本發(fā)明屬于獸藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物及制劑。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是近二十年來對世界養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成嚴重威脅的疾病之一，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是造成該病的病原。在美國，PRRS每年至少對養(yǎng)豬業(yè)造成60億美元的損失。2006年，一種以高熱為特征的病毒在我國南方豬群中爆發(fā)，后來證實是由高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引起，至少有200萬頭豬受到不同程度影響，40萬頭豬死亡。此后，2007年，相同的疫情在已經(jīng)暴發(fā)過的省份卷土重來，造成嚴重損失。PRRS在臨床上主要表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙、公豬精液質(zhì)量下降、仔豬斷奶后肺炎、生長緩慢、個體機能下降以及死亡率高。目前，PRRSV在臨床上仍沒有有效的治療措施，主要依靠預防來阻斷病毒的發(fā)生和傳播。目前被授權(quán)使用的主要是減毒活疫苗，但因抗原的活性并未完全喪失，使用中仍然存在一定的感染風險。

苦參(Sophora flavescens Ait.)是我國傳統(tǒng)藥物之一，全國各地分布廣泛。苦參的主要作用為清熱、祛濕、利尿，此外還有抗病毒、抗菌、抗過敏、抗腫瘤、降血脂、降血壓的作用?？鄥A(Matrine)是從苦參及苦豆子等中提取出來的一類生物堿，在體內(nèi)代謝后成為氧化苦參堿，發(fā)揮其抗病毒作用。甘草也是我國應用非常廣泛的一味中藥，具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳等作用，用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心虛氣短，咳嗽痰多，緩解藥物毒性、烈性。甘草酸(glycyrrhizic acid)是甘草的主要作用成分，其含量占甘草根部干重的2-24％，具有顯著的抗病毒作用，已在臨床上被用于治療慢性活動性病毒肝炎及HIV病毒的感染，且不會導致耐藥性的出現(xiàn)。兩種藥物都具有較好的抗病毒作用，申請公布號為CN100564391C的發(fā)明專利公開了一種甘草酸苦參堿鹽，該甘草酸苦參堿鹽可用于制備治療肝病的藥物，具有良好的治療效果。但是現(xiàn)有技術(shù)尚未出現(xiàn)能夠治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物，如果能將甘草酸和苦參堿應用于此，可能會取得預料不到的效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物及制劑。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供了一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物在制備用于治療PRRSV病毒引起的豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應用，所述復方中藥組合物包括重量份數(shù)比為0.25～4:1的甘草酸和苦參堿。

進一步地，所述應用中甘草酸和苦參堿的重量份數(shù)比為1:3或3:1。

本發(fā)明另一方面提供了一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物，包括甘草酸和苦參堿，所述復方中藥組合物中甘草酸和苦參堿的重量份數(shù)比為0.25～4:1，優(yōu)選為1:3或3:1。

本發(fā)明提供的復方中藥組合物具有較強的抗病毒的能力，能有效殺滅細胞內(nèi)外的PRRSV病毒，從預防和治療兩個方面清除病原體，保護豬只的健康。

為了使用方便，本發(fā)明還提供了一種抗PRRSV病的的復方中藥制劑，所述復方中藥制劑由本發(fā)明提供的復方中藥組合物制成，所述復方中藥制劑選自口服液劑、注射劑、散劑、片劑或丸劑。

本發(fā)明一方面提供了一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每升所述口服液劑包括如下重量份數(shù)的成分：所述復方中藥組合物1～4份、助劑2～4份，其余為去離子水；所述助劑包括如下重量份數(shù)的成分：增稠劑1～2份、穩(wěn)定劑1～2份。

進一步地，所述增稠劑為普魯蘭多糖和椰油酸單乙醇酰胺的混合物，所述普魯蘭多糖與椰油酸單乙醇酰胺的重量份數(shù)比為1～2:1。

將普魯蘭多糖和椰油酸單乙醇酰胺聯(lián)合使用，可有效提升增稠效果，顯著改善口服液的質(zhì)地和口感。

進一步地，所述穩(wěn)定劑為海藻糖、肉桂酸鉀以及茶多酚的混合物，所述海藻糖、肉桂酸鉀以及茶多酚的重量份數(shù)比為1～1.5:1:0.5～1。

將海藻糖、肉桂酸鉀以及茶多酚聯(lián)合使用，可顯著提高口服液的穩(wěn)定性，防止口服液被氧化、被有害微生物污染，并能在不良條件下保持口服液中有效成分的性質(zhì)穩(wěn)定。

