本發(fā)明屬于醫(yī)療止血海綿領(lǐng)域，具體的涉及一種膠原蛋白/氧化微晶纖維素復(fù)合材料的制備。

背景技術(shù)：

一項(xiàng)成功外科手術(shù)依賴于有效的止血方法，因此，各種各樣的止血?jiǎng)┖椭寡椒ú粩嗟谋婚_發(fā)出來?？谇坏慕馄式Y(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，手術(shù)中出血很難控制，因此口腔手術(shù)往往面臨著較高的風(fēng)險(xiǎn)。以膠原為基礎(chǔ)的止血?jiǎng){借其優(yōu)秀的生物相容性、可吸收性和高效的止血性能，被越來越廣泛的應(yīng)用于上頜骨手術(shù)等各種精細(xì)手術(shù)中，并且在細(xì)胞調(diào)控中發(fā)揮重要的功能性作用。但單一組分的生物材料在處理術(shù)中和術(shù)后的快速出血是有局限性的，往往不能達(dá)到理想的止血效力和生物學(xué)影響。尤其在口腔和上頜手術(shù)中，是否能夠快速止血更是成為了手術(shù)成敗的關(guān)鍵，因此，可應(yīng)用于臨床的、能夠快速止血的可吸收生物材料具有非常重要的地位。臨床反應(yīng)多數(shù)的海綿材料更新太慢，并且很容易粘在手術(shù)器械上，因此，眾多的生物材料和止血?jiǎng)┰谂R床上被聯(lián)合使用，如使用微纖維膠原和明膠海綿聯(lián)用、藍(lán)紫色發(fā)光二極管照射聯(lián)合使用止血明膠海綿等方法，以提高手術(shù)質(zhì)量。然而，這類方法明顯的提高了手術(shù)的成本，并且增加了手術(shù)的難度。因此，制備經(jīng)過一系列物理化學(xué)處理、逐步進(jìn)行改性以符合各種生物學(xué)要求的復(fù)合材料成為本領(lǐng)域不斷研發(fā)的課題。而目前為止使用氧化微晶纖維素(OMC)和膠原復(fù)合制作的止血海綿還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型高效復(fù)合止血海綿及其制備方法即一種氧化微晶纖維素/膠原蛋白復(fù)合止血海綿及其制備方法，該復(fù)合止血海綿，是將氧化微晶纖維素及I型膠原蛋白按一定比例進(jìn)行交聯(lián)，所制備的止血海綿加速了止血進(jìn)程，且無生物毒性、能在體內(nèi)迅速降解。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種氧化微晶纖維素/膠原蛋白復(fù)合止血海綿，采用膠原蛋白和氧化微晶纖維素復(fù)合；按重量百分比，氧化微晶纖維素的含量為0.25-1％。

一種氧化微晶纖維素/膠原蛋白復(fù)合止血海綿的制備方法，包括如下步驟：

1)制備膠原蛋白海綿的備用；

2)制備氧化微晶纖維素備用；

3)制備復(fù)合止血海綿：將步驟1)制備的膠原蛋白海綿配制成膠原蛋白溶液，向膠原 蛋白溶液中加入步驟2)制備的氧化微晶纖維素，攪拌均勻進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)；再將交聯(lián)產(chǎn)物冷凍干燥，得到復(fù)合止血海綿即氧化微晶纖維素和膠原蛋白的復(fù)合材料。

所述的制備方法，步驟1)制備膠原蛋白海綿具體包括如下步驟：

1.1)分離除脂：將新鮮牛跟腱除去雜質(zhì)、油脂，用蒸餾水浸泡、洗滌，切碎后，充分勻漿；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％-0.2％的碳酸鈉溶液浸泡過夜，過濾，得去脂處理的牛跟腱；

