本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種PF-127-miRNA-615agomir復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
臂叢神經(jīng)撕脫(Brachial Plexus Avulsion,BPA)是一種常見的致殘性外科創(chuàng)傷，尤其是全臂叢神經(jīng)根性撕脫，致殘率高、療效不佳、預(yù)后差。隨著家庭機動車輛和現(xiàn)代交通物流的不斷發(fā)展，臂叢損傷的發(fā)病率逐年增加，其最常見的病因為交通意外和新生兒難產(chǎn)所造成的牽拉性損傷。神經(jīng)根由中樞部分和外周部分組成，二者的交界部分稱為“過渡區(qū)”(transitional zone,TZ)。臂叢撕脫是神經(jīng)根與脊髓在TZ區(qū)發(fā)生的物理性斷離，不僅引起外周神經(jīng)斷裂，還導(dǎo)致相應(yīng)脊髓節(jié)段神經(jīng)元嚴(yán)重?fù)p傷和大量死亡，神經(jīng)軸突斷裂、突觸結(jié)構(gòu)破壞、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中斷等，造成受損神經(jīng)對應(yīng)皮節(jié)的感覺喪失及所支配上肢肌肉癱瘓。為了恢復(fù)神經(jīng)通路和運動功能，受損神經(jīng)元必須存活和再生軸突，并外向延伸穿過TZ瘢痕，重新進入外周神經(jīng)干并與所支配肌肉重建突觸聯(lián)系。雖然通過神經(jīng)外科再植術(shù)能使部分運動神經(jīng)元存活并獲得一定的軸突再生，但由于局部病理微環(huán)境的抑制作用，膠質(zhì)瘢痕形成，以及軸突再生能力極其有限等原因，神經(jīng)再生和運動功能恢復(fù)的效果并不令人滿意。因此，臂叢神經(jīng)根性撕脫治療的關(guān)鍵問題在于如何改善損傷局部的抑制性病理微環(huán)境，有效促進神經(jīng)軸突的再生修復(fù)與外向延伸，以恢復(fù)過渡區(qū)神經(jīng)聯(lián)系的延續(xù)性，重建突觸聯(lián)系，改善肢體的運動功能。
相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，髓磷脂相關(guān)抑制因子是脊髓損傷后局部微環(huán)境中的重要抑制因素。該類抑制因子由髓鞘和膠質(zhì)瘢痕合成釋放，主要包括軸突生長抑制因子(neurite outgrowth inhibitory A，NogoA)、髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)。這些髓磷脂相關(guān)抑制因子可與神經(jīng)細(xì)胞上的共受體成分LINGO-1(LRR and Ig domain-containing Nogo receptor interacting protein)結(jié)合而介導(dǎo)抑制效應(yīng)，抑制中樞神經(jīng)軸突生長和髓鞘形成。LINGO-1在腦和脊髓的神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞上選擇性表達，參與細(xì)胞膜上NgR1/p75/LLNGO-1或NgR1/Troy/LINGO-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的構(gòu)成。LINGO-1與抑制因子結(jié)合使信號復(fù)合物活化，通過RhoA激酶的作用將下游抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，從而阻礙神經(jīng)軸突的再生修復(fù)與髓鞘的形成。研究表明，拮抗LINGO-1對脊髓損傷后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)有明顯促進作用。同時，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，用慢病毒Lingo-1 RNAi干擾LINGO-1的表達，可影響移植性神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育分化，并能促進脊髓全橫斷大鼠的神經(jīng)再生和運動功能恢復(fù)。但關(guān)于其發(fā)揮作用的胞內(nèi)機制，目前尚未可知。
