本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及芹菜素在制備預(yù)防和治療腎臟纖維化的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：腎纖維化是所有腎臟疾病發(fā)展到終末期腎衰竭的共同變化，所有慢性腎臟疾病最終可發(fā)展為腎臟纖維化。其主要發(fā)病機(jī)制為：腎臟纖維化過(guò)程中，細(xì)胞變化會(huì)激活成纖維細(xì)胞及系膜細(xì)胞，促使T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)以及小管上皮細(xì)胞向系膜質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變(EMT)。多種浸潤(rùn)細(xì)胞和自身細(xì)胞相互影響，共同參與腎臟纖維化的形成過(guò)程。當(dāng)腎臟受損后，其組織會(huì)發(fā)生一系列修復(fù)反應(yīng)，產(chǎn)生大量ECM，而激活產(chǎn)生的ECM效應(yīng)細(xì)胞通常被是腎臟纖維化的核心。ECM持續(xù)性沉積通過(guò)形成纖維瘢痕，破壞正常腎組織，導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)塌陷、腎功能喪失。分子機(jī)制腎主要包括4個(gè)階段:①細(xì)胞的活化與損傷，由炎癥損傷所致的腎小管上皮細(xì)胞的活化及腎間質(zhì)中單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)；②生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化黏附因子及血管活性因子等促纖維化因子的釋放；③纖維化的形成，主要表現(xiàn)為基質(zhì)蛋白降解減少、合成增多，腎間質(zhì)出現(xiàn)沉積；④腎結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，此階段，腎小管周圍毛細(xì)血管出現(xiàn)堵塞，有效腎單位急劇減少，且腎小球過(guò)濾明顯降低。目前，臨床上主要通過(guò)控制加劇腎功能惡化的危險(xiǎn)因素的方法來(lái)治療腎臟纖維化。主要包括：1.TGF-β阻滯劑或拮抗劑：研究表明一種小型富含亮氨酸的蛋白多糖，Decorin(DCN)通過(guò)直接阻止TGF-β1生物活性來(lái)調(diào)整膠原的原纖維生成，顯著減少尿蛋白，緩解ECM沉積，有效抑制腎臟纖維化形成。2.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑與血管緊張素2受體阻滯劑：此類藥物可改善腎功能，減輕腎間質(zhì)纖維化。其機(jī)制可能與腎臟組織中TGF-β1信號(hào)蛋白Smad2/3活性受到抑制有關(guān)。3.酪氨酸激酶特異性受體阻滯劑：PDGF酪氨酸激酶受體阻滯劑AG1295能抑制PDGF酪氨酸激酶受體，減少成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量，降低纖連蛋白的表達(dá)，從而阻止腎臟纖維化。4.基因治療:目前，基因治療腎臟疾病主要采用反義技術(shù)，即連接特異性反義基因與表達(dá)載體，導(dǎo)入靶細(xì)胞后對(duì)反義RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而后者通過(guò)與其相應(yīng)mRNA形成雙鏈來(lái)抑制mRNA翻譯，從而發(fā)揮治療作用。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1反義寡脫氧核苷酸，導(dǎo)入腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，單側(cè)輸尿管阻塞的大鼠腎臟纖維化明顯改善?？死纤?KL)基因表達(dá)上調(diào)能減輕糖尿病腎肥大，保護(hù)腎臟功能，延緩纖維化進(jìn)程?；蛑委熌I臟纖維化前景開闊，但目前尚缺少有效的方法向人體腎臟進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。5.膠原合成抑制物，抑制賴氨酰氧化酶和脯氨酰4-羥化酶活性及膠原轉(zhuǎn)錄后的進(jìn)程能有效緩解腎臟纖維化。己酮可可堿、己可可堿、γ-干擾素等藥物也可降低纖連蛋白的合成及α-SMA表達(dá)，抑制膠原合成及腎纖維細(xì)胞的增殖，從而阻止腎臟發(fā)生纖維化。6.