本發(fā)明涉及一種益生菌微膠囊的新用途，尤其是一種益生菌微膠囊在制備抑制病原菌生物被膜藥物中的應用。
背景技術：
細菌生物被膜是指附著于生命或無生命物體表面被細菌胞外大分子包裹的有組織的細菌群體，是大部分病原菌的生長方式[O'Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R., Biofilm formation as microbial development, Annual Review of Microbiology, 2000,54:49-79；Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lappin-Scott H.M., Microbial biofilms, Annual Review of Microbiology,1995,49:711-745.]。致病菌在腸道、尿道、牙齒表面和醫(yī)療器械表面等形成的生物被膜往往導致感染，同時，被膜內細菌對抗生素耐藥性提高了1000倍以上，是反復感染的重要原因之一，并保護病原菌抵御宿主的免疫應答[Jesaitis AJ, Franklin MJ, Berglund D, et al, Compromised host defense on Pseudomonas aeruginosa biofilms: characterization of neutrophil and biofilm interactions, J.Immunol, 2003,171(8):4329-4339；Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial bio?lms: a common cause of persistent infections, Science, 1999, 284: 1318-1322.]；研究證實，生物被膜的形成受微生物群體感應系統(tǒng)調控，因此，如何抑制病原菌群體感應的發(fā)生進而抑制生物被膜的形成具有重要臨床和現(xiàn)實意義。
益生菌微膠囊是用各種高分子化合物連續(xù)薄膜（壁或外相）將諸如乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis）、雙歧桿菌（Bifidobacteria）、乳酸桿菌 （Lactobacillus lactis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等益生菌包埋起來，可有效提高益生菌的活性及存活率。雖然目前已有關于益生菌抵抗病原菌的相關報道。但作用機理基本上有如下三種：第一種是通過與病原菌競爭腸道黏附位點抑制病原菌定植；第二種是通過益生菌自身分泌的抗菌素等抑制病原菌；第二種是通過分泌的氨基酸、蛋白質等刺激宿主免疫系統(tǒng)，提高宿主免疫力抑制病原菌；迄今為止，并沒有關于益生菌微膠囊可直接抑制病原菌生物被膜的相關報道。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術所存在的上述技術問題，提供一種益生菌微膠囊在制備抑制病原菌生物被膜藥物中的應用。
本發(fā)明是發(fā)現(xiàn)了益生菌微膠囊可高表達群體感應信號分子，通過群體感應信號分子的介導，具備了抑制病原菌生物被膜形成的功能，從而發(fā)明了益生菌微膠囊在制備抑制病原菌生物被膜藥物中的應用。
本發(fā)明發(fā)明了益生菌微膠囊的新用途，即同游離病原菌共培養(yǎng)后可以直接抑制病原菌生物被膜形成，有效殺滅病原菌。
具體實施方式
實施例1：
第一步：將5×108個乳酸菌細胞混懸在1mL海藻酸鈉溶液（8 g/L）中，利用靜電液滴法使液滴噴射入1.0 mol/L的CaCl2溶液，反應30 min，得到海藻酸鈣凝膠微球粒徑為300 μm粒徑分布呈正態(tài)分布，具有良好的單分散性；
第二步：將上述水凝膠微球浸入質量濃度0.5%殼聚糖溶液中，微球與殼聚糖溶液體積比為1:10，反應10 min，此時得到包埋有乳酸菌的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊，取出用生理鹽水洗滌；
第三步：將第二步中的微膠囊浸入40-70 mmol/L檸檬酸鈉溶液中，液化微膠囊內部的海藻酸鹽凝膠，反應5 min，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內部液態(tài)核心的微膠囊；