近年來，miRNA因其功能多樣化而在組織工程學(xué)領(lǐng)域中的備受關(guān)注。miRNA是通過調(diào)控靶基因而影響表觀遺傳的重要分子，主要通過種子序列(seed sequence)與靶mRNA 3’-端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)部分或完全互補結(jié)合而抑制基因表達或介導(dǎo)靶基因降解，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的廣泛基因調(diào)控。miRNA介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)涉及真核生物細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等各種發(fā)育和代謝過程。因此，我們推測，miRNA是否也參與LINGO-1基因表達的生物調(diào)控過程。通過生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測和功能分析，我們初步篩選出可能對LINGO-1基因具有潛在調(diào)控作用的miRNA，再經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后雙熒光素酶報告系統(tǒng)和western blotting驗證，證實miRNA-615對LINGO-1的表達有負(fù)調(diào)控作用。
由于miRNA動物實驗的體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，實驗周期長，對miRNA的穩(wěn)定性要求更高，而人工合成的miRNA-615的擬似物(miRNA-615 mimics)具有較好的分子穩(wěn)定性和miRNA活性，所以，需要選擇合適的miRNA-615擬似物；另一方面，如何準(zhǔn)確地將miRNA-615擬似物運輸?shù)綋p傷局部以有效地發(fā)揮其基因調(diào)控作用成為難題。
因此，亟待有可負(fù)載miRNA-615擬似物并能填充損傷裂隙的運載體，該運載體應(yīng)具備高效、無毒、較好的生物相容性、生物降解性等特點，同時還應(yīng)為神經(jīng)軸突外向延伸生長提供必要的條件支持。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種所述能負(fù)載miRNA-615 agomir、并能促進臂叢撕脫神經(jīng)再生修復(fù)的水凝膠包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物及其制備方法以及該復(fù)合物在制備治療臂叢神經(jīng)根性撕脫的藥物中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
提供PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物，所述復(fù)合物由以下組份制成：
Pluronic F-127水凝膠、去離子水和miRNA-615 agomir，所述miRNA-615 agomir包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
優(yōu)選的，Pluronic F-127水凝膠與去離子水的用量比為每100ml去離子水中加入20g～25g的Pluronic F-127水凝膠。
優(yōu)選的，miRNA-615 agomir在Pluronic F-127水凝膠與去離子水充分混合后得到的混合液中的濃度為18～23nmol/ml。
優(yōu)選的，miRNA-615 agomir是經(jīng)特殊化學(xué)修飾合成的miRNA-615擬似物，是由廣州銳博生物科技有限公司合成的。
本發(fā)明還提供上述PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：
(1)miRNA-615 agomir的合成；
(2)水凝膠原液的制備：
稱取一定量的水凝膠，將其與去離子水在無菌條件下配制成混懸液，將混懸液置于一定溫度條件下，使水凝膠充分溶解，然后過濾除菌，得水凝膠原液；
(3)水凝膠與miRNA-615 agomir混合液的制備：
在一定溫度條件下，將步驟(1)的miRNA-615 agomir與步驟(2)制備的水凝膠原液攪拌使其充分混合，得水凝膠與miRNA-615 agomir的混合液，備用；
(4)水凝膠包裹miRNA-615 agomir：
取步驟(3)制備的混合液加入至24孔板，使混合液平鋪孔底，然后放入培養(yǎng)箱在一定溫度下溫一段時間后，使孔底形成不透明薄膠狀物，即得PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物。
優(yōu)選的，所述步驟(1)，miRNA-615 agomir是由廣州銳博生物科技有限公司合成的。
優(yōu)選的，所述步驟(2)，水凝膠和去離子水在無菌條件下配制成質(zhì)量體積比濃度為0.20～0.25g/ml的混懸液，將混懸液置于0～4℃，使水凝膠充分溶解，然后采用0.20μm孔徑的濾膜除菌，得水凝膠原液。