本發(fā)明另一方面還提供了一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射劑，每升所述注射劑包括如下重量份數(shù)的組分：所述復方中藥組合物1～5份、助劑1.5～4份，其余為10％葡萄糖水溶液或0.9％氯化鈉水溶液；所述助劑包括如下重量份數(shù)的成分：澄清劑0.5～1.5份、助溶劑1～2.5份。

進一步地，所述澄清劑為殼聚糖、干酪素以及食用明膠的混合物，所述殼聚糖、干酪素以及食用明膠的重量份數(shù)比為1～2:1:2。

將殼聚糖、干酪素以及食用明膠聯(lián)合使用，可以有效減少沉淀、澄清溶液，使注射液質(zhì)地更加均一。

進一步地，所述助溶劑為松油醇和檸檬烯的混合物，所述松油醇和檸檬烯的重量份數(shù)比為1～1.5:1。

將松油醇、檸檬烯用作助溶劑，可顯著增加其在水中的溶解度，使有效成分得以徹底溶解，并且質(zhì)地更加均一、穩(wěn)定性更加持久。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的抗PRRSV病的的復方中藥組合物能從預防和治療兩方面防控PRRSV病毒，對PRRSV病毒具有很好的殺滅效果；并且本發(fā)明所用原料藥的品種少，因此副作用小，并能夠?qū)崿F(xiàn)各有效成分的相輔相成、協(xié)同發(fā)揮療效的目的；制成口服液劑或注射水劑后，服用及攜帶更加方便，并且能夠充分發(fā)揮中藥組合物的療效；各種助劑的添加使所述復方中藥組合物性質(zhì)更穩(wěn)定，有助于保持其治療效果。

具體實施方式

實施例1

一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物，由1份甘草酸和1份苦參堿組成。

實施例2

一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物，由1份甘草酸和2份苦參堿組成。

實施例3

一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物，由2份甘草酸和1份苦參堿組成。

實施例4

一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物，由1份甘草酸和3份苦參堿組成。

實施例5

一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物，由3份甘草酸和1份苦參堿組成。

實施例6

一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物，由1份甘草酸和4份苦參堿組成。

實施例7

一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物，由4份甘草酸和1份苦參堿組成。

實施例8

一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每1L所述口服液劑包括如下重量份數(shù)的成分：實施例1所述的復方中藥組合物4g、增稠劑2g以及穩(wěn)定劑2g，其余為滅菌去離子水。所述增稠劑為普魯蘭多糖1g和椰油酸單乙醇酰胺1g，所述穩(wěn)定劑為海藻糖0.8g、肉桂酸鉀0.8g以及茶多酚0.4g。

實施例9

一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每1L份所述口服液劑包括如下重量份數(shù)的成分：實施例2所述的復方中藥組合物2g、增稠劑1.5g以及穩(wěn)定劑1.5g，其余為滅菌去離子水。所述增稠劑為普魯蘭多糖1g和椰油酸單乙醇酰胺0.5g，所述穩(wěn)定劑為海藻糖0.6g、肉桂酸鉀0.6g以及茶多酚0.3g。

實施例10

一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每1L所述口服液劑包括如下重量份數(shù)的成分：實施例3所述的復方中藥組合物2g、增稠劑1.5g以及穩(wěn)定劑2g，其余為滅菌去離子水。所述增稠劑為普魯蘭多糖1g和椰油酸單乙醇酰胺0.5g，所述穩(wěn)定劑為海藻糖0.75g、肉桂酸鉀0.75g以及茶多酚0.5g。

實施例11

一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每1L所述口服液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例4所述的復方中藥組合物1g、增稠劑1g以及穩(wěn)定劑1g，其余為滅菌去離子水。所述增稠劑為普魯蘭多糖0.5g以及椰油酸單乙醇酰胺0.5g，所述穩(wěn)定劑為海藻糖0.4g、肉桂酸鉀0.4g以及茶多酚0.2g。

實施例12

一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每1L所述口服液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例5所述的復方中藥組合物2g、增稠劑1.5g以及穩(wěn)定劑1.5g，其余為滅菌去離子水。所述增稠劑為普魯蘭多糖1g以及椰油酸單乙醇酰胺0.5g，所述穩(wěn)定劑為海藻糖0.5g、肉桂酸鉀0.5g以及茶多酚0.5g。