第四步：將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌懸液用LB培養(yǎng)基稀釋至濃度為108 CFU/mL；分別取相同細胞數(shù)的第三步制得的乳酸菌微膠囊和1 nM信號分子與前述稀釋的大腸桿菌菌懸液混合，同時取大腸桿菌純培養(yǎng)液，分別作為實驗組、陽性對照組和空白對照組，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。
用細菌稀釋涂平板方法檢測，結果：實驗組與空白對照組相比，大腸桿菌生物被膜形成量下降了65%；實驗組與與陽性對照組相比，大腸桿菌生物被膜形成量下降了3.3%，說明益生菌微膠囊與游離菌體共培養(yǎng)后可顯著抑制生物被膜形成。同時，前期實驗采用哈氏弧菌生物檢測方法對相同細胞數(shù)量（109CFU）的乳酸菌微膠囊與游離乳酸菌產(chǎn)生的AI-2信號分子進行考察比較，結果表明，相同細胞數(shù)量下，乳酸菌微囊化AI-2產(chǎn)生量顯著高于游離乳酸菌。
實施例2：
第一步：將5×108鼠李糖乳桿菌細胞混懸在1 mL混合有CaCO3的海藻酸鈉溶液（8 g/L）中，海藻酸鈉與油相體積比為1:5，表面活性劑添加量為0.5%（v/v），乳化20 min，加入HAC引發(fā)凝膠化反應；得到海藻酸鈣水凝膠微球；
第二步：將上述水凝膠微球浸入到質量濃度0.3%殼聚糖溶液中，微球與殼聚糖溶液體積比為1:10，反應20 min，此時得到包埋有鼠李糖乳桿菌的海藻酸鈉-聚陽離子微膠囊，取出用生理鹽水洗滌；
第三步：將第二步中的微膠囊浸入40-70 mmol/L檸檬酸鈉溶液中，液化微膠囊內部的海藻酸鹽凝膠，反應5 min，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內部液態(tài)核心的微膠囊；
第四步：將過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌菌懸液用大豆酪蛋白消化瓊脂培養(yǎng)基稀釋至濃度為108 CFU/mL，分別取相同細胞數(shù)的第三步制得的鼠李糖乳桿菌微膠囊和1 nM信號分子與前述稀釋的銅綠假單胞菌菌懸液混合，同時取銅綠假單胞菌純培養(yǎng)液，分別作為實驗組、陽性對照組和空白對照組，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。
用RT-PCR方法檢測，結果：實驗組銅綠假單胞菌與生物被膜形成相關的luxS基因表達與空白對照組及陽性對照組相比，分別下調3倍和4倍，實驗組的群體感應的信號分子AI-2濃度隨培養(yǎng)時間延長也呈上升趨勢。同時前期實驗采用哈氏弧菌生物檢測方法對相同細胞數(shù)量（109CFU）的鼠李糖乳桿菌微膠囊產(chǎn)生的AI-2信號分子與游離鼠李糖乳桿菌進行考察比較，結果表明，相同細胞數(shù)量下，鼠李糖乳桿菌微膠囊AI-2產(chǎn)生量顯著高于游離鼠李糖乳桿菌。
實施例3：
第一步：將5×108乳酸鏈球菌細胞混懸在10 mL海藻酸鈉溶液 （8 g/L）中，海藻酸鈉與油相體積比為1:10，表面活性劑添加量為0.1 （v/v）乳化10 min，加入CaCl2引發(fā)凝膠化反應，得到海藻酸鈣水凝膠微球。
第二步：將上述水凝膠微球浸入質量濃度0.3%聚賴氨酸溶液中，微球與聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應15 min，此時得到包埋有乳酸鏈球菌的海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊，取出用生理鹽水洗滌；
第三步：將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌懸液用BP培養(yǎng)基稀釋至濃度為108 CFU/mL，分別取相同細胞數(shù)的第二步制得的乳酸鏈球菌微膠囊和1 nM信號分子與前述稀釋的金黃色葡萄球菌菌懸液混合，同時取金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)液，分別作為實驗組、陽性對照組和空白對照組，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。
用RT-PCR方法檢測，結果：實驗組中金黃色葡萄球菌與生物被膜形成相關的norB, norC和seo基因表達與空白對照組相比分別下調了20、8、和9倍；與陽性對照組相比分別下調了1、2和4倍。同時前期實驗采用哈氏弧菌生物檢測方法對相同細胞數(shù)量（109CFU）的乳酸鏈球菌微膠囊產(chǎn)生的AI-2信號分子與游離乳酸鏈球菌進行考察比較，結果表明，相同細胞數(shù)量下，乳酸鏈球菌微膠囊AI-2產(chǎn)生量顯著高于游離乳酸鏈球菌。