1.2)提?。喝∪ブ幚淼呐８欤尤霟o花果酶和醋酸水溶液，在0-4℃下攪拌3-4天，高速離心，取上清液；

1.3)鹽析：向離心后的上清液中，攪拌下，加入NaCl顆粒至氯化鈉的濃度達(dá)到2-3M，待沉淀析出后靜置12-18h，過濾，取沉淀備用；

1.4)透析：將白色粘稠狀的沉淀用0.1M Tris-HCl溶液溶脹10-18h，之后裝入截留分子量為7000-10000的透析袋中，以醋酸作為透析外液進(jìn)行透析，最后使用蒸餾水透析，得到膠原溶液；

1.5)干燥：將透析后的膠原溶液放入容器中，冰箱預(yù)凍后，放入冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥24-48h，得到膠原蛋白海綿。

所述的制備方法，步驟1.2)中無花果酶的加入量為，每100克去脂處理的牛跟腱，加入無花果酶3-5g。

所述的制備方法，步驟1.4)以醋酸作為透析外液，依次使用不同濃度的醋酸進(jìn)行梯度透析，最后使用蒸餾水透析，每種濃度分別透析2-3天。

所述的制備方法，步驟2)制備氧化微晶纖維素具體包括如下步驟：

2.1)將微晶纖維素用蒸餾水洗滌3-5次，50℃干燥4-6h；

2.2)將經(jīng)干燥處理后的微晶纖維素加入二氧化氮四氯化碳溶液中，于18-21℃度下攪拌2-4天，得到氧化產(chǎn)物；

2.3)采用真空過濾的方式使用四氯化碳過濾氧化產(chǎn)物數(shù)次，再用50％的乙醇洗滌一次，隨后再用100％的乙醇洗滌一次；

2.4)將洗滌后的產(chǎn)物真空干燥24h，得到干燥的氧化微晶纖維素。

所述的制備方法，步驟2)中將經(jīng)干燥處理后的微晶纖維素以1:27.5-36.2的比例加入19-35％的二氧化氮四氯化碳溶液。

所述的制備方法，步驟3)中按照每10ml乙酸水溶液加入0.06g膠原蛋白海綿，配制膠原蛋白溶液；乙酸水溶液的濃度為1％，v/v。

所述的制備方法，步驟3)中將步驟2)制備的氧化微晶纖維素加入到膠原蛋白溶液 中，在常溫下，磁力攪拌至粉末分散均勻，再將交聯(lián)產(chǎn)物冷凍干燥20-24h。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明從牛跟腱中提取膠原蛋白溶液后，引入氧化微晶纖維素粉末，制成不同比例的Col/OMC止血復(fù)合材料。通過表面結(jié)構(gòu)觀察，理化性能分析，生物安全性和有效性分析，使新型Col/OMC止血復(fù)合材料止血效果優(yōu)于商品化膠原止血海綿和自制止血海綿，對(duì)人體無毒無害，并快速氧化微晶在體內(nèi)降解。

COL和OMC均具有良好的止血性能，因此我們預(yù)測(cè)這兩種安全材料的復(fù)合物能夠更加快速的止血，預(yù)防血液過多損失，并且擁有可控的降解速度以及良好的力學(xué)性能，不對(duì)機(jī)體造成過多的負(fù)擔(dān)。因此，這種材料在體內(nèi)的降解速度應(yīng)該小于一個(gè)月，并且受損組織能夠盡可能快速的愈合。因此這種新型的Col/OMC復(fù)合材料有望成為良好的止血材料。