中藥治療：近年來(lái)，中藥治療慢性腎臟纖維化的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注，其中研究最多的為大黃、黃芪、丹參等藥。大黃素通過(guò)抑制腎臟固有細(xì)胞的異常變化及利尿作用來(lái)發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。丹參具有抗氧化、清除自由基的功效，可增加c-myc蛋白表達(dá)，抑制腎成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，改善腎間質(zhì)纖維化。黃芪甲苷通過(guò)使腎小管及間質(zhì)單核細(xì)胞趨惡化因子蛋白I表達(dá)下調(diào)來(lái)緩解腎缺血-再灌注損傷所致大鼠腎臟的長(zhǎng)期損害。7.終末期腎病可選擇血液、腹膜透析或移植，進(jìn)而延長(zhǎng)患者生命，但終未解決根本問(wèn)題?；颊哳A(yù)后改善并不顯著。因此，尋找能有效延緩腎功能不全進(jìn)展的藥物，有效防治腎臟纖維化成為腎內(nèi)科醫(yī)生面臨的一個(gè)重要難題，及早阻止甚至逆轉(zhuǎn)腎纖維化對(duì)防治終末期腎衰竭有重大意義。芹菜素是一種黃酮類化合物，又稱芹黃素、洋芹素，廣泛分布于溫?zé)釒У氖卟撕退?，尤以芹菜中含量為高，既往研究表明，芹菜素具有多種生物學(xué)作用，如降血壓、擴(kuò)張血管、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等。但芹菜素用于治療腎臟纖維化，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明的目的是提供一種芹菜素在制備預(yù)防和治療腎臟纖維化的藥物中的用途。該藥物用于纖維化前期的治療，改善腎臟纖維化進(jìn)展，且無(wú)明顯的不良反應(yīng)，安全、毒副作用小，特別適合纖維化前期患者。本發(fā)明的技術(shù)方案是：芹菜素在制備預(yù)防和治療腎臟纖維化的藥物中的用途。所述芹菜素通過(guò)激活TRPV4通道，增肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流。所述芹菜素通過(guò)TRPV4介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，激活A(yù)MPK/SITR1信號(hào)通路，抑制腎臟纖維化。所述藥物的用量為每公斤體重每天150-300mg。本發(fā)明所述芹菜素與藥用載體或賦形劑組成用于預(yù)防和治療腎臟纖維化的藥物組合物，其中芹菜素為預(yù)防和治療腎臟纖維化的有效劑量。本發(fā)明所述芹菜素(apigenin)的分子式為C15H10O5，其分子量為270.24，化學(xué)式為4',5,7-三羥基黃酮(5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one).其結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明具有以下有益效果：所以藥物的有效成分——芹菜素為植物來(lái)源的天然化合物，非人工合成，無(wú)明顯毒副作用、安全有效。該藥物能改善腎臟纖維化，特別適合腎臟纖維化患者和用于治療腎損害，效果尤其明顯。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明所述藥物用于預(yù)防、治療腎臟纖維化，能延緩腎臟纖維化進(jìn)程，且無(wú)明顯的不良反應(yīng)。附圖說(shuō)明圖1為腎臟HE染色，膳食芹菜素減輕大鼠腎臟腎小球硬化指數(shù)，其中，a，b，c和d分別為普食組，芹菜素組，DOCA(醋酸皮質(zhì)酮)組和DOCA加芹菜素組示意圖，e為統(tǒng)計(jì)圖；圖2為PAS糖原染色，芹菜素膳食減少腎臟膠原纖維，其中，a，b，c，d和e分別所示為普食組，芹菜素組，DOCA(醋酸皮質(zhì)酮)組和DOCA加芹菜素組；圖3為Masson染色，膳食芹菜素減少腎臟纖維化產(chǎn)生，其中，a，b，c，d和e分別所示為普食組，芹菜素組，DOCA(醋酸皮質(zhì)酮)組和DOCA加芹菜素組；圖4為膳食芹菜素改善DOCA所致腎臟形態(tài)增大，其中，a，b，c，d和e分別所示為普食組，芹菜素組，DOCA(醋酸皮質(zhì)酮)組和DOCA加芹菜素組；圖5為膳食芹菜素減少DOCA所致腎臟重量及腎臟/體重比值增大。