實施例13

一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每1L所述口服液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例6所述的復方中藥組合物1g、增稠劑1g以及穩(wěn)定劑1g，其余為滅菌去離子水。所述增稠劑為普魯蘭多糖0.67g以及椰油酸單乙醇酰胺0.33g，所述穩(wěn)定劑為海藻糖0.4g、肉桂酸鉀0.4g以及茶多酚0.2g。

實施例14

一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每1L所述口服液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例7所述的復方中藥組合物2g、增稠劑2g以及穩(wěn)定劑1.5g，其余為滅菌去離子水。所述增稠劑為普魯蘭多糖1g以及椰油酸單乙醇酰胺1.5g，所述穩(wěn)定劑為海藻糖0.5g、肉桂酸鉀0.5g以及茶多酚0.5g。

實施例15

一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射液，每1L所述注射液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例1所述的復方中藥組合物4g、澄清劑1.5g以及助溶劑2.5g，其余為10％葡萄糖水溶液。所述澄清劑為殼聚糖0.6g、干酪素0.3g以及食用明膠0.6g，所述助溶劑為松油醇1.25以及檸檬烯1.25g。

實施例16

一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射液，每1L所述注射液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例2所述的復方中藥組合物2g、澄清劑1.5g以及助溶劑1g，其余為10％葡萄糖水溶液。所述澄清劑為殼聚糖0.6g、干酪素0.3g以及食用明膠0.6g，所述助溶劑為松油醇0.5g以及檸檬烯0.5g。

實施例17

一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射液，每1L所述注射液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例3所述的復方中藥組合物2g、澄清劑0.5g以及助溶劑2.5g，其余為0.9％氯化鈉水溶液。所述澄清劑為殼聚糖0.125g、干酪素0.125g以及食用明膠0.25g，所述助溶劑為松油醇1.5g以及檸檬烯1g。

實施例18

一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射液，每1L所述注射液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例4所述的復方中藥組合物1g、澄清劑0.5g以及助溶劑1g，其余為0.9％氯化鈉水溶液。所述澄清劑為殼聚糖0.2g、干酪素0.1g以及食用明膠0.2g，所述助溶劑為松油醇0.6g以及檸檬烯0.4g。

實施例19

一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射液，每1L所述注射液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例5所述的復方中藥組合物2g、澄清劑1.5g以及助溶劑1g，其余為10％葡萄糖水溶液。所述澄清劑為殼聚糖0.375g、干酪素0.375g以及食用明膠0.75g，所述助溶劑為松油醇0.5g以及檸檬烯0.5g。

實施例20

一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射液，每1L所述注射液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例6所述的復方中藥組合物1g、澄清劑0.5g以及助溶劑1g，其余為10％葡萄糖水溶液。所述澄清劑為殼聚糖0.2g、干酪素0.1g以及食用明膠0.2g，所述助溶劑為松油醇0.6g以及檸檬烯0.4g。

實施例21

一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射液，每1L所述注射液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例7所述的復方中藥組合物2g、澄清劑0.5g以及助溶劑2.5g，其余為0.9％氯化鈉水溶液。所述澄清劑為殼聚糖0.125g、干酪素0.125g以及食用明膠0.25g，所述助溶劑為松油醇1.25g以及檸檬烯1.25g。

對照例1

一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物，由1份甘草酸和3份氧化苦參堿組成。

對照例2

一種抗PRRSV病毒的復方中藥組合物，由1份甘草甜素和3份苦參堿組成。

對照例3

一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每1L所述口服液劑包括如下重量份數(shù)的成分：實施例1所述的復方中藥組合物4g、增稠劑2g以及穩(wěn)定劑2g，其余為滅菌去離子水。所述增稠劑為普魯蘭多糖1g，所述穩(wěn)定劑為海藻糖。

對照例4

一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每1L份所述口服液劑包括如下重量份數(shù)的成分：實施例2所述的復方中藥組合物2g、增稠劑1.5g以及穩(wěn)定劑1.5g，其余為滅菌去離子水。所述增稠劑為椰油酸單乙醇酰胺，所述穩(wěn)定劑為肉桂酸鉀。