微晶纖維素(MCC)可以通過對(duì)天然纖維素的稀酸水解、純化獲取，MCC是由β-1,4-葡萄糖苷鍵結(jié)合的直鏈?zhǔn)蕉嗵穷愇镔|(zhì)，可自由流動(dòng)的極細(xì)微的短棒狀或粉末狀多孔狀顆粒,顏色為白色或近白色,無臭、無味,不溶于水、稀酸、有機(jī)溶劑和油脂,這種物質(zhì)纖維含量少、具有良好的吸濕性和穩(wěn)定性。除此之外，MCC因其具有極佳的生物安全性被列為GRAS之內(nèi)，同樣，其在歐洲也被認(rèn)定為安全的食品添加劑。氧化再生纖維素(ORC)是一種公認(rèn)的可吸收止血材料，能夠通過接觸激活作用促進(jìn)凝血的進(jìn)行。MCC和再生纖維素具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，根據(jù)再生纖維素的氧化過程推測(cè)，MCC C6上的羥基在NO2/CCl4氧化體系中很可能被高度選擇性的氧化。氧化的實(shí)質(zhì)是在纖維素上引入羧基以改變其化學(xué)特性。微晶纖維素的氧化產(chǎn)物，稱之為氧化微晶纖維素(OMC)，當(dāng)其羧基比為16～24％時(shí)，具有非常優(yōu)異的止血性能。除此之外，OMC具有良好的可塑性，這種特性有利于材料在齒科手術(shù)中的應(yīng)用。OMC分子中存在的眾多氫鍵在壓力下能夠形成氫鍵結(jié)合，當(dāng)有效成分進(jìn)入、聚集于這些結(jié)構(gòu)中后，血小板會(huì)被包圍并通過氫鍵作用固定，加速凝血過程的進(jìn)行。OMC比表面積大、聚合度低、生物安全性高，且成本較低，可成為高效無毒的止血材料。

附圖說明

圖1是氧化微晶纖維素/膠原蛋白復(fù)合止血海綿數(shù)碼照片。

圖2是對(duì)照組，實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿，和實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿的SEM圖；其中：(A)對(duì)照組為創(chuàng)爾膠原蛋白海綿，500×，(a)200×；(B)Col為實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿，500×，(b)200×；(C)Col-0.25％OMC為實(shí)施例2制備的復(fù)合止血海綿，500×，(c)200×；(D)Col-0.5％OMC為實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿，500×，(d)200×；(E)Col-1％OMC為實(shí)施例4制備的復(fù)合止血海綿，500×，(e)200×；(F) 膠原蛋白海綿和不同/氧化微晶纖維素含量的復(fù)合止血海綿的孔徑分布圖。

圖3是對(duì)照組，實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿，和實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿的紅外譜圖。

圖4是對(duì)照組，實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿，和實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿對(duì)ACC-M細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

圖5是對(duì)照組，實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿，和實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿的力學(xué)強(qiáng)度(A)、接觸角(B)、孔隙率(C)、吸水率(D)測(cè)試結(jié)果。

圖6示出對(duì)照組，實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿，和實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿的止血性能。

圖7示出對(duì)照組，實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿，和實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿血小板釋放反應(yīng)中(A)β-TG因子和(B)PF4因子濃度變化圖、以及(C)GPIIb/IIIa和(D)FXIIa濃度變化圖。

圖8是在兔耳動(dòng)脈和肝損傷模型中，Col和不同含量Col/OMC復(fù)合止血海綿的出血量。

圖9是不同材料分別植入兔腿部1天，7天，14天和28天后的局部組織病理圖(HE染色)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1一種氧化微晶纖維素/膠原蛋白復(fù)合止血海綿

其制備方法如下：

1)膠原蛋白(Col)海綿的制備

1.1)分離除脂：將新鮮牛跟腱除去雜質(zhì)、油脂，用蒸餾水浸泡、洗滌，切碎后，充分勻漿；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的碳酸鈉溶液浸泡過夜，過濾，得去脂處理的牛跟腱；

1.2)提?。喝∪ブ幚淼呐８?00g，加入無花果酶4.5g和0.1M的醋酸水溶液，在4℃下攪拌3天，高速離心，取上清液；

1.3)鹽析：向離心后的上清液中，在攪拌下，加入NaCl顆粒至氯化鈉的濃度達(dá)到3M，待沉淀析出后靜置12h，過濾，取沉淀備用；

1.4)透析：將白色粘稠狀的沉淀用0.1M Tris-HCl溶液溶脹18h，之后裝入截留分子量為10000的透析袋中，依次使用不同梯度的醋酸(0.1M，0.05M，0.02M)作為透析外液，最后使用蒸餾水透析，得到膠原溶液。(每種濃度分別透析2天。)

