本發(fā)明涉及一種治療冠心病心絞痛的組合物及其制備方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
冠心寧注射液是含有丹參和川芎的有效提取物的中藥制劑。自70年代開發(fā)研制成水針劑在國內(nèi)上市已有30多年的歷史，是臨床常用的治療心腦血管病的中藥注射劑，具有改善冠脈循環(huán)和抗血凝作用，能顯著增加冠脈血流量，改善心肌供血，預(yù)防和減少血栓的形成，使栓塞范圍縮小。主要用于冠心病、心絞痛的治療。
現(xiàn)上市的冠心寧注射液是按照藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3267-98-2012制備的。其具體制備方法是：丹參、川芎按照1000g∶1000g配伍。以上二味，加水煎煮三次，第一次2小時，第二、三次各1.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度1.16～1.26(70℃)的清膏，加乙醇至含量為85％，冷藏，濾過，濾液用40％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至約8.0～8.5，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，用注射用水稀釋至約1000ml，冷藏，濾過，濾液濃縮至相對密度1.10～1.15(70℃)的清膏，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2～3，冷藏，濾過，濾液以10％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8～7.2，加熱煮沸30分鐘，加適量活性炭，稍冷，濾過，冷藏，加入注射用水適量和亞硫酸氫鈉0.5g，濾過，濾液調(diào)節(jié)pH值至約6.8～7.3，濾液加注射用水至1000ml，濾過，灌封，滅菌，即得。該方法簡單、易操作，但藥品穩(wěn)定性差，質(zhì)量不易控制，尤其是臨床療效有待進(jìn)一步提高。
文獻(xiàn)(大孔吸附樹脂純化注射用冠心寧的工藝研究，中成藥，2008年第30卷第3期，361頁～365頁)公開了一種冠心寧注射液的純化方法，該方法將冠心寧水提醇沉濃縮液用D101型樹脂處理，目的是除掉無效成分，保留有效成分，最終結(jié)果是所得的粗提物固體膏中有效成分(丹酚酸B、原兒茶醛和阿魏酸)的百分含量提高了5倍。但是該法將丹參和川芎水提醇沉濃縮液(混合液)過大孔吸附樹脂柱，未考慮丹參有效成分群及川芎有效成分群的吸附及解吸附性能差異，而兩個有效成分群的分子結(jié)構(gòu)差異較大，其吸附及洗脫的性質(zhì)不同，因此采用大孔吸附樹脂柱對丹參及川芎濃縮混合液進(jìn)行純化時會顧此失彼，很難使兩種有效成分群同時得以最大的富集。專利CN102048821A(一種冠心寧藥物制劑的制備方法，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司)，該法對丹參水提濃縮液和川芎水提濃縮液分別用不同的大孔樹脂純化方法進(jìn)行，克服了上述缺點(diǎn)。但是該工藝仍比較粗放，不能保證批次間產(chǎn)品有效成分含量的穩(wěn)定性，因此有必要進(jìn)一步對該工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以利于進(jìn)一步提升丹參及川芎有效成分的收率及轉(zhuǎn)移率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本申請人對CN102048821A提供的冠心寧藥物制劑制備的工藝進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，使得提取物中丹酚酸B、原兒茶醛、川芎嗪和阿魏酸的收率及轉(zhuǎn)移率均有所提高，且出人意料的發(fā)現(xiàn)采用該法制備的冠心寧組合物具有更好的藥效。
本發(fā)明的首要目的在于提供一種新的冠心寧藥物組合物。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：一種治療冠心病、心絞痛的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物是由下述重量份的原料藥制成的：丹參100份、川芎100份；其制備方法包括丹參提取物的制備和川芎提取物的制備。