優(yōu)選的，所述步驟(3)，在0～4℃條件下，以每毫升水凝膠原液中含20nmol miRNA-615 agomir的濃度攪拌使其充分混合，得水凝膠與miRNA-615 agomir的混合液。
優(yōu)選的，所述步驟(4)，取步驟(3)制備的混合液，以每孔200μL加至24孔板，使其平鋪孔底，然后放置于25℃～37℃培養(yǎng)箱溫育3～5min，取出后，孔底形成不透明薄膠狀物，即得PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物。
本發(fā)明還提供PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物在制備治療臂叢神經(jīng)根性撕脫的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是：
與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
(1)本發(fā)明提供的PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物，由于含有溫敏型水凝膠Pluronic F-127，不僅能夠負(fù)載miRNA-615 agomir，實現(xiàn)miRNA-615 agomir的精確遞送和局部緩釋，起到藥物遞送緩釋的作用，還兼具生物支架的性能，通過體內(nèi)膠化形成具有生物支架功能的三維孔隙結(jié)構(gòu)，為神經(jīng)軸突的生長提供三維空間和力學(xué)支撐，同時還可有效填補脊髓損傷裂隙，促進軸突的生長和外向延伸，起到在形態(tài)和功能上雙重修復(fù)的作用；
(2)本發(fā)明提供的PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物，由于含有miRNA-615擬似物miRNA-615 agomir，與一般的miRNA-615擬似物相比，miRNA-615 agomir有更高的穩(wěn)定性和miRNA活性，在生物體內(nèi)不易被降解，且更易穿透細(xì)胞膜和組織間隙而富集于靶細(xì)胞，并能通過全身或局部注射的方式等進行給藥，有效作用時間長，可操作性更強，特別適用于動物實驗觀察和分析。因此，含有miRNA-615 agomir的PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物能夠特異性抑制神經(jīng)細(xì)胞中LINGO-1基因和蛋白的表達，減少其與髓磷脂抑制因子的結(jié)合，促進神經(jīng)軸突的生長；
(3)本發(fā)明提供的PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物的制備方法，具有生產(chǎn)成本低、操作簡便、耗時短、實驗設(shè)備要求低，且能用于大規(guī)模生產(chǎn)的特點；
(4)本發(fā)明提供的PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物，既能利用Pluronic F-127水凝膠的分子運載系統(tǒng)實現(xiàn)miRNA-615 agomir的精確遞送和局部緩釋，通過抑制LINGO-1基因和蛋白的表達，減少其與髓磷脂抑制因子的結(jié)合，改善損傷局部的抑制性病理微環(huán)境，促進神經(jīng)軸突的再生修復(fù)；又能借助Pluronic F-127的智能溫敏性能，通過體內(nèi)膠化形成具有生物支架功能的三維孔隙結(jié)構(gòu)，為神經(jīng)軸突的生長提供三維空間和力學(xué)支撐，同時還可有效填補脊髓損傷裂隙，起到在形態(tài)和功能上雙重修復(fù)的作用。因此，該PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物可用于制備治療臂叢神經(jīng)根性撕脫的藥物，能夠有力促進臂叢神經(jīng)根性撕脫的神經(jīng)再生修復(fù)，為中樞和外周神經(jīng)損傷患者的治療和康復(fù)提供新的治療途徑。
具體實施方式
結(jié)合以下實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1：PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物的制備
PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物由Pluronic F-127水凝膠、去離子水和miRNA-615 agomir采用以下步驟制備而成：
(1)miRNA-615 agomir的合成：
本實施例中，miRNA-615 agomir是經(jīng)特殊化學(xué)修飾合成的miRNA-615擬似物，是由廣州銳博生物科技有限公司合成的；
miRNA-615的基本信息如表1所示：
表1 miRNA-615的基本信息