a為腎臟重量，b為腎臟重量比體重；圖6為膳食芹菜素降低DOCA所致的尿蛋白增加，增加肌酐清除率，其中，a為肌酐清除率，b為尿微量白蛋白；圖7為免疫熒光染色，TRPV4可以定位于大鼠腎小球；圖8為PTI鈣熒光比率測(cè)定，芹菜素可以增加細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的，其中a為熒光比率示意圖，b為統(tǒng)計(jì)圖；圖9為膜片鉗單通道檢測(cè)，芹菜素激活HBZY-1腎小球系膜細(xì)胞上表達(dá)的特異性TRPV4通道，其中，a為電壓依賴示意圖，b為TRPV4通道電導(dǎo)圖；圖10為蛋白免疫印跡，醛固酮加高鹽刺激能使SIRT1和p-AMPK表達(dá)下降，芹菜素能逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，其中，a為蛋白免疫印跡示意圖，b為SIRT1統(tǒng)計(jì)圖，c為p-AMPK統(tǒng)計(jì)圖；圖11為蛋白免疫印跡，芹菜素使SIRT1和p-AMPK表達(dá)增加，而EDTA可以抑制芹菜素這一效應(yīng)，說(shuō)明芹菜素該效應(yīng)主要是通過(guò)TRPV4介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流起作用，其中，a為蛋白免疫印跡示意圖，b為p-AMPK統(tǒng)計(jì)圖，c為SIRT1統(tǒng)計(jì)圖；圖12為蛋白免疫印跡，芹菜素抑制腎臟纖維化進(jìn)程能夠被EX-527(SIRT1特異性抑制劑)逆轉(zhuǎn)，提示明芹菜素通過(guò)TRPV4介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流可以激活A(yù)MPK/SITR1信號(hào)通路。其中，a為蛋白免疫印跡示意圖，b為TRPV4統(tǒng)計(jì)圖，c為p-AMPK統(tǒng)計(jì)圖，d為SIRT1統(tǒng)計(jì)圖；圖13芹菜素抑制腎臟纖維化進(jìn)程的機(jī)制圖。具體實(shí)施方式主要儀器和試劑1.大鼠，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；2.芹菜素(98％純度，杭州天草科技有限公司，中國(guó))3.醋酸脫氧皮質(zhì)酮(Sigma公司，美國(guó))4.烏拉坦(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；5.鹽酸(重慶川江化學(xué)試劑廠)6.甲醛(成都科龍化工試劑廠)7.harris蘇木素染液(北京中杉生物技術(shù)公司)8.碳酸鋰(生工生物工程有限公司)9.鹽酸(重慶川江化學(xué)試劑廠)10.二甲苯(成都科龍化工試劑廠)11.水性伊紅染液(北京中杉生物技術(shù)公司)12.中性樹膠(中國(guó)上海標(biāo)本模型廠)13.去離子水過(guò)濾器(Millipore，德國(guó))14.倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)15.冰凍切片機(jī)(Leica公司，德國(guó))16.電子天平(CAV31020，美國(guó))17.比率熒光成像系統(tǒng)(PTI104B，PTI公司，美國(guó))28.HEKAEPC-10膜片鉗系統(tǒng)(HEKA公司，德國(guó))本發(fā)明的整個(gè)機(jī)制如圖13所示。實(shí)施例1DOCA-鹽致腎臟纖維化動(dòng)物模型1.DOCA-鹽致腎臟纖維化動(dòng)物模型：健康雄性2月齡SD大鼠24只(由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重250g～300g，鼠分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。自然晝夜采光，室溫18℃-26℃，每日早晚喂食，隔日換水。濕度50％左右。手術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后行左側(cè)腎臟摘除術(shù)。大鼠稱重后腹腔注射10％的烏拉坦溶液麻醉(1m1/kg)，然后背部術(shù)區(qū)剪毛，俯臥位固定于手術(shù)板上，嚴(yán)格消毒后于脊柱左側(cè)、第十二肋下緣作一長(zhǎng)約2cm的切口，分離肌肉，游離腎包膜，暴露左腎，緊貼腎門處結(jié)扎腎動(dòng)、靜脈，切除左側(cè)腎臟，清除淤血后縫合肌肉層和皮膚。2.