其中，丹參提取物的制備方法包含如下步驟：取丹參藥材，加入丹參藥材8倍重量份的水煎煮1次，煎煮1小時，再用丹參藥材5倍重量份的水煎煮2次，每次0.5小時；合并煎液，濾過，加入乙醇使含醇量達(dá)80％，冷藏，過濾，濾液濃縮至60℃溫度下相對密度為1.10～1.15，將得到的濃縮液注入HPD600型大孔吸附樹脂柱，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比控制在1:6～1:8之間，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為4:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；洗脫時先用8倍量柱體積的純化水洗脫，再用8倍量柱體積20％乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用6倍量柱體積75％乙醇洗脫，收集75％乙醇洗脫液；將得到的洗脫液濃縮至干得丹參提取物。川芎提取物的制備方法包含如下步驟：取川芎藥材，加入川芎8倍重量份的70％乙醇回流提取1次，提取2小時，再用川芎6倍重量份的70％乙醇回流提取2次，每次提取1小時；合并提取液，濾過，濃縮至60℃溫度下相對密度為1.10～1.15；將得到的濃縮液注入NKA型大孔吸附樹脂柱，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比控制在1:6～1:8之間，洗脫條件為：川芎與干樹脂的重量比為5:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；洗脫時，先用5倍量柱體積的純化水洗脫，再用5倍量柱體積30％乙醇洗脫，棄去洗脫液，然后用4倍量柱體積的60％乙醇洗脫，收集60％乙醇洗脫液；將得到的洗脫液濃縮至干得川芎提取物。
作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案：本發(fā)明組合物所述丹參提取物的制備方法中采用的HPD600型大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:7。
作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案：本發(fā)明組合物所述川芎提取物的制備方法中采用的NKA型大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:7。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種新的冠心寧藥物組合物的制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：一種本發(fā)明組合物的制備方法，包括丹參提取的制備和川芎提取物的制備。其中，丹參提取物的制備方法包含如下步驟：取丹參藥材，加入丹參藥材8倍重量份的水煎煮1次，煎煮1小時，再用丹參藥材5倍重量份的水煎煮2次，每次0.5小時；合并煎液，濾過，加入乙醇使含醇量達(dá)80％，冷藏，過濾，濾液濃縮至60℃溫度下相對密度為1.10～1.15，將得到的濃縮液注入HPD600型大孔吸附樹脂柱，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比控制在1:6～1:8之間，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為4:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；洗脫時先用8倍量柱體積的純化水洗脫，再用8倍量柱體積20％乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用6倍量柱體積75％乙醇洗脫，收集75％乙醇洗脫液；將得到的洗脫液濃縮至干得丹參提取物。川芎提取物的制備方法包含如下步驟：取川芎藥材，加入川芎8倍重量份的70％乙醇回流提取1次，提取2小時，再用川芎6倍重量份的70％乙醇回流提取2次，每次提取1小時；合并提取液，濾過，濃縮至60℃溫度下相對密度為1.10～1.15；將得到的濃縮液注入NKA型大孔吸附樹脂柱，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比控制在1:6～1:8之間，洗脫條件為：川芎與干樹脂的重量比為5:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；洗脫時，先用5倍量柱體積的純化水洗脫，再用5倍量柱體積30％乙醇洗脫，棄去洗脫液，然后用4倍量柱體積的60％乙醇洗脫，收集60％乙醇洗脫液；將得到的洗脫液濃縮至干得川芎提取物。
作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案：本發(fā)明組合物制備方法中所述丹參提取物的制備方法中采用的HPD600型大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:7。