miRNA-615與LINGO-1的反應(yīng)機制：成熟miRNA主要通過與特定靶基因的3’-UTR結(jié)合而影響基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯效率和穩(wěn)定性。成熟miRNA-615通過其種子序列(seed sequence)─GGGGGUCCCC(表1單下劃線部分)與LINGO-1 mRNA的3’-UTR的部分序列(表1雙下劃線部分)特異性結(jié)合，介導(dǎo)基因沉默效應(yīng)阻遏LINGO-1 mRNA的翻譯過程，進而引起LINGO-1蛋白含量下降。LINGO-1表達減少，其與髓磷脂相關(guān)抑制因子的結(jié)合就減少，信號復(fù)合物的活化及神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞中抑制信號的轉(zhuǎn)入則相應(yīng)減弱，在一定程度上起到促進神經(jīng)軸突再生、髓鞘形成并進而改善運動功能恢復(fù)的效應(yīng)。
(2)水凝膠原液的制備：
超凈臺酒精擦拭消毒，將電子天平、稱量紙、稱量藥勺、50ml離心管等稱量物品放入并紫外照射消毒約30分鐘；于超凈臺內(nèi)稱取適量水凝膠，并在無菌條件下，將水凝膠與去離子水配置成質(zhì)量體積比濃度為0.20～0.25g/ml的混懸液，然后將混懸液置于0～4℃的水平搖床以60-70轉(zhuǎn)/分鐘的速度振搖過夜10-24小時，至水凝膠充分溶解后，取0.20μm孔徑的瓶蓋式過濾器覆蓋于50ml離心管管口，連接上50ml注射器，將上述混合液倒入注射器后，緩慢推出通過濾膜以過濾除菌，得水凝膠原液；
(3)水凝膠與miRNA-615 agomir混合液的制備：
將步驟(1)合成的miRNA-615 agomir與步驟(2)制備的水凝膠原液在0～4℃以每毫升水凝膠原液中含20nmol的miRNA-615 agomir的濃度混合，攪拌使其充分混合，得混合液；
(4)水凝膠包裹miRNA-615 agomir：
取步驟(3)制備的混合液，以每孔200μL加至24孔板，使其平鋪孔底，然后放置于25℃～37℃培養(yǎng)箱溫育3～5min，取出后，孔底形成不透明薄膠狀物，即得PF-127-miRNA-615 agomir復(fù)合物。
以上步驟的所有操作均在無菌條件下進行。
本實施例中，水凝膠原液一般在2～8℃的醫(yī)用冰箱或冷藏柜中儲存，miRNA-615 agomir儲存于-80℃的液氮或者其他環(huán)境保存。
實施例2：PF-127包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物修復(fù)臂叢神經(jīng)根性撕脫的應(yīng)用
1.臂叢神經(jīng)根性撕脫大鼠模型制備
成年雌性SD大鼠用10％水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉，在體視顯微鏡下，暴露右側(cè)C4-T2脊髓節(jié)段，行C4-C7椎板切除，分離出右側(cè)臂叢神經(jīng)的C5～C7脊神經(jīng)根，用精細(xì)玻璃掛鉤輕輕撕脫C5～C7神經(jīng)根，并切除與C5和C7神經(jīng)根相連的一段脊神經(jīng)，使神經(jīng)與脊髓間留下大概5mm的間隙，隨后將C6前根重置回原位，充分止血，逐層間斷縫合肌肉和皮膚。術(shù)后保暖，待動物蘇醒后送至清潔級動物飼養(yǎng)房進行常規(guī)護理。術(shù)后每只大鼠給予青霉素16萬單位(1ml/d)和硫酸慶大霉素25萬單位(0.5ml/d)肌內(nèi)注射預(yù)防感染，每日2次，連續(xù)注射3天。
2.水凝膠包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物局部注射
采用本發(fā)明實施例1制備所得水凝膠包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物，用微量注射泵吸取10ul所述水凝膠包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物，在臂叢神經(jīng)撕脫大鼠模型C6神經(jīng)根撕脫原位空隙緩慢注射。注射時注意謹(jǐn)防微泵針尖傷及周圍脊髓組織。注射完畢后，靜置大鼠約5分鐘，依次逐層縫合肌肉和皮膚，標(biāo)準(zhǔn)條件下常規(guī)飼養(yǎng)。
3.水凝膠包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物修復(fù)大鼠臂叢撕脫試驗
實驗組：采用本發(fā)明實施例1制備所得水凝膠包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物，37℃水浴溫育3-5min至形成不透明膠凍物，用微量注射泵吸取10ul所述水凝膠包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物，在臂叢神經(jīng)撕脫大鼠模型C6神經(jīng)根撕脫原位空隙緩慢注射。注射完畢后，靜置大鼠約5分鐘，依次逐層縫合肌肉和皮膚，標(biāo)準(zhǔn)條件下常規(guī)飼養(yǎng)。