術(shù)后給予青霉素鈉腹腔注射3天，1周后將大鼠隨機(jī)分成4組：第一組為對(duì)照組(Cont組，n＝6)，皮下注射植物油，飼飲自來(lái)水；第二組為芹菜素組(Api組，n＝6)，皮下注射植物油，飼飲自來(lái)水，喂食含0.2％芹菜素的飼料；第三組為DOCA組(n＝6)，每周皮下注射DOCA油劑(11-去氧皮質(zhì)酮三甲基醋酸)(40mg/kg)一次，飼飲水含有10g/L的NaC1和2g/L的KC1；第四組為DOCA+芹菜素組(DOCA+Api組，n＝6)，每周皮下注射DOCA油劑(40mg/kg)一次，飼飲水含有10g/L的NaC1和2g/L的KC1，喂食含0.2％芹菜素的飼料。術(shù)后干預(yù)時(shí)間4周，期間每周測(cè)一次體重。按照分組情況，分別配制普通飼料和芹菜素飼料。飼料配方如下：普通飼料，脂肪10％，蛋白質(zhì)22％，碳水化合物68％。飼料中各成分所占比例(％)普辣飼料中芹菜素的添加方法為每100g普通飼料中加入0.2g的芹菜素。實(shí)施例2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.體重的測(cè)定：普通稱量法。2.尿白蛋白和肌酐測(cè)定，其結(jié)果如圖6所示。2.124小時(shí)尿標(biāo)本的采集飲食干預(yù)結(jié)束后，清晨將大鼠置于代謝籠中，分籠喂養(yǎng)，每籠1只，禁食，自由飲水。自然晝夜采光，室溫18℃-26℃，濕度50％左右。專人添加飼料，每日定時(shí)用天平稱取飼料重量，計(jì)算每日每只大鼠進(jìn)食量。收集24小時(shí)尿量，4000r/min，常溫下離心10min后，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2試劑配制、使用方法和保存Alb.標(biāo)準(zhǔn)品：各標(biāo)準(zhǔn)品分別準(zhǔn)確加入0.5ml緩沖液溶解，溶解15分鐘后搖勻。溶解后其濃度分別為1、2、5、10、20、50μg/ml。保存于4℃冰箱。125I-Alb.：將全部樣品用10ml緩沖液溶解，保存于4℃冰箱。兔抗-ALB.抗體：用緩沖液溶解，保存于4℃冰箱。2.3取圓底聚苯乙烯試管若干，用記號(hào)筆編號(hào)NSB、S1-S6和待測(cè)樣品管等，然后用微量取樣器加樣。充分搖勻后，室溫放置15分鐘，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，吸棄上清，測(cè)各沉淀管的放射性計(jì)數(shù)(cpm)3.腎臟重量的測(cè)量和腎臟/體重比值的計(jì)算，其結(jié)果如圖5所示。飲食干預(yù)結(jié)束后，動(dòng)物禁食12小時(shí)。將動(dòng)物稱重，10％烏拉坦溶液液(0.1ml/10g小鼠體重)腹腔注射麻醉，處死大鼠并取材。大鼠處死后濾干水分后腎臟稱重。腎臟/體重比值＝KW(g)/BW(g)×100％；KW為腎臟重量，BW為體重。4.組織切片染色，其結(jié)果如圖1，圖2，圖3和圖4所示。4.1石蠟切片4.1.1已取材的腎臟用濾紙片吸干水分。4.1.2取出組織支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個(gè)小臺(tái)后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上，-20℃冰凍1小時(shí)。4.1.3將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。4.1.4調(diào)好厚度至10um，調(diào)好防卷板。4.1.5切片。4.1.6固定標(biāo)本1小時(shí)。4.2HE染色4.2.1切片蘇木精染色10min，自來(lái)水沖洗，3次。4.2.21％鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗，3次。4.2.3稀碳酸鋰水溶液中促藍(lán)，自來(lái)水沖洗，3次。4.2.4伊紅5min。4.2.5入80％乙醇1次，數(shù)秒。4.2.6入95％乙醇一次，數(shù)秒。4.2.7入無(wú)水乙醇三次，每次1min。4.2.8入二甲苯兩次，每次5min。4.2.9晾干，中性樹膠封片。4.3腎小球硬化指數(shù)(Glomerulosclerosisindex，GSI)腎小球硬化指數(shù)(GSI)采用半定量計(jì)分法評(píng)估，放大倍數(shù)為200。每個(gè)腎取20個(gè)視野進(jìn)行檢查，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：沒(méi)有變化，被評(píng)為0分；病變涉及25％腎小球，被評(píng)為1分；病變涉及25％至50％腎小球，評(píng)為2分；病變涉及50％以上腎小球，評(píng)為3分。