本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的單壁碳納米管及其制備方法，具體涉及一種可示蹤的攜帶近紅外熒光染料Cy5.5的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針、其制備方法以及作為精準(zhǔn)治療工具的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

光熱療法是利用近紅外808nm的激光照射納米材料聚集的病灶區(qū)域，產(chǎn)生局部高溫殺傷病灶，同時(shí)減少對(duì)正常組織損傷的一種輔助治療方法。

單壁碳納米管由于其結(jié)構(gòu)的特殊性在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中有非常廣泛的應(yīng)用前景。單壁碳納米管光穩(wěn)定性好，在近紅外區(qū)有很強(qiáng)的光吸收，可以將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熱能，與傳統(tǒng)的放療、化療相比更加安全有效。但未經(jīng)功能化的單壁碳納米管容易團(tuán)聚，而且毒性比較大，幾乎不溶于水以及有機(jī)溶劑，生物相容性很差。為使單壁碳納米管有比較好的水溶性，并減少毒性，當(dāng)前的研究主要是在單壁碳納米管進(jìn)入生物體之前進(jìn)行表面修飾，例如對(duì)其表面包裹PEG可以減少探針被巨噬細(xì)胞吞噬，從而增加血液循環(huán)時(shí)間，有利于更大程度的使探針進(jìn)入目標(biāo)區(qū)域。在生物成像方面，此分子探針在合適的粒徑范圍內(nèi)可以通過(guò)EPR效應(yīng)或者主動(dòng)靶向在目標(biāo)區(qū)域中富集，在710nm激光激發(fā)后成像，并在808nm照射下將光能轉(zhuǎn)換為熱能，產(chǎn)生局部高溫以達(dá)到光熱治療的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種新的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針的應(yīng)用。

一方面，本發(fā)明提供了一種新的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針，具體而言，本發(fā)明提供的單壁碳納米管近紅外探針，是加載有熒光染料Cy5.5的單壁碳納米管。

Cy5.5是一種水溶性的熒光染料，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標(biāo)記和檢測(cè)。Cy5.5的激發(fā)波段在678-710nm，是熒光強(qiáng)度高且光穩(wěn)定性強(qiáng)的長(zhǎng)波長(zhǎng)染料。其在體內(nèi)的清除經(jīng)肝臟排入膽道，最后進(jìn)入腸道排出體外。當(dāng)Cy5.5受到波長(zhǎng)為678-680nm的波長(zhǎng)激發(fā)以后，會(huì)釋放出波長(zhǎng)大約為695-710nm的紅外光。在生物體內(nèi)，近紅外光可以穿透深層組織且被檢測(cè)到，因此可以利用近紅外成像確定病灶的位置以及范圍，達(dá)到輔助光熱治療的效果。

本發(fā)明中，通過(guò)在單壁碳納米管上加載熒光染料Cy5.5，使得SWNT在近紅外808nm區(qū)域的吸光度增強(qiáng)。結(jié)合小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(IVIS)進(jìn)行近紅外成像，定位病灶組織的同時(shí)選擇最佳時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行光熱治療，達(dá)到最佳治療效果。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的單壁碳納米管近紅外探針，其是先對(duì)單壁碳納米管進(jìn)行羧基化并進(jìn)行DSPE-PEG表面修飾、之后再加載有熒光染料Cy5.5而制備得到的。

另一方面，本發(fā)明提供了一種具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針的制備方法，該方法包括步驟：

對(duì)單壁碳納米管進(jìn)行羧基化，制備羧基化單壁碳納米管；

對(duì)羧基化單壁碳納米管進(jìn)行DSPE-PEG表面修飾，得到DSPE-PEG表面修飾的單壁碳納米管；

在DSPE-PEG表面修飾的單壁碳納米管上加載熒光染料Cy5.5，制備得到本發(fā)明的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針。

本發(fā)明的制備方法中，通過(guò)將未功能化的單壁碳納米管(SWNT)進(jìn)行羧基化，加載DSPE-PEG，從而屏蔽SWNT的免疫原性，且能保護(hù)其生物活性，延長(zhǎng)探針在體內(nèi)的半衰期。之后耦合近紅外熒光染料Cy5.5得到被動(dòng)靶向探針(SWNT-Cy5.5)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針的制備方法中，對(duì)單壁碳納米管進(jìn)行羧基化的過(guò)程包括：

先在單壁碳納米管中加入3:1的硝酸與濃硫酸混合液體并進(jìn)行超聲，使硝酸分子與單壁碳納米管充分接觸；在磁力攪拌條件下進(jìn)行回流操作；然后分離硝酸分子，得到羧化的單壁碳納米管。

更具體地，上述對(duì)單壁碳納米管進(jìn)行羧基化的過(guò)程中，在單壁碳納米管中加入的3:1的硝酸與濃硫酸混合液體的量與單壁碳納米管的比例為50～150ml：1g。之后進(jìn)行的超聲主要是使硝酸分子與單壁碳納米管充分接觸，通常的超聲條件為80～200W超聲20分鐘～2小時(shí)。