作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案：本發(fā)明組合物制備方法中所述川芎提取物的制備方法中采用的NKA型大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:7。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種新治療冠心病、心絞痛的制劑。采用的技術(shù)方案是，所述制劑是本發(fā)明上述組合物和藥用輔料一起混合，按常規(guī)方法制備而成，所述制劑優(yōu)選片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、注射劑。所述藥用輔料可以選自粘合劑、稀釋劑、崩解劑、甜味劑、抗氧化劑等。
本發(fā)明的第四個目的在于提供一種治療冠心病、心絞痛的注射劑。采用技術(shù)方案是所述注射劑是本發(fā)明上述組合物和藥用輔料一起混合，按常規(guī)方法制備而成注射劑，藥用輔料優(yōu)選包含L-甲硫氨酸。發(fā)明人在輔料篩選的過程中發(fā)現(xiàn)，采用L-甲硫氨酸作為抗氧化劑可以使得本發(fā)明組合物制備的注射液的pH值在貯存過程中保持穩(wěn)定。
本發(fā)明的第五個目的在于提供一種治療冠心病、心絞痛的注射劑的制備方法。采用的技術(shù)方案為：所述注射劑的制備方法包括如下步驟：將本發(fā)明上述組合物混合均勻，加注射用水，調(diào)pH值至6.8～7.2，加熱煮沸，冷卻，冷藏，超濾，加入L-甲硫氨酸，定容，調(diào)節(jié)pH值至6.8～7.3，過濾，灌封，滅菌。本方法采用的是“超濾”除去熱源的方法。申請人在研究中發(fā)現(xiàn)，采用活性炭吸附法除去熱源，即使活性炭的加入量僅為溶液體積的0.02％，仍有較大量的主成分損失，因而不宜采用該法去除熱原。另外的研究結(jié)果也表明阻隔分子量＞10000的超濾膜會造成本發(fā)明注射液主成分較大的損失，而阻隔分子量為10000的超濾膜處理樣品后，丹酚酸B、原兒茶醛的總損失量僅為2％，阿魏酸及川芎嗪的總損失量約為3％。因此確定選用阻隔分子量為10000的超濾膜去除熱原，作為進(jìn)一步的優(yōu)選技術(shù)方案。
與現(xiàn)有技術(shù)CN102048821A相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
1、動物試驗表明，本發(fā)明組合物具有更好的藥效。這可能是與本發(fā)明組合物主要藥物有效成分含量較高有關(guān)，同時更可能也與其他非主要有效成分得以保留，且各成分配比能更好的發(fā)揮協(xié)同作用有關(guān)。
2、CN102048821A沒有對其組合物的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)進(jìn)行研究，有可能造成批次之間組合物主要或非主要有效成分得率及各成分之間的配比差異巨大，通過該法制備的藥物組合物藥效不穩(wěn)定，不能滿足藥物安全性及有效性要求。本發(fā)明組合物的制備方法是在進(jìn)一步優(yōu)化CN102048821A公開的技術(shù)的基礎(chǔ)上而獲得，對冠心寧組合物制備方法關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了控制，從而保證了藥品質(zhì)量、藥品藥效穩(wěn)定的要求。
具體實(shí)施方案
下述是結(jié)合具體實(shí)施例和實(shí)驗例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例和實(shí)驗例僅限于說明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍。
第一部分：生產(chǎn)工藝研究
1、丹參提取工藝
藥用丹參具有多方面的藥理作用：對心血管系統(tǒng)可增加冠脈流量，降低心肌興奮性和傳導(dǎo)性，改善微循環(huán)，抗血小板的聚集和血栓形成，使血液粘度下降，抗氧化，增強(qiáng)耐氧能力，抗菌消炎，改善腎功能，對腦組織缺血和再灌注損傷的保護(hù)等作用。丹參的有效成分可分為脂溶性的和水溶性的，其中，水溶性成分以丹參總酚酸為主，主要有丹參素鈉、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C等。因此，為了得到丹參中的有效部位—丹參總酚酸，申請人對其提取工藝進(jìn)行了考察和優(yōu)化，使總酚酸盡可能提出，又利用大孔吸附樹脂純化技術(shù)，使總酚酸達(dá)到了最大程度的富集，以達(dá)到有效部位投料的中藥注射劑的技術(shù)要求。
具體試驗方法為：取丹參飲片100g，采用水回流條件下提取，合并提取液放置至室溫后，過濾，濾液減壓濃縮并蒸干，用水溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液5ml，用乙酸乙酯萃取4次，用量分別為20ml、10ml、10ml、10ml，合并乙酸乙酯萃取部分，減壓蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，測定原兒茶醛的含量。表1列出了具有代表性的部分試驗的結(jié)果。