對照組：給予同等劑量的PBS。
(1)免疫熒光染色檢測神經(jīng)絲蛋白NF-200的表達
各組動物模型10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉，用生理鹽水和4℃多聚甲醛進行左心室灌注，取C5-C7脊髓節(jié)段，4℃多聚甲醛后固定6-8小時，30％蔗糖溶液脫水，OCT包埋并切成20um厚的冰凍縱切片，Hoechst33342染核，于熒光顯微鏡下觀察。
(2)甲苯胺藍染色觀察髓鞘形成
10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，剪開胸腔行心臟灌流固定，取脊髓標(biāo)本用4％戊二醛溶液和1％鋨酸溶液進行再固定,逐級酒精丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切成0.5μm厚的半薄切片，甲苯胺藍染色,封片后鏡下觀察并比較有髓神經(jīng)軸突的數(shù)量及直徑大小。
(3)行為學(xué)測試
參照Bertelli JA等人提出的Terzis grooming test對臂叢撕脫模型大鼠進行右前肢的運動功能評估。在安靜環(huán)境中，用10ml注射器往大鼠頭頸部噴射約10ml左右的水以引出其前肢的理毛行為，觀察并依據(jù)該評定標(biāo)準(zhǔn)對其右前肢的運動功能進行等級評分。該評定標(biāo)準(zhǔn)分為0-5級：右前肢無反應(yīng)為0分，右前肢可彎曲并能到達耳部及耳后為5分。術(shù)前對動物檢查為5級，術(shù)后第二天對動物右上肢功能評定為功能喪失，評分0級，納入評分標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后第二周開始對不同處理組動物進行運動功能等級評分，每周一次，連續(xù)4周。測試結(jié)果(見表2)顯示，實驗組動物右前肢的運動功能評分明顯高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
表2 臂叢神經(jīng)根撕脫運動功能評分(x±s)
實驗組與對照組(單純脊髓損傷)相比，P＜0.05。
如表2所示，實驗組大鼠在2、3、4、5W的運動功能評分均明顯優(yōu)于對照組(P＜0.05)，提示水凝膠包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物能明顯促進脊髓損傷大鼠運動功能的恢復(fù)。
(4)熒光金逆行標(biāo)記
取材前3-4天，麻醉動物后暴露右側(cè)肌皮神經(jīng)，于肌皮神經(jīng)入肱二頭肌肌點近端5mm處進針，緩慢注射1.0ul熒光金。標(biāo)記后4天7％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛(加PBS磷酸鹽緩沖液稀釋)心臟灌注固定，取出C5-C7脊髓節(jié)段，放入30％蔗糖脫水48h后切成20um薄片。于熒光顯微鏡下觀察C5-C7脊髓內(nèi)熒光金標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)(見表3)，以觀察C6回植后神經(jīng)軸突的修復(fù)再生情況。
表3 熒光金標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞計數(shù)(x±s)
實驗組與對照組(單純脊髓損傷)相比，P＜0.05。
如表3所示，實驗組熒光金標(biāo)記的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組，有明顯差異(P<0.01)。由此可見，水凝膠包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物對神經(jīng)軸突的再生有明顯改善作用。
(5)運動終板檢測
取材固定后肱二頭肌切成14um厚的縱切片，0.2mg/L的α-環(huán)蛇毒素(α-Bungarotoxin,α-BTX)染色30min。于熒光顯微鏡下計數(shù)運動終板的數(shù)目，并利用Image J圖像軟件計算其面積大小(見表4)。
表4 運動終板檢測
實驗組與對照組(單純脊髓損傷)相比，P＜0.05。
如表4所示，實驗組大鼠肱二頭肌運動終板的數(shù)量明顯多于對照組(P＜0.05)，由此說明水凝膠包裹miRNA-615 agomir復(fù)合物對受損神經(jīng)的再生及與其所支配肌肉重建突觸聯(lián)系有保護作用。
最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。