1.5)干燥：將透析后的膠原溶液放入容器中，冰箱預(yù)凍后，放入冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥36h，得到膠原蛋白(Col)海綿，備用。

2)氧化微晶纖維素(OMC)的制備

2.1)將微晶纖維素用蒸餾水洗滌3次，50度干燥6h。

2.2)將經(jīng)干燥處理后的微晶纖維素以1:36.2的比例加入35％的二氧化氮四氯化碳溶液中，于19.5度下攪拌2-4天，得到氧化產(chǎn)物。

2.3)采用真空過濾的方式，使用四氯化碳過濾上述氧化產(chǎn)物數(shù)次，再用50％的乙醇洗滌一次，隨后再用100％的乙醇洗滌一次。

2.4)將上述洗滌后的產(chǎn)物真空干燥24h，得到干燥的氧化微晶纖維素(OMC)，備用。

3)復(fù)合止血海綿的制備

復(fù)合材料Col-0.25％OMC的制備：按照每10ml乙酸水溶液(1％v/v)加入0.06g膠原蛋白(Col)海綿，配制膠原蛋白溶液。取100g膠原蛋白溶液，加入0.25g的氧化微晶纖維素(OMC)，冷凍干燥24h后，得到復(fù)合止血海綿，即膠原蛋白(Col)和氧化微晶纖維素(OMC)的復(fù)合材料Col-0.25％OMC。

實(shí)施例2

步驟同實(shí)施例1，僅改變膠原蛋白溶液中氧化微晶纖維素的加入量，即取100g膠原蛋白溶液，加入0.5g的氧化微晶纖維素(OMC)，冷凍干燥24h后，得到復(fù)合止血海綿，即膠原蛋白(Col)和氧化微晶纖維素(OMC)的復(fù)合材料Col-0.5％OMC。

實(shí)施例3

步驟同實(shí)施例1，僅改變膠原蛋白溶液中氧化微晶纖維素的加入量，即取100g膠原蛋白溶液，加入1.0g的氧化微晶纖維素(OMC)，冷凍干燥24h后，得到復(fù)合止血海綿，即膠原蛋白(Col)和氧化微晶纖維素(OMC)的復(fù)合材料Col-1％OMC。

效果實(shí)驗(yàn)

1、圖2顯示了(A）對(duì)照組(陰性對(duì)照，創(chuàng)爾膠原蛋白海綿）、(B）實(shí)施例1步驟1）制備的膠原蛋白海綿、(C）實(shí)施例1制備的復(fù)合止血海綿Col-0.25%OMC、(D）實(shí)施例2制備的復(fù)合止血海綿Col-0.5%OMC、和(E）實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿Col-1%OMC的表面形態(tài)，圖中高光部分顯示了膠原的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，暗部為材料的微孔。由圖可知對(duì)照組的平均孔徑為120±25μm(圖2(A)和(a))，圖2(B)和(b)中實(shí)施例1步驟1）制備的膠原組表面平滑，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較為均一。圖2(C)和(c)Col-0.25%OMC組表面結(jié)構(gòu)和膠原組類似，但孔徑為234±38.35μm，明顯增大。箭頭所示為OMC粉末，穿插在膠原網(wǎng)狀纖維之間。Col-0.5%OMC組在膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中存在更多的OMC粉末，均一的嵌入膠原結(jié)構(gòu)中，其孔徑為140.67±47.25μm，如圖2(D)、(d)。Col-1%OMC組中OMC的含量增加，形成了較為明顯 的結(jié)節(jié)，膠原的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)仍然存在，部分網(wǎng)絡(luò)被破壞(圖2(E)和(e))。材料孔徑大小對(duì)其生物學(xué)效應(yīng)具有重要的影響，Col-0.25%和Col組均有較大的孔隙，分別為234±38.35μm和208±41.04μm(圖1)。