表1 丹參總酚酸提取工藝考察試驗結(jié)果
申請人在試驗中發(fā)現(xiàn)，隨著提取次數(shù)的增多及提取時間的延長，原兒茶醛的溶出有提高的趨勢的原因，但考慮時間及成本申請人最終確定的是先采用丹參藥材8倍重量份的水煎煮1次，煎煮1小時，再用丹參藥材5倍重量份的水煎煮2次，每次0.5小時。
2、丹參純化工藝
丹參經(jīng)提取后，考慮到醇沉工藝會將酚酸類成分包裹在其中而損失，同時考慮水提濃縮液中含糖份較高，粘性較大，不利于大孔樹脂洗脫，故考慮僅采用一次醇沉工藝，再進(jìn)行大孔樹脂洗脫。采用大孔吸附樹脂柱層析法除雜，糖類、氨基酸、多肽等水溶性雜質(zhì)都可以被水洗脫除去，再用一定濃度的乙醇將總酚酸洗脫下來，故提取液減壓回收乙醇至一定相對密度，直接注入大孔吸附樹脂柱，用不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，就可以起到除雜精制丹參總酚酸的作用。申請人經(jīng)過大量的試驗篩選，發(fā)現(xiàn)HPD600型大孔吸附樹脂對丹參總酚酸的吸附容量和解吸附的綜合效果最好，因此本發(fā)明采用HPD600型大孔吸附樹脂對丹參提取物進(jìn)行純化。
試驗方法：取不同直徑的樹脂柱(Φ＝3cm，4cm，5cm)，將丹參提取物濃縮液分別用按照徑高比加入不同重量的已處理好的HPD600型大孔吸附樹脂純化，先用8倍量柱體積的純化水洗脫，再用8倍量柱體積20％乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用6倍量柱體積75％乙醇洗脫，收集75％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至干，用60％乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，并用60％乙醇稀釋至刻度，搖勻。測定原兒茶醛和丹酚酸B的含量。表2列出了具有代表性的部分試驗的結(jié)果。
表2 丹參總酚酸純化工藝考察試驗結(jié)果
試驗結(jié)果表明，在丹參提取物純化過程中大孔吸附樹脂柱的徑高比控制在1:6～1:8之間，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為4:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min時，樹脂的出膏率及原兒茶醛和丹酚酸B的轉(zhuǎn)移率等比較理想。
3、川芎提取工藝
藥用川芎是傘形科植物川芎的干燥根莖，其有效成分有：生物堿類的川芎嗪、有機(jī)酸類的阿魏酸等。川芎嗪對心血管系統(tǒng)有強(qiáng)大活性，對血管平滑肌有解痙作用，對由腎上腺素或氯化鉀引起的主動脈收縮有明顯拮抗作用；能提高血小板中cAMP含量，對血栓烷A2(TXA2)的活性和生物合成有抑制作用；有平滑肌解痙作用。阿魏酸也有類似的作用。因此我們對提取工藝進(jìn)行了考察和優(yōu)化，使川芎嗪、有機(jī)酸類成分盡可能溶出，而其他雜質(zhì)較少溶出，又利用大孔吸附樹脂純化技術(shù)，使有效成分達(dá)到了最大程度富集，滿足有效部位投料的中藥注射劑的技術(shù)要求。
試驗方法為：以川芎總提取物中的川芎嗪和阿魏酸為指標(biāo)，考察提取時間、提取次數(shù)及溶媒用量等因素對川芎活性成分提取收率的影響。具體為取川芎藥材100g，采用不同濃度乙醇溶液回流條件下提取，合并提取液放置至室溫后，過濾，濾液減壓濃縮并蒸干，測定阿魏酸和川芎嗪的相對含量(以峰面積計)。表3列出了具有代表性的部分試驗的結(jié)果。
表3 川芎提取工藝考察試驗結(jié)果
試驗結(jié)果表明，綜合考慮阿魏酸及川芎嗪兩種有效成分提取率，70％濃度乙醇的提取效果較好。隨著提取次數(shù)的增多及提取時間的延長，阿魏酸及川芎嗪的溶出有提高的趨勢的原因，但考慮時間及成本申請人最終確定川芎8倍重量份的70％乙醇回流提取1次，提取2小時，再用川芎6倍重量份的70％乙醇回流提取2次，每次提取1小時。
4、川芎純化工藝
提取溶劑采用70％的乙醇，溶出的多糖量不太多，將提取液直接放在5℃冷庫中靜置一夜，只有少量多糖被沉淀下來，調(diào)乙醇濃度到85％醇沉一次又有部分多糖沉淀下來，由于考慮到醇沉?xí)⑽核岬扔行С煞职谄渲卸鴵p失，而且工藝較為繁瑣，成本也高，并不是最好的純化方法。另外，經(jīng)提取后的提取液中有少量糖類、氨基酸和多肽等成分，純化過程中要盡可能的除去這些雜質(zhì)，從而提高川芎提取有效成分的含量。根據(jù)這些化合物的性質(zhì)，申請人選擇了大孔樹脂吸附法對川芎有效活性成分進(jìn)行分離純化。采用大孔吸附樹脂法除雜，糖類、氨基酸等雜質(zhì)可被水洗脫除去，再用一定濃度的乙醇將總酚酸洗脫下來，故提取液減壓回收乙醇至一定相對密度，不必醇沉，直接注入大孔吸附樹脂柱處理，就可以起到除雜精制川芎提取物的作用。