更具體地，上述對(duì)單壁碳納米管進(jìn)行羧基化的過(guò)程中，回流操作可以在105～115℃油浴中充分磁力攪拌條件下進(jìn)行8～12小時(shí)。

更具體地，上述對(duì)單壁碳納米管進(jìn)行羧基化的過(guò)程中，分離硝酸分子的操作可包括：靜置回流操作后的混合液，除去上清液再加水?dāng)嚢枞缓箪o置，除去上清液，可重復(fù)多次至游離的硝酸分子被分離出去。另外，優(yōu)選地，也可再加水，輔以超聲等，使吸附在單壁碳納米管上的殘余硝酸溶解在水中被分離出去。分離除去硝酸分子后的沉淀物即為羧基化單壁碳納米管。具體實(shí)施時(shí)，可對(duì)分離除去硝酸分子后的沉淀物(殘留有部分液體)進(jìn)行抽濾并干燥，得到粉末狀的羧化單壁碳納米管，便于保存稱重。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針的制備方法中，對(duì)羧基化單壁碳納米管進(jìn)行DSPE-PEG表面修飾的過(guò)程包括：取羧化后的單壁碳納米管溶于去離子水，加入DSPE-PEG并充分結(jié)合，以修飾單壁碳納米管表面。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明所用DSPE-PEG可為各種商購(gòu)產(chǎn)品，例如可以是DSPE-PEG2000，或是DSPE-PEG WM3500等，符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求即可。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案，本發(fā)明加入的DSPE-PEG的量為其與羧基化單壁碳納米管的質(zhì)量比為不低于0.5：1，更優(yōu)選為0.5～2：1。本發(fā)明中，對(duì)反應(yīng)體系中的水量無(wú)特定要求，便于操作即可，通?？梢允?mg羧化后的單壁碳納米管溶于50～200mL去離子水中。本發(fā)明中，加入DSPE-PEG后可在70～150rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床震蕩0.5-2小時(shí)以使DSPE-PEG與單壁碳納米管充分結(jié)合修飾在單壁碳納米管表面。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針的制備方法中，在DSPE-PEG表面修飾的單壁碳納米管上加載熒光染料Cy5.5的過(guò)程可包括：向DSPE-PEG表面修飾的單壁碳納米管溶液中加入Cy5.5，37℃±2℃搖床過(guò)夜，即得到加載有熒光染料Cy5.5的單壁碳納米管(溶液形式)。本發(fā)明中將該加載有熒光染料Cy5.5的單壁碳納米管命名為SWNT-Cy5.5，即為本發(fā)明的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，上述在DSPE-PEG表面修飾的單壁碳納米管上加載熒光染料Cy5.5的過(guò)程中，向DSPE-PEG表面修飾的單壁碳納米管溶液中加入的Cy5.5的量與羧基化單壁碳納米管的質(zhì)量比不低于0.01：1，優(yōu)選為0.01～0.5：1。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，上述在DSPE-PEG表面修飾的單壁碳納米管上加載熒光染料Cy5.5的過(guò)程中，搖床過(guò)夜通常是指70～120rpm條件下?lián)u床震蕩8～14小時(shí)。搖床過(guò)夜后的溶液中即包含本發(fā)明的加載有熒光染料Cy5.5的單壁碳納米管探針。更進(jìn)一步，搖床過(guò)夜后的溶液可進(jìn)一步離心(例如500～2000rpm離心10～30min)，棄掉上清液，余沉淀凍干或加去離子水配制成所需要的各濃度，避光4℃以下保存。

另一方面，本發(fā)明還提供了所述的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針的應(yīng)用。

具體而言，本發(fā)明的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針加載有Cy5.5，在675nm激光照射下，能對(duì)病灶區(qū)域進(jìn)行近紅外熒光成像。因此，本發(fā)明的單壁碳納米管近紅外探針可用于制備用于病灶區(qū)域近紅外成像的制劑。

本發(fā)明中，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，探針粒徑小，在50-120nm之間，單分散性與穩(wěn)定性好，熒光性能穩(wěn)定，毒性小。

此外，本發(fā)明的探針可引導(dǎo)病灶區(qū)域近紅外成像，從而協(xié)助準(zhǔn)確診斷以及治療。將探針應(yīng)用于臨床輔助治療的光學(xué)成像，可以提高術(shù)后殘余的檢出率，并通過(guò)光熱效應(yīng)進(jìn)行局部高溫，減小或消除病灶，提高患者術(shù)后生存率和生活質(zhì)量。