Lie Ma等研究表明用于皮膚組織工程的膠原海綿應(yīng)該具有合適的微觀結(jié)構(gòu)，如孔徑大小在100～200μm之間，孔隙率大于90％。然而，對(duì)于植入材料，大孔隙是否適合還存在爭(zhēng)議。S.Nehrer發(fā)現(xiàn)膠原海綿內(nèi)的合成活動(dòng)與孔隙有關(guān)，當(dāng)孔隙較小時(shí)(20-85μm)，合成活動(dòng)較為活躍。但之前的研究表明166～334μm的孔徑更加適合。我們的研究中，擁有大孔隙的Col-0.25％OMC和Col海綿表現(xiàn)出突出的止血能力和生物降解能力。這是因?yàn)榇罂讖降牟牧细诩?xì)胞和血小板的聚集和積累，大的孔隙適合細(xì)胞的新陳代謝以及傷口的愈合。材料的孔徑可以通過控制溫度和壓力和凍干的程序而改變，這意味著我們可以改變材料的孔徑以適應(yīng)更多的應(yīng)用需求。

2、圖3為對(duì)照組、實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿、實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿(Col-0.25％OMC,Col-0.5％OMC and Col-1％OMC)以及OMC粉末的紅外圖譜。從紅外譜圖中我們可以看出，3335cm-1處的峰是分子間氫鍵OH伸縮振動(dòng)。-NH一般在3540～3180cm-1有兩個(gè)弱而尖吸收峰。1632cm-1,1543cm-1以及1235cm-1處的峰分別代表收縮振動(dòng)在1680～1630cm-1的C＝O(酰胺Ⅰ帶)，收縮振動(dòng)在1570～1510cm-1的酰胺Ⅱ帶，以及收縮振動(dòng)在1335～1200cm-1的酰胺III帶。根據(jù)化學(xué)分子式和FT-IR光譜對(duì)OMC官能團(tuán)的分析表明：(1)在3420cm-1處的特征峰-OH的收縮振動(dòng)，一般在3400～3450cm-1之間出現(xiàn)；(2)在1728cm-1處的峰代表羧基C＝O的收縮振動(dòng)，C＝O通常在3000cm-1左右會(huì)有個(gè)小峰，在1700cm-1會(huì)有強(qiáng)峰；(3)1016cm-1處的峰是CH2OH中C-O的收縮振動(dòng)。對(duì)比Col和Col/OMC的FT-IR光譜，除了在1728cm-1處輕微的羧基C＝O吸收振動(dòng)外，無新的波峰出現(xiàn)。隨著OMC粉末在Col/OMC復(fù)合物中含量的增加，1080cm-1處峰的強(qiáng)度和1728cm-1處羧基C＝O的峰肩逐漸增加。這表明膠原蛋白和OMC之間發(fā)生了特殊的分子間相互作用，但仍需進(jìn)一步證明。1080cm-1處的峰在復(fù)合材料里可能是仲醇上C-O伸縮振動(dòng)，也可能是膠原蛋白里與氨基相連的碳的C-H伸縮振動(dòng)峰。1724cm-1處的峰是OMC的酯鍵上C＝O伸縮振動(dòng)特征峰，1314cm-1處的峰可能是亞甲基的彎曲振動(dòng)，也可能是酯的C-O伸縮振動(dòng)，而1080cm-1峰在復(fù)合材料里可能是仲醇上C-O伸縮振動(dòng)，在膠原蛋白里則可能是與氨基相連的碳的C-H伸縮振動(dòng)峰。隨著OMC含量的增加，1728cm-1以及1080cm-1處的峰越來越明顯，Col-1％OMC該處的峰最尖最突出，而1080cm-1處的峰逐漸減弱，推測(cè)1080cm-1處的峰是在膠原蛋白里與氨基相連的 碳的C-H伸縮振動(dòng)峰的可能更大。