申請人經(jīng)過大量的試驗篩選，發(fā)現(xiàn)NKA型大孔吸附樹脂對川芎提取物的吸附容量和解吸附的綜合效果最好，因此本發(fā)明采用NKA型大孔吸附樹脂對川芎提取物進(jìn)行純化。
試驗方法：取不同直徑的樹脂柱(Φ＝3cm，4cm，5cm)，將川芎提取物濃縮液分別用按照徑高比加入不同重量的已處理好的NKA型大孔吸附樹脂純化，先用水洗脫至無糖反應(yīng)，再用30％乙醇洗脫5倍柱床體積，再用60％乙醇洗脫4倍柱床體積。收集60％乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至干，再用無水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，測定麥阿魏酸及川芎嗪的量。表4列出了具有代表性的部分試驗的結(jié)果。
表4 川芎提取物純化工藝考察試驗結(jié)果
試驗結(jié)果表明，在川芎提取物純化過程中大孔吸附樹脂柱的徑高比控制在1:6～1:8之間，洗脫條件為：川芎與干樹脂的重量比為5:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min時，樹脂的出膏率及阿魏酸和川芎嗪的轉(zhuǎn)移率等比較理想。
二、組合物及制劑的制備
實(shí)施例1
組方：
丹參 100g 川芎 100g
制備方法：
稱取丹參藥材，用800g的水煎煮1次，煎煮1個小時，再用500g的水煎煮2次，每次半小時；合并煎液，降至室溫，過濾，加入乙醇使含醇量達(dá)80％，冷藏，過濾，濾液濃縮至60℃溫度下相對密度為1.10～1.15，將得到的濃縮液注入HPD600型大孔吸附樹脂柱，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:6，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為4:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；洗脫時先用8倍量柱體積的純化水洗脫，再用8倍量柱體積20％乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用6倍量柱體積75％乙醇洗脫，收集75％乙醇洗脫液；將得到的洗脫液濃縮至干得丹參提取物，其中丹酚酸B和原兒茶醛含量之和為18.47％，丹酚酸B和原兒茶醛含量的轉(zhuǎn)移率為88.39％，丹參總酚酸含量41.47％。
取川芎藥材，加入800g的70％乙醇回流提取1次，提取2小時，再用600g的70％乙醇回流提取2次，提取1小時；合并提取液，冷藏，過濾，濃縮至60℃溫度下相對密度為1.10～1.15；將得到的濃縮液注入NKA型大孔吸附樹脂柱，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:6，洗脫條件為：川芎與干樹脂的重量比為5:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；洗脫時，先用5倍量柱體積的純化水洗脫，再用5倍量柱體積30％乙醇洗脫，棄去洗脫液，然后用4倍量柱體積的60％乙醇洗脫，收集60％乙醇洗脫液；將得到的洗脫液濃縮至干得川芎提取物，其中川芎嗪和阿魏酸含量之和為7.81％，川芎嗪和阿魏酸轉(zhuǎn)移率84.07％。
將丹參提取物和川芎提取物混合均勻即得本發(fā)明組合物。
實(shí)施例2
組方：
丹參 100g 川芎 100g
制備方法：
稱取丹參藥材，用800g的水煎煮1次，煎煮1個小時，再用500g的水煎煮2次，每次半小時；合并煎液，降至室溫，過濾，加入乙醇使含醇量達(dá)80％，冷藏，過濾，濾液濃縮至60℃溫度下相對密度為1.10～1.15，將得到的濃縮液注入HPD600型大孔吸附樹脂柱，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:7，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為4:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；洗脫時先用8倍量柱體積的純化水洗脫，再用8倍量柱體積20％乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用6倍量柱體積75％乙醇洗脫，收集75％乙醇洗脫液；將得到的洗脫液濃縮至干得丹參提取物，其中丹酚酸B和原兒茶醛含量之和為22.61％，丹酚酸B和原兒茶醛含量的轉(zhuǎn)移率為90.24％，丹參總酚酸含量40.53％。