綜上所述，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下有益效果：

1、本發(fā)明所涉及的合成方法簡(jiǎn)單易操作，且單壁碳納米管本身的比表面積大，易修飾等優(yōu)點(diǎn)；

2、本發(fā)明所合成的SWNT-Cy5.5具有穩(wěn)定的發(fā)光效率，且在近紅外區(qū)域的吸光度增強(qiáng)；

3、本發(fā)明所合成的納米探針粒徑小，在50-120nm之間，利于通過(guò)EPR效應(yīng)進(jìn)入病灶組織；

4、本發(fā)明所合成的SWNT-Cy5.5具有重要的應(yīng)用價(jià)值，尤其在光熱治療方面，結(jié)合活體成像系統(tǒng)，可以輔助術(shù)者精準(zhǔn)定位病灶位置，利用808nm激光照射使之產(chǎn)生局部高溫，有效殺死細(xì)胞，提高術(shù)后的生存率和生活質(zhì)量，具有良好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外成像探針的制備方法的流程示意圖。

圖2為實(shí)施例1制備的近紅外探針SWNT-Cy5.5的熒光信號(hào)檢測(cè)圖。

圖3為實(shí)施例1制備的近紅外探針SWNT-Cy5.5的體外光熱效果評(píng)估圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例中未詳細(xì)說(shuō)明的操作過(guò)程，可參照所屬領(lǐng)域中的常規(guī)操作或是按照儀器設(shè)備說(shuō)明書進(jìn)行；未詳細(xì)注明的溫度壓力條件，是在室溫和常壓條件下進(jìn)行。

實(shí)施例1

請(qǐng)參見圖1所示，本發(fā)明的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針的制備方法主要包括步驟：

步驟S1：羧基化單壁碳納米管。更具體的步驟包括：

在單壁碳納米管中加入硝酸與濃硫酸混合液體并進(jìn)行超聲的步驟S101；在單壁碳納米管中加入硝酸與濃硫酸混合液體并進(jìn)行超聲，可使得硝酸分子與單壁碳納米管充分接觸；

回流操作并分離硝酸分子的步驟S102；該過(guò)程主要是進(jìn)行回流操作，并除去游離或殘余的硝酸分子，得到羧化后單壁碳納米管。

步驟S2：對(duì)單壁碳納米管進(jìn)行表面修飾。本實(shí)施例中，是采用DSPE-PEG對(duì)單壁碳納米管進(jìn)行表面修飾。

步驟S3：加載熒光染料Cy5.5，制備具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針。

本實(shí)施例的具有光熱效應(yīng)的單壁碳納米管近紅外探針的制備方法主要操作如下：

1.V/V＝3:1的硝酸和濃硫酸共40ml中加入0.5g單壁碳納米管與100ml的燒瓶中；

2.在回流前先100W超聲30min，主要目的是讓硝酸分子與單壁碳納米管充分接觸；

3.在回流裝置中，110℃油浴并磁力攪拌10小時(shí)；

4.靜置1小時(shí)，用移液器移去上面的硝酸，再加水?dāng)嚢鑾追昼娙缓箪o置，除去清液，這樣重復(fù)3次；

5.再加水，超聲15min，然后磁力攪拌過(guò)夜，超聲的目的是為了讓吸附在單壁碳納米管上的殘余硝酸與溶解在水中，最后進(jìn)行抽濾，用水和乙醇沖洗；

6.抽濾后干燥，得到的粉末碾磨，即為羧化后的單壁碳納米管；

7.稱取0.5mg羧化后的單壁碳納米管溶于50mL去離子水，超聲后加入0.5mgPEG，80rpm搖床0.5-1小時(shí)使DSPE-PEG充分結(jié)合修飾單壁碳納米管表面，之后，加入0.02mg的Cy5.5，37℃80rpm搖床過(guò)夜，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，棄掉上清液，余沉淀即為最終使用的探針，本發(fā)明命名為SWNT-Cy5.5，可加去離子水避光4℃以下保存。經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明的SWNT-Cy5.5探針粒徑基本上在60-100nm之間。

實(shí)施例2

請(qǐng)參見圖2所示，為本實(shí)施例1制備的近紅外探針SWNT-Cy5.5的熒光信號(hào)檢測(cè)圖。

其中，本發(fā)明的探針為SWNT與Cy5.5耦合后的探針SWNT-Cy5.5，其在808nm處的吸光度與單獨(dú)的SWNT、Cy5.5兩種物質(zhì)以及兩種物質(zhì)簡(jiǎn)單混合(SWNT&Cy5.5)相比明顯增強(qiáng)。因此SWNT-Cy5.5在808nm激光照射下能夠產(chǎn)生更好的光熱效果。

實(shí)施例3

請(qǐng)參見圖3所示，為本發(fā)明實(shí)施例1制備的近紅外探針SWNT-Cy5.5的體外光熱效果圖。圖3為以不同濃度的探針孵育細(xì)胞，再以808nm激光照射殺死細(xì)胞的光熱效果圖，其中以單獨(dú)的SWNT、Cy5.5兩種物質(zhì)做對(duì)照進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞存活率隨著孵育探針濃度的增加而降低，從而說(shuō)明了SWNT-Cy5.5的光熱效果。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。