3、圖4為對(duì)照組、實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿、實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿(Col-0.25％OMC,Col-0.5％OMC and Col-1％OMC)對(duì)ACC-M細(xì)胞的細(xì)胞毒性。以各材料浸提液作用于ACC-M細(xì)胞1d，3d，和5d進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，分組為：對(duì)照組Col，含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)OMC(0.25％,0.5％和1％)的膠原蛋白復(fù)合材料，空白對(duì)照(未做任何處理)，陽性對(duì)照(64g/L苯酚)。結(jié)果以隨時(shí)間變化的相對(duì)細(xì)胞活性表示，空白對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)1d時(shí)的細(xì)胞活性作為對(duì)照。圖4顯示，第1、3、5天使用各組材料浸提液培養(yǎng)的ACC-M細(xì)胞活力并無顯著性差異，表明Col和Col/OMC材料沒有細(xì)胞毒性，而陽性對(duì)照組細(xì)胞毒性明顯，證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

4、圖5顯示了對(duì)照組、實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿、實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿(Col-0.25％OMC,Col-0.5％OMC and Col-1％OMC)膠原海綿的力學(xué)強(qiáng)度(A)、接觸角(B)、孔隙率(C)、吸水率(D)測(cè)試結(jié)果。拉伸強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)用于測(cè)試材料在軸向拉伸負(fù)荷下的性能。圖5(A)顯示，實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿，可以承受最大的拉伸強(qiáng)度為4.27±0.65N。對(duì)照組的值最小1.03±0.3N。Col-0.25％OMC的拉伸強(qiáng)度2.65±0.29N比Col低，但是比Col-0.5％OMC(1.77±0.12N和Col-1％OMC 1.43±0.2N高。原因是氧化微晶纖維素纖維導(dǎo)致一部分膠原蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)損傷。Col力學(xué)性能最佳是因?yàn)槠淅炝ψ畲?，在?fù)合物中，隨著氧化微晶纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，材料的拉伸性能逐漸降低，即Col-0.25％OMC次之，對(duì)照組最小。圖5(B)顯示，接觸角從低到高分別為62.33±2.52°(Col)，65.33±4.16°(Col-0.25％OMC)，73.33±2.52°(對(duì)照)，75±3°(Col-0.5％OMC)和80.33±4.04°(Col-1％OMC)。圖5(C)顯示，Col-0.25％OMC的孔隙率為89.88±3％，其值高于Col 87.81±2％，Col-1％OMC的孔隙率為79.56±4％，處于Col-0.5％OMC(82.93±1％)和對(duì)照組(75.70±1％)之間。圖5(D)顯示了各組材料的吸水性，Col-0.25％OMC能夠吸收自重16.43(SD＝0.65)倍的水，Col能夠吸收自重14.22±1.96倍的水分，Col-0.5％OMC吸水量為12.25±0.97倍自重，Col-1％OMC能夠吸收11.18±0.9倍的自重,對(duì)照組組的吸水量為自重的11.88±0.54倍?？偟膩砜?，隨著OMC組分的增加，材料的抗張強(qiáng)度、孔隙率、吸水量逐漸減小，相反，接觸角的值增加。

5、對(duì)照組、實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿、實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿(Col-0.25％OMC,Col-0.5％OMC and Col-1％OMC)膠原海綿的止血性能如表1和圖6所示。表1顯示，Col and Col/OMC材料的止血時(shí)間均低于對(duì)照組，且具有顯著性差異。Col-0.25％OMC的止血時(shí)間最短，兔耳動(dòng)脈損傷模型中止血時(shí)間為35.33±6.02s，肝損傷模 型中止血時(shí)間為25.33±3.08s。Col-0.5％OMC也具有良好的止血性能，兔耳動(dòng)脈損傷模型中止血時(shí)間為36.5±4.46s。此外，Col肝臟止血時(shí)間為26.17±3.76s，止血效果較為明顯。

如圖6所示，Col/OMC材料和對(duì)照組、膠原組不同模型的出血量均有顯著水平的差異，Col-0.25％OMC組不僅止血時(shí)間最短，出血量也最少，該組兔耳動(dòng)脈損傷模型出血量為57.73±9.29mg，肝損傷模型出血量為49.78±5.28mg。