對照例5

一種抗PRRSV病毒的復方中藥口服液，每1L所述口服液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例3所述的復方中藥組合物2g、增稠劑1.5g以及穩(wěn)定劑1.5g，其余為滅菌去離子水。所述增稠劑為椰油酸單乙醇酰胺，所述穩(wěn)定劑為茶多酚。

對照例6

一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射液，每1L所述注射液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例4所述的復方中藥組合物1g、澄清劑0.5g以及助溶劑1g，其余為0.9％氯化鈉水溶液。所述澄清劑為殼聚糖，所述助溶劑為松油醇。

對照例7

一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射液，每1L所述注射液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例5所述的復方中藥組合物2g、澄清劑1.5g以及助溶劑1g，其余為10％葡萄糖水溶液。所述澄清劑為干酪素，所述助溶劑為檸檬烯。

對照例8

一種抗PRRSV病毒的復方中藥注射液，每1L所述注射液包括如下重量份數(shù)的成分：實施例6所述的復方中藥組合物1g、澄清劑0.5g以及助溶劑1g，其余為10％葡萄糖水溶液。所述澄清劑為食用明膠，所述助溶劑為松油醇。

實驗例1

復方中藥組合物抗PRRSV病毒效果實驗

以實施例1～7中的復方中藥組合物為實驗組1～7，以對照例1～2為對照組1～2，并分別以單一的甘草酸和苦參素作為對照組3～4，進行抗PRRSV病毒效果實驗，具體方法如下：

(1)Marc-145細胞的傳代培養(yǎng)

當Marc-145細胞鋪滿瓶底80％以上的時，將長成的單層細胞用PBS液清洗兩次，棄去后，棄去后加入1ml胰酶-EDTA液消化，當細胞間距變大，細胞變圓，倒掉消化液加入5mlDMEM完全培養(yǎng)液，用吸管將細胞從瓶壁上吹下，吹打均勻后按1:3或1:4的比例傳代，在加入適量的完全培養(yǎng)液，混勻后置于37℃下，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后繼續(xù)傳代。

(2)PRRSV病毒的培養(yǎng)及保存

將200ul病毒液接種至25cm2培養(yǎng)瓶中長至單層的Marc-145細胞上，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶使病毒液分布均勻，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h后棄去病毒液，PBS洗兩次，加入5mL維持液繼續(xù)培養(yǎng)至80％細胞出現(xiàn)細胞病變，將培養(yǎng)瓶于-20℃反復凍融3次，取出細胞液于離心管中，3000r/min離心15min，收集上清，分裝成200ul/管于-20℃保存。

(3)Marc-145細胞的PRRSV病毒感染及治療

Marc-145細胞在96孔板中長成單層后棄去生長液，PBS洗兩次，以100TCID50的濃度稀釋病毒液，每孔加入100ul，培養(yǎng)2h后棄去上清，PBS洗兩次，用維持液將各組藥物從2mg/mL往下倍比稀釋3個濃度，每孔加入100ul藥物，同時設置細胞對照和病毒對照，繼續(xù)培養(yǎng)72h，于結(jié)束培養(yǎng)前4h每孔加入10ulMTT，再培養(yǎng)4h后取出96孔板，棄去上清，每孔加入100ulDMSO，置于酶標儀上震蕩10min，測波長為492nm處的OD值。根據(jù)以下公式計算各組藥物對PRRSV病毒的抑制率：藥物抑制率(％)＝(OD給藥組-OD病毒對照組)/(OD細胞對照組-OD病毒對照組)*100。

表1各組樣品抑制病毒情況

由表1可知，實驗組各組中，添加了復方中藥組合物的各組處理的OD值普遍顯著高于細胞對照處理，藥物抑制百分率也相應地顯著高于細胞對照處理，其中以實驗組4和5的OD值最高；而對照組中除了對照組1和4中2^-3濃度處理外，添加了復方中藥組合物的各組處理的OD值和藥物抑制百分率均低于細胞對照處理。由此可知，實施例1～7中的復方組合物均對PRRSV病毒有顯著的抑制效果，其中以實驗組4的抑制效果最好，而對照組1～4則無明顯的抑制效果，這表明將甘草酸和苦參堿聯(lián)合使用時，對PRRSV病毒可以產(chǎn)生良好的抑制效果，并且在甘草酸與苦參堿的質(zhì)量份數(shù)比為1:3或3:1時，這種抑制效果最好。

