
比較灌胃3、6、9周后各配方提取物對(duì)小鼠IGR的干預(yù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甜葉菊多酚提取物對(duì)改善小鼠糖調(diào)節(jié)受損作用最為顯著。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供了甜葉菊酚類提取物對(duì)IGR小鼠胰島素耐量的影響。
實(shí)驗(yàn)方案
小鼠的飼喂、造模方法、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及基本操作同實(shí)施例1.
1)胰島素耐量測(cè)定
小鼠禁食(不禁水)5h，各組小鼠腹腔注射0.6IU/kg b.w.短效牛胰島素，分別在0、30、60、90、120min割尾靜脈采血測(cè)定血糖。
2)甜葉菊酚類提取物的制備
稱取100kg甜菊葉，加3.0m3水，60℃三級(jí)連續(xù)逆流提取，提取液過50nm陶瓷膜。透過液上T28吸附樹脂，1.5BV水洗，水洗流速1BV/h，1.5BV pH＝9.0的氨水溶液洗，流速1BV/h，乙醇解析，解析液濃縮回收乙醇后分別過脫鹽、脫色、精脫樹脂，干燥得甜菊糖苷產(chǎn)品。
堿洗液用18mol/L的硫酸溶液調(diào)pH至5.0，和下注水混合，上吸附樹脂HZ 841，上柱流速1.0BV/h。3BV水洗，水洗流速2.0BV/h。2BV 65％乙醇水溶液解析，解析流速1.5BV/h。減壓濃縮，回收乙醇溶劑，噴霧干燥得甜葉菊多酚提取物3.0kg。檢測(cè)甜葉菊酚類提取物總黃酮和總綠原酸含量分別為15％和60％，黃酮類成分為槲皮素、槲皮苷、芹菜素、芹菜素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷；綠原酸成分為咖啡酸、3-咖啡酰基奎尼酸、4-咖啡?；崴?、5-咖啡?；崴?、3,4-二咖啡?；崴?、3,5-二咖啡?；崴?、4,5-二咖啡?；崴帷?-阿魏?；崴?。
3)統(tǒng)計(jì)分析
每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，其中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，結(jié)果用平均值±SD表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。
4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
樣品對(duì)IGR小鼠干預(yù)11周后進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)(ITT)，結(jié)果見表5。模型對(duì)照組小鼠腹腔注射胰島素后血糖下降，50min時(shí)血糖達(dá)到最低點(diǎn)，隨后血糖開始回升，90min時(shí)血糖達(dá)到起始血糖的81.1％，起始血糖與90min血糖分別比正常對(duì)照組小鼠高12.5％和17.7％，有極顯著 差異。陽(yáng)性對(duì)照組起始血糖與90min血糖分別比模型對(duì)照組有所下降，具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各配方樣品干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)血糖均低于模型對(duì)照組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中，甜葉菊多酚提取物的作用效果最強(qiáng)，能夠很好的提高小鼠對(duì)胰島素敏感性。
表5干預(yù)11周后小鼠的胰島素耐量
表5干預(yù)11周后小鼠的胰島素耐量
注：NC，正常對(duì)照組；MC，模型對(duì)照組；PC，陽(yáng)性對(duì)照組；H，高劑量；L，低劑量。與MC比較，*P<0.05,**P<0.01。