6、通過檢測(cè)對(duì)照組，實(shí)施例1步驟1)制備的膠原蛋白海綿，實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的復(fù)合止血海綿(Col-0.25％OMC,Col-0.5％OMC and Col-1％OMC)膠原海綿血小板釋放反應(yīng)中β-TG因子和PF4因子的濃度可以觀察被激活的血小板，如圖7A、B所示，對(duì)照組β-TG和PF4為733.76±22.11pg/ml和6.01±0.22ng/ml，與其他組有顯著性差異(P<0.05)。Col-0.25％OMC組β-TG and PF4釋放量最大，其值為1955.3±24.87pg/ml(β-TG)和12.35±0.24ng/ml(PF4)。此外，血小板糖蛋白也能夠反應(yīng)血小板粘附、聚集及釋放反應(yīng)的強(qiáng)度。血小板被激活后，血小板糖蛋白的量會(huì)隨之改變，在膜表面形成GPIIb/IIIa復(fù)合物。GPIIb/IIIa在Col-0.25％OMC組的濃度為22.88±0.38ng/ml，相比于對(duì)照組(10.28±0.39ng/ml)，有顯著水平的差異(P<0.05)。并且高于其他任何實(shí)驗(yàn)組(圖7C)。factor XIIa標(biāo)志著人體凝血過程的開端，如圖7D，Col-0.25％OMC group FXIIa濃度(100.72±2.58U/L)以及Col-0.5％OMC組FXIIa濃度(103.99±3.25U/L)明顯高于對(duì)照組和OMC組?？傊珻ol和Col-0.25％OMC組能夠通過影響血小板的促凝活性提高止血效率。首先，多孔的支架材料能夠?yàn)檠“宓恼掣胶途奂峁┝己玫闹Ъ埽诙?，Col和Col-0.25％OMC能夠促進(jìn)血小板的釋放反應(yīng)以及凝血酶和纖維蛋白的形成。它能夠促進(jìn)釋放因子如β-TG,PF4and GPIIb/IIIa的釋放，促進(jìn)凝血過程的進(jìn)行，并且能夠通過提高GVPI的濃度直接影響血小板的凝血活性。第三，Col和Col-0.25％OMC能夠激活內(nèi)源性凝結(jié)通路，引發(fā)FXIIa因子濃度的提高(圖7D)。此外，β-TG,PF4and GPIIb/IIIa的最大濃度均發(fā)生在Col-0.25％OMC組，證明其止血性能高于Col組。

7、圖8和圖9分別顯示了不同材料分別植入兔腿部1d，7d，14d和28d后的組織學(xué)圖像和超聲圖像。如圖8所示，在植入部位可以檢測(cè)到異常的拱形彎曲，植入材料的形貌可以較為清晰的觀測(cè)到。從圖8a-c可以看到,植入的第一天，對(duì)照組組，Col組和Col-0.25%OMC組植入部位出現(xiàn)水腫和壞疽，并且能夠觀測(cè)到炎癥細(xì)胞的浸潤。在隨后的超聲檢測(cè)中，D1,D2and D3代表對(duì)照組組,Col組and Col-0.25%OMC組材料在體內(nèi)的直徑，分別為5.1mm,4.6m and 4.7mm。從圖9A-C可以觀測(cè)到信號(hào)異常區(qū)域的炎性水腫伸展到肌肉下層。第7天時(shí)，對(duì)照組組材料引起真皮、皮下和肌肉組織中肉芽的增殖，如圖8d。同時(shí)，Col組和Col-0.25%OMC組同時(shí)觀測(cè)到了在真皮組織下的膠原纖維化、壞疽以及中性粒細(xì)胞的浸潤(圖8e、f)。圖9D-F顯示，材料的直徑相比第一天明顯減小，分別為2.3mm,2.1mm和8mm，同時(shí)，炎癥水腫也明顯減輕。在移植后的14天時(shí)，可見組織增殖和炎癥細(xì)胞的浸潤，對(duì)照組,Col和Col-0.25%OMC組植入材料的直徑分別為1.6mm,1.3mm和1.0mm(圖8g-i)。移植后的28天，所有組別均無炎癥及增生組織并觀測(cè)到毛囊，表明移植區(qū)域恢復(fù)正常(圖8j-l)。與此同時(shí)，此區(qū)域的超聲信號(hào)連續(xù)正常，表明炎癥反應(yīng)已經(jīng)消失(圖9J-L)。與之前的研究相比，Col和Col-0.25%OMC的降解時(shí)間(4周）明顯小于Microfibrillar Collagen(8周），殼聚糖海綿的降解時(shí)間更長，并且會(huì)引起更加嚴(yán)重的組織反映。用于止血、填充、修復(fù)的生物材料的降解時(shí)間是評(píng)價(jià)材料性能的重要因素。Col和Col/OMC均屬于高分子材料，擁有良好的生物學(xué)特性，其降解過程包括化學(xué)水解及酶降解。其中，體內(nèi)的膠原酶能夠降解植入的膠原材料。膠原海綿在水解和酶解的作用下，從高聚物逐步變?yōu)楣央幕虬被?，最終被人體吸收。我們推測(cè)在向Col內(nèi)加入OMC后，Col/OMC的分解過程會(huì)歷經(jīng)OMC鏈縮短、進(jìn)入血漿后進(jìn)一步分解為小片段，如糖醛酸、葡萄糖等。OMC是MC的氧化產(chǎn)物，MC是生物可降解的，推測(cè)其氧化產(chǎn)物應(yīng)該具有相似的分解機(jī)制。