取川芎藥材，加入800g的70％乙醇回流提取1次，提取2小時，再用600g的70％乙醇回流提取2次，提取1小時；合并提取液，冷藏，過濾，濃縮至60℃溫度下相對密度為1.10～1.15；將得到的濃縮液注入NKA型大孔吸附樹脂柱，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:7，洗脫條件為：川芎與干樹脂的重量比為5:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；洗脫時，先用5倍量柱體積的純化水洗脫，再用5倍量柱體積30％乙醇洗脫，棄去洗脫液，然后用4倍量柱體積的60％乙醇洗脫，收集60％乙醇洗脫液；將得到的洗脫液濃縮至干得川芎提取物，其中川芎嗪和阿魏酸含量之和為7.52％，川芎嗪和阿魏酸轉(zhuǎn)移率85.64％。
將丹參提取物和川芎提取物混合均勻即得本發(fā)明組合物。
實(shí)施例3
組方：
丹參 100g 川芎 100g
制備方法：
稱取丹參藥材，用800g的水煎煮1次，煎煮1個小時，再用500g的水煎煮2次，每次半小時；合并煎液，降至室溫，過濾，加入乙醇使含醇量達(dá)80％，冷藏，過濾，濾液濃縮至60℃溫度下相對密度為1.10～1.15，將得到的濃縮液注入HPD600型大孔吸附樹脂柱，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:8，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為4:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；洗脫時先用8倍量柱體積的純化水洗脫，再用8倍量柱體積20％乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用6倍量柱體積75％乙醇洗脫，收集75％乙醇洗脫液；將得到的洗脫液濃縮至干得丹參提取物，其中丹酚酸B和原兒茶醛含量之和為18.74％，丹酚酸B和原兒茶醛含量的轉(zhuǎn)移率為86.11％，丹參總酚酸含量41.98％。
取川芎藥材，加入800g的70％乙醇回流提取1次，提取2小時，再用600g的70％乙醇回流提取2次，提取1小時；合并提取液，冷藏，過濾，濃縮至60℃溫度下相對密度為1.10～1.15；將得到的濃縮液注入NKA型大孔吸附樹脂柱，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:8，洗脫條件為：川芎與干樹脂的重量比為5:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；洗脫時，先用5倍量柱體積的純化水洗脫，再用5倍量柱體積30％乙醇洗脫，棄去洗脫液，然后用4倍量柱體積的60％乙醇洗脫，收集60％乙醇洗脫液；將得到的洗脫液濃縮至干得川芎提取物，其中川芎嗪和阿魏酸含量之和為8.65％，川芎嗪和阿魏酸轉(zhuǎn)移率87.34％。
實(shí)施例4
將實(shí)施例1組合物，溶于2L注射用水，調(diào)pH值至6.8，加熱煮沸，冷卻，冷藏，用阻隔分子量為10000的超濾膜超濾，加入L-甲硫氨酸，定容，調(diào)節(jié)pH值至6.8，過濾，灌封，滅菌，制得注射液。
實(shí)施例5
將實(shí)施例2組合物，溶于2L注射用水，調(diào)pH值至7.0，加熱煮沸，冷卻，冷藏，用阻隔分子量為10000的超濾膜超濾，加入L-甲硫氨酸，定容，調(diào)節(jié)pH值至7.0，過濾，灌封，滅菌，制得注射液。
實(shí)施例6
將實(shí)施例3組合物，溶于2L注射用水，調(diào)pH值至7.2，加熱煮沸，冷卻，冷藏，用阻隔分子量為10000的超濾膜超濾，加入L-甲硫氨酸，定容，調(diào)節(jié)pH值至7.3，過濾，灌封，滅菌，制得注射液。
對比例1
組方：
丹參 100g 川芎 100g
制備方法：
按CN102048821A實(shí)施例1方法制備丹參提取物，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:7，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為4:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；采用該法制備丹參提取物，丹酚酸B和原兒茶醛含量之和為14.57％，丹酚酸B和原兒茶醛含量的轉(zhuǎn)移率為76.18％，丹參總酚酸含量37.62％。
按CN102048821A實(shí)施例1方法制備川芎提取物，所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:6，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為5:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；采用該法制備川芎提取物，其中川芎嗪和阿魏酸含量之和為7.24％，川芎嗪和阿魏酸轉(zhuǎn)移率67.04％。