實驗例2

口服液穩(wěn)定性實驗

以實施例8～14中的復方中藥口服液為實驗例1～7，以對照例3～5中的復方中藥口服液為對照組1～3，進行穩(wěn)定性實驗，具體操作方法如下：

(1)加速試驗

取各組口服液樣品在溫度40℃±2℃、濕度75％±5％的條件下放置6個月，分別于第1、2、3、6個月月末取樣一次，檢測口服液的性狀、色澤、氣味以及主成分含量(標示量％)。

表2各組樣品主成分含量變化情況

從表2可知，實施例各組的主成分含量均無明顯變化，而對照例各組的主成分含量均出現(xiàn)明顯降低；通過直觀比較，各實驗例口服液的顏色均無顯著改變，未出現(xiàn)肉眼可見的渾濁，也未出現(xiàn)異常氣味；而各對照例口服液的顏色明顯變深、出現(xiàn)沉淀，并且產(chǎn)生酸敗氣味。這表明各組實施例口服液的穩(wěn)定性顯著好于各組對照例，也說明海藻糖+肉桂酸鉀+茶多酚聯(lián)用可以顯著提高口服液的穩(wěn)定性，并且這種效果明顯好于只使用其中一種時的效果。

(2)長期試驗

取各組口服液樣品在溫度25℃±2℃、濕度60％±10％的條件下放置12個月，分別于第0、3、6、9、12個月月末取樣一次，檢測口服液的性狀、色澤、氣味以及主成分含量(標示量％)。

表3各組樣品主成分含量變化情況

從表3可知，實施例各組的主成分含量均無明顯變化，而對照例各組的主成分含量均出現(xiàn)明顯降低；通過直觀比較，各實驗例口服液的顏色均無顯著改變，未出現(xiàn)肉眼可見的渾濁，也未出現(xiàn)異常氣味；而各對照例口服液的顏色明顯變深、出現(xiàn)沉淀，并且產(chǎn)生酸敗氣味。這表明各組實施例口服液的穩(wěn)定性顯著好于各組對照例，也說明海藻糖+肉桂酸鉀+茶多酚聯(lián)用可以顯著提高口服液的穩(wěn)定性，并且這種效果明顯好于只使用其中一種時的效果。

實驗例3

注射液均一性實驗

以實施例15～21中的復方中藥注射液為實驗例1～7，以對照例6～8中的復方中藥注射液為對照組1～3，分別取各組樣品2ml于具塞試管中，加水至10ml，混合均勻，每組樣品做5個平行，用紫外分光光度計分別測量200nm(苦參堿)與250nm(甘草酸)處的吸光度，對各組樣品的吸光度值進行比較。

表4各組樣品的吸光度

由表4可知，實驗組各組的吸光度值明顯低于對照組各組的吸光度值，表明實驗組各組溶液的澄清度、均一度明顯好于對照組各組。由此可知，將殼聚糖+干酪素+食用明膠的澄清劑組合以及松油醇+檸檬烯的增溶劑組合聯(lián)合使用，可以顯著提升注射液的澄清度和均一度，并且其效果好于只使用其中一種或個別幾種組合的澄清和増溶效果。

實驗例4

臨床實驗

以實施例1～7所述的復方中藥組合物為實驗組1～7，選取兩種市售PRRSV疫苗作為對照組1和2，選取100頭6個月～3歲不等的健康豬只，分為十組，每組10頭，其中九組分別使用實驗組1～7提供的組合物和對照組1～2所述疫苗，另一組不使用任何藥物，作為對照組3，全部豬只均接種PRRSV病毒。三個月后，比較各組豬只的健康狀況。

表5各組豬只的健康狀況

由表5可知，使用了藥品的各組處理豬只的健康率均遠高于對照組3，其中實驗組各組的平均健康率超過95％，并且均未出現(xiàn)死亡例；而對照組患病率高于實驗組，并出現(xiàn)了死亡例。其原因在于，目前市售疫苗均為減毒活疫苗，仍然存在一定的感染活性，如豬只免疫力較差，則接種疫苗本身就存在感染的風險。相比之下，實驗組各組的復方中藥組合物本身不具有毒性，并且成分簡單，使用時不易出現(xiàn)過敏反應，因此安全性更高，加上優(yōu)異的治療效果，十分適合進行推廣使用。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。