每個(gè)動(dòng)物的腎小球硬化指數(shù)為平均每個(gè)視野的平均得分。所有評(píng)分有2位實(shí)驗(yàn)者獨(dú)立檢測(cè)。4.4糖原(PAS)染色4.4.1石蠟切片脫蠟至水(細(xì)胞涂片，冰凍切片直接水洗)4.4.2蒸餾水洗4.4.3過(guò)碘酸酒清夜10min4.4.4自來(lái)水沖洗10min4.4.5Schiff氏液10min4.4.6流水沖洗5min4.4.7用哈瑞蘇木精或邁耶蘇木精染核3min(細(xì)胞核染色過(guò)深可用鹽酸酒精分化)4.4.8流水沖洗5min4.4.9常規(guī)脫水、透明、封固4.5Masson染色4.5.1組織固定,切片,脫蠟至水.4.5.2Masson復(fù)合染色液5分鐘.4.5.30.2％醋酸水溶液稍洗.4.5.45％磷鉬酸5～10分鐘.4.5.50.2％醋酸水溶液浸洗2次.4.5.6亮綠染色液5分鐘,0.2％醋酸水溶液洗2次.4.5.7無(wú)水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片.5.免疫熒光染色，其結(jié)果如圖7所示。5.1將腎臟組織埋于冰凍包埋劑。5.2冰凍切片機(jī)將組織切成厚度為4-6μm，并將其吸附于蓋玻片上。5.3將組織浸泡在10％中性甲醛溶液(甲醛用0.1MPBS溶液稀釋10倍)中，固定40-60min。5.4在雙氧水甲醇溶液(雙氧水：甲醇＝1：50)中浸泡30min，以去除組織內(nèi)源性過(guò)氧化物。5.5蒸餾水清洗2遍后，用5％牛血清封閉20min。5.6加1：200稀釋的兔抗小鼠TRPV4抗體，室溫2h或4℃過(guò)夜。PBS洗3次，每次5min。5.7加1：200稀釋的TRITC標(biāo)記二抗(抗兔)，室溫避光染30min。PBS洗3次，每次5min。5.8在TE2000-U倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)合NIS-Elements成像軟件照相和分析。實(shí)施例3分子實(shí)驗(yàn)1.蛋白免疫印跡，其結(jié)果如圖10，圖11和圖12所示。1.1組織和細(xì)胞總蛋白提取方法1.1.1取100mg組織加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液(蛋白質(zhì)勻漿緩沖液1ml加PMSF50ug，Leuptin5ug)，勻漿機(jī)勻漿，收集勻漿液于1.5ml的離心管中；如為細(xì)胞樣品，則將適量裂解液直接加入到培養(yǎng)瓶或六孔板中，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞。1.1.2-20℃放置20min以沉淀蛋白。1.1.34℃12000rpm離心20min，收集上清液即組織蛋白，用于蛋白定量及免疫印跡實(shí)驗(yàn)，或者于-70℃凍存?zhèn)溆谩?.1.4蛋白定量方法(Bradford法)1.1.5蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的配制：用雙蒸水配制1mg/ml的牛血清白蛋白作為濃縮標(biāo)準(zhǔn)液，按下表加樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。管號(hào)12345濃縮標(biāo)準(zhǔn)液ul05102080H20ul807570600蛋白定量試劑ml333331.1.6上述試劑加完后，混勻，室溫靜置3min，以空白管調(diào)零，用BeckmanDU-640分光光度計(jì)在595nmol/L處讀取各管的吸光光度值。1.1.7在干凈試管中加入1ml蛋白定量試劑，準(zhǔn)確吸取2ul待測(cè)蛋白樣品或蒸餾水(空白對(duì)照)加入試管中(即1:500稀釋)，混勻后比色，記錄各樣品的濃度。1.1.8取500ug樣品于干凈EP管中，用蛋白加樣緩沖液定容至200ul，混勻，置于沸水中變性6分鐘。4℃保存，Westernblot上樣備用。