將上述丹參提取物和川芎提取物混合均勻即得對比例1組合物。
對比例2
組方：
丹參 100g 川芎 100g
制備方法：
按CN102048821A實(shí)施例2方法制備丹參提取物，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:7，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為4:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；采用該法制備丹參提取物，丹酚酸B和原兒茶醛含量之和為17.14％，丹酚酸B和原兒茶醛含量的轉(zhuǎn)移率為83.40％，丹參總酚酸含量37.67％。
按CN102048821A實(shí)施例2方法制備川芎提取物，所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:6，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為5:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；采用該法制備川芎提取物，其中川芎嗪和阿魏酸含量之和為5.45％，川芎嗪和阿魏酸轉(zhuǎn)移率71.04％。
將上述丹參提取物和川芎提取物混合均勻即得對比例2組合物。
對比例3
組方：
丹參 100g 川芎 100g
制備方法：
按CN102048821A實(shí)施例3方法制備丹參提取物，其中所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:7，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為4:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；采用該法制備丹參提取物，丹酚酸B和原兒茶醛含量之和為17.51％，丹酚酸B和原兒茶醛含量的轉(zhuǎn)移率為80.16％，丹參總酚酸含量40.92％。
按CN102048821A實(shí)施例3方法制備川芎提取物，所述大孔吸附樹脂柱的徑高比為1:6，洗脫條件為：丹參與干樹脂的重量比為5:1，吸附流速3ml/min，洗脫流速4ml/min；采用該法制備川芎提取物，其中川芎嗪和阿魏酸含量之和為5.45％，川芎嗪和阿魏酸轉(zhuǎn)移率62.74％。
將上述丹參提取物和川芎提取物混合均勻即得對比例3組合物。
對比例4
將對比例1組合物，溶于2L注射用水，調(diào)pH值至6.8，加熱煮沸，冷卻，冷藏，用阻隔分子量為10000的超濾膜超濾，加入L-甲硫氨酸，定容，調(diào)節(jié)pH值至6.8，過濾，灌封，滅菌，制得注射液。
對比例5
將對比例2組合物，溶于2L注射用水，調(diào)pH值至7.0，加熱煮沸，冷卻，冷藏，用阻隔分子量為10000的超濾膜超濾，加入L-甲硫氨酸，定容，調(diào)節(jié)pH值至6.8，過濾，灌封，滅菌，制得注射液。
對比例6
將對比例3組合物，溶于2L注射用水，調(diào)pH值至7.2，加熱煮沸，冷卻，冷藏，用阻隔分子量為10000的超濾膜超濾，加入L-甲硫氨酸，定容，調(diào)節(jié)pH值至7.3，過濾，灌封，滅菌，制得注射液。
第三部分：藥效學(xué)試驗
試驗例1、對大鼠心肌缺血作用的比較
SD大鼠，雄性，體重250-350g，實(shí)驗動物隨機(jī)分為7組，模型組(等容量生理鹽水)、實(shí)施例4組(10mg/kg)、實(shí)施例5組(10mg/kg)、實(shí)施例6組(10mg/kg)、對比例4組(10mg/kg)、對比例5組(10mg/kg)、對比例6組(10mg/kg)。10只/組，戊巴比妥納(30mg/Kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，氣管插管，連接呼吸機(jī)，潮氣量1ml，頻率14次/min，呼吸比3∶1。調(diào)節(jié)生理刻錄儀，右頸總動脈插管，連接壓力轉(zhuǎn)換器測量動脈收縮壓(SBP)舒張壓(BDP)。連接肢體導(dǎo)聯(lián)測定ECG II，待穩(wěn)定后記錄各參數(shù)正常值，左胸部去毛消毒，沿左鎖骨中線，在第3或第4肋間開胸，暴露心臟，剪開心包，輕壓右側(cè)胸廓，微微擠出心臟，在左心耳下緣距肺動脈圓錐根部約2mm，以左冠狀靜脈為標(biāo)志，將無損縫合針刺入心肌約0.5mm，結(jié)扎左冠狀動脈前降支。立即將心臟送回胸腔，胸外按摩，縫合胸腔，待自主呼吸恢復(fù)后拔掉呼吸機(jī)。靜脈注射給藥，在其后0、10、30、60、90、120min分別記錄各項指標(biāo)。試驗結(jié)果見表5.