由以上結(jié)果表明：FT-IR光譜結(jié)果表明結(jié)果顯示，隨著OMC組分的增加，1031cm-1-1724cm-1的峰密度增加明顯，相反1080cm-1處峰減小，推測(cè)1080cm-1處峰為膠原氨基C-H伸縮振動(dòng)峰，加入OMC粉末后，二者相互作用導(dǎo)致1031cm-1and 1724cm-1處峰強(qiáng)度的改變。研究表明，氧化過程會(huì)導(dǎo)致MC羧基的改變。當(dāng)其羧基量達(dá)到16％～24％時(shí)，OMC具有最佳的止血效果。當(dāng)羧基暴露在表面時(shí)，其所帶電荷能夠有效吸附血小板。1724cm-1為典型的羧基伸縮振動(dòng)峰，我們的材料同樣在此處測(cè)得了吸收峰，因此我們推測(cè)羧基能夠?qū)Σ牧系闹寡阅苡幸欢ǖ挠绊?。?顯示，隨著OMC組分的增加，止血時(shí)間減少，符合上 述推測(cè)。與對(duì)照組相比，自制Col和Col/OMC復(fù)合物具有卓越的止血性能。Col-0.25％OMC具有最佳的止血性能，在兔耳動(dòng)脈止血實(shí)驗(yàn)中，其出血量和出血時(shí)間分別為57.73±9.29mg及35.33±6.02s。研究顯示，多數(shù)止血海綿的止血時(shí)間為2-5分鐘，本課題組之前的研究驗(yàn)證了氧化纖維素的止血性能，兔耳實(shí)驗(yàn)中OMC-Na-3和Surgicel的止血時(shí)間分別為102s和126s，肝損傷實(shí)驗(yàn)中其數(shù)值為138s和176s。這些材料的止血性能均遜于Col和Col-0.25％OMC材料，其原因可能是以下幾條：1、Col和Col-0.25％OMC材料具有特殊的多孔結(jié)構(gòu)，能夠迅速吸收血液，；2、OMC具有優(yōu)異的止血性能，能夠促進(jìn)凝血塊的形成。3、二者的復(fù)合物能夠促進(jìn)血小板的粘附、聚集、釋放，加速血液凝固過程。Col-0.25％OMC不僅可以快速吸收血液，還可以通過影響凝血因子直接參與止血過程，該材料的止血效果大幅提升，并可以在植入體內(nèi)28天后完全降解，對(duì)周圍組織無明顯異常影響。綜上所述，此復(fù)合材料可以作為止血填充體廣泛用于口腔頜面外科手術(shù)中，具有廣闊的應(yīng)用前景。