1.2蛋白免疫印跡操作步驟1.2.1灌制聚丙烯凝膠：先灌下層的分離膠(檢測(cè)不同分子量的蛋白，分離膠濃度不同)，再灌上層的4％濃縮膠，然后上樣，每孔上樣量為50ug，每個(gè)樣本至少上二塊平行膠；1.2.2蛋白電泳：電泳電壓濃縮膠為90V，分離膠為140V，電泳液為甘氨酸緩沖液；1.2.3轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠與大小相同的PVDF膜(事先用95％乙醇固定)置于上下各三層濾紙中間，置入轉(zhuǎn)移槽，加滿轉(zhuǎn)移液，4℃95mA電泳轉(zhuǎn)膜14h左右；1.2.4封閉：取出PVDF膜，自然晾干后，置于95％乙醇中固定；0.01mol/LPBST洗15min×3次；5％脫脂奶粉中封閉非特異性蛋白，37℃搖床中封閉約4h；1.2.5抗原抗體反應(yīng)：分別加一抗和內(nèi)參照β-actin抗體(用PBST稀釋成1：1000的濃度)，37℃搖床中結(jié)合3～4h或置于4℃過(guò)夜，PBST洗15min×3次；加IgG二抗(用PBST稀釋成1：1000)，37℃搖床中結(jié)合1～2h，PBST洗15min×3次；1.2.6顯影：將PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng)1～3min；在暗室中使X光片曝光，常規(guī)方法顯影定影；1.2.7定量：凝膠成像系統(tǒng)掃描分析條帶光密度值(OD值)。計(jì)算每個(gè)蛋白條帶光密度值與內(nèi)參照β-actin光密度值的比值，代表各樣品的蛋白表達(dá)水平。2.細(xì)胞內(nèi)鈣離子的測(cè)定,其結(jié)果如圖8所示。2.1接種在六孔板內(nèi)2×2cm玻片上的HBZY-1腎小球系膜細(xì)胞，測(cè)定前去除培養(yǎng)基，用PSS洗兩次；每孔加入1ml含4umol/LFura-2/AM和0.02％PluronicF-127的PSS，于37℃孵箱中避光孵育40min，用PSS洗兩次，去除細(xì)胞外殘余的Fura-2/AM；將負(fù)載了Fura-2/AM的細(xì)胞玻片置于熒光顯微鏡下(PTI104B)，鈣熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為340nm/380nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510nm；熒光信號(hào)經(jīng)Felix專用軟件處理，以細(xì)胞內(nèi)游離鈣熒光強(qiáng)度F(340nm/510nm)與結(jié)合鈣熒光強(qiáng)度F380nm/510nm之比反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度([Ca2+]i)的變化，該比值(以F340nm/380nm表示)升高表明[Ca2+]i升高?？傆涗洉r(shí)間為300s-600s，系統(tǒng)每秒鐘采集數(shù)據(jù)1次。2.2先測(cè)定基礎(chǔ)狀態(tài)下HBZY-1細(xì)胞F340nm/380nm，若曲線平穩(wěn)則說(shuō)明[Ca2+]i基線穩(wěn)定，在50s后加不同濃度辣椒素刺激，記錄細(xì)胞F340nm/380nm的變化，計(jì)算F340nm/380nm曲線的瞬時(shí)升高幅度，即(瞬時(shí)最高值-基礎(chǔ)值)/基礎(chǔ)值×100％，每種濃度的辣椒素刺激重復(fù)3-6次。3.膜片鉗記錄TRPV4通道，其結(jié)果如圖9所示。3.1電極內(nèi)外液的配制Kgluconate140,KCl2.5,MgCl21,HEPES5,EGTA1.5,使用KOH溶液將pH調(diào)至7.4，電極液和細(xì)胞外液一致。3.2電極的制備根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的而設(shè)置電極拉制儀的參數(shù)，通常情況下，電極分兩步拉制，第一次粗拉制使玻璃管中間拉成一細(xì)窄的管狀，第二次將窄細(xì)部位拉斷成兩根，其尖端直徑一般為1-5μm，在顯微鏡下觀察時(shí)其尖端應(yīng)光滑而不呈斷裂狀，并用拋光儀對(duì)電極進(jìn)行拋光，電極必須保持清潔，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)日拉制，避免電極尖端有灰塵進(jìn)入，充入電極內(nèi)液時(shí)電極的電阻在5-10M。3.3電流的記錄我們應(yīng)用HEKAEPC-10膜片鉗系統(tǒng)，采用細(xì)胞粘附式膜片鉗技術(shù)記錄被檢測(cè)的通道活性，用Clampfit10.0分析所得數(shù)據(jù)。當(dāng)電極尖端輕輕壓在細(xì)胞膜的表面后，用連接在電極把持器上的注射器輕輕地回吸，而使電極與細(xì)胞膜密切接觸形成千兆歐姆封接。該方法是在細(xì)胞內(nèi)成分保持不變的情況下研究離子通道的活動(dòng)，進(jìn)行單通道電流的記錄。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性技術(shù)內(nèi)容是廣義的定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3