表5 本發(fā)明組合物對冠脈結(jié)扎大鼠心電圖J點(diǎn)變化的影響(n＝10)
注：與模型組相比*P<0.05；**P<0.01
結(jié)果表明，本發(fā)明注射液與對比例注射液都具有一定降低J點(diǎn)的作用，與模型組比較均有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)，且本發(fā)明注射液的治療作用均強(qiáng)于對比例注射液。
試驗例2、對犬急性心急缺血冠脈流量的影響
健康成年Beagle犬，體重12kg±2kg，普通級，雌雄不拘。隨機(jī)分為模型組、實(shí)施例4組(0.3g/kg)、實(shí)施例5組(0.3g/kg)、實(shí)施例6組(0.3g/kg)、對比例4組(0.3g/kg)、對比例5組(0.3g/kg)、對比例6組(0.3g/kg)。麻醉下結(jié)扎犬冠狀動脈左前降支造成急性心肌缺血模型。動物稱重后以3％戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈麻醉。固定，氣管插管，接DG電動人工呼吸機(jī)，待開胸后行機(jī)械通氣，呼吸頻率16～18次/min，潮氣量350～550mL。分離左側(cè)頸動脈，插入動脈插管(管內(nèi)充滿1000U/ml的肝素生理鹽水)，以測量動脈血壓。分離頸靜脈，插入靜脈插管至冠狀靜脈竇(管內(nèi)充滿1000U/ml的肝素生理鹽水)，以備抽血用。分離股靜脈，插管并予以生理鹽水補(bǔ)液。監(jiān)測、記錄心電圖(ECG)變化。沿腹部正中線開腹，分離十二指腸并穿棉線，以備給藥用。沿胸骨左緣第4肋間開胸，暴露心臟，剪開心包并作心包吊床。分離冠狀動脈左旋支，放置25mm內(nèi)徑的電磁血流量儀探頭，連接于MFV-3200電磁血流量儀上，測量冠脈流量(CBF)。以上指標(biāo)均同步記錄于RM-6000八道生理儀。以左冠狀動脈前降支第2～3分支間游離冠狀動脈，并在其下穿2根絲線，備用于二步結(jié)扎。首次結(jié)扎前2min，利多卡因5mg/kg，股靜脈注射預(yù)防心律失常。在結(jié)扎時將一段直徑1mm的鋼絲插入第1松結(jié)內(nèi)。完全結(jié)扎后15min開始記錄，作為用藥前對照值，經(jīng)十二指腸給予配制好的等體積實(shí)驗藥物或生理鹽水。分別于給藥后10、30、60、90、120min記錄冠脈流量，計算心肌血流量。試驗結(jié)果見表6.
表6 本發(fā)明組合物對急性心肌缺血犬心肌血流量的影響(n＝10)
注：與模型組相比*P<0.05；**P<0.01
表6結(jié)果表明，本發(fā)明組合物制備的注射液和對比例組合物制備的注射液對心肌缺血犬心肌血流量均有影響，且本發(fā)明組合物注射液的效果明顯優(yōu)于對比例組合物注射液。
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