本發(fā)明涉及一種miR-219a-5p，尤其涉及一種miR-219a-5p在制備抗甲基苯丙胺復吸藥物中的應用。
背景技術：
：甲基苯丙胺(METH)，俗稱冰毒，是一種白色苯丙胺類合成類毒品。高劑量或長期反復使用者會共患精神疾病，包括抑郁、躁狂、精神分裂等，嚴重者會造成中毒性精神病，表現(xiàn)為被害妄想和幻覺，過度使用甚至出現(xiàn)自殺和殺人傾向。在冰毒的戒斷期間，冰毒依賴者會出現(xiàn)失眠、抑郁、躁狂、以及焦慮的精神情緒變化，而這些戒斷反應也成為影響冰毒依賴者復吸的主要生理因素。甲基苯丙胺成癮共患精神疾病的比例達到了20-30％，成癮者通常會出現(xiàn)抑郁、焦慮、精神分裂等癥狀。甲基苯丙胺也會產(chǎn)生嚴重的神經(jīng)毒性，長期使用甲基苯丙胺可以造成認知功能損害。因此甲基苯丙胺成癮機制的研究以及治療藥物的尋找，也逐漸向其它精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾病延伸。外周腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)對心血管系統(tǒng)的功能、電解質和體液的平衡，以及血壓調節(jié)具有重要的作用。腎素經(jīng)腎靜脈進入血液循環(huán)，啟動鏈式反應，由血管緊張素原逐步生成血管緊張素I(AngI)和II(AngII)，并進一步產(chǎn)生AngIII和AngIV等遞質。除了在外周系統(tǒng)，中樞也存在一個相對獨立的RAS系統(tǒng)，主要組成部分是AngII。中樞AngII是一個具有多效性的神經(jīng)肽，存在于神經(jīng)元細胞體、軸突和神經(jīng)末梢上，對中樞起著多重調節(jié)作用。AngII的主要受體有兩種ATR1和ATR2。中樞AngII主要通過與ATR1結合在中樞系統(tǒng)發(fā)揮調節(jié)內分泌、交感和應激系統(tǒng)的作用。ATR1型受體又分為ATR1a和ATR1b兩種亞型。研究也表明中樞AngII和多種神經(jīng)和精神疾病的發(fā)病機制存在相關性，包括阿爾茨海默癥、帕金森癥、神經(jīng)性炎癥、中風、雙向人格障礙、癲癇等。迄今為止，還沒有一個針對甲基苯丙胺成癮治療的有效藥物。中樞AngII在多種精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在作用以及申請者研究組的前期工作提示，中樞AngII以及ATR1可能會從改善和治療甲基苯丙胺成癮以及共患精神障礙，為甲基苯丙胺成癮治療藥物的研究提供新的靶點。1992年在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)microRNA。之后，大量的研究表明miRNAs在基因表達中具有至關重要的作用。miRNAs是一種短小非編碼的RNA，它只有21-25個核苷酸序列。miRNA首先在細胞核內轉錄出較長的初級miRNA，然后在核內由Drosha加工成60～70個核苷酸的發(fā)夾狀RNA，即前體miRNA，在Exprotin-5復合物的幫助下被轉運出胞核，在胞漿中由Dicer剪切成為成熟miRNA，隨即被整合進RNA沉默復合物。miRISC通過與3’端靶非編碼區(qū)，根據(jù)堿基配對原則靶向信使RNA來抑制基因的翻譯或者誘導mRNA的降解。最近，越來越多的研究者的目光聚焦miRNA在各種成癮性藥物中的調節(jié)作用，包括可卡因、海若因、苯丙胺類和酒精。長期可卡因使用引起海馬中miR-134和miR-135a的下調,也可以上調紋狀體中的miR-181a，miR-212以及下調尾殼核(CPU)miR-124。酒精成癮與戒斷導致miR-155和miR-375表達的上調。然而，目前大部分研究主要集中在miRNA在可卡因或者酒精成癮中，甲基苯丙胺成癮相關研究較少，甲基苯丙胺成癮中的microRNA調節(jié)機制目前還不明確。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現(xiàn)有技術現(xiàn)狀而提供一種miR-219a-5p在制備抗甲基苯丙胺復吸藥物中的應用。本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為：該miR-219a-5p在制備抗甲基苯丙胺復吸藥物中的應用，其特征在于：所述藥物由有效量包含序列表所示SEQNO.1的核酸和藥學上可接受的載體或輔料組成。進一步地，所述的miR-219a-5p的有效劑量為6～20μl/kg。進一步地，所述的藥物是注射藥劑。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于通過大量的實驗證實，在建立甲基苯丙胺大鼠模型中，甲基苯丙胺引起microRNA在伏隔核表達發(fā)生變化，靶向AT1的miR-219a-5p伏隔核過表達后，對條件性線索誘導的大鼠甲基苯丙胺復吸行為以及甲基苯丙胺引燃誘導的大鼠甲基苯丙胺復吸行為均起到抑制作用，說明miR-219a-5p可以應用到治療甲基苯丙胺成癮，以開發(fā)作為基因治療戒毒。附圖說明圖1為本發(fā)明中甲基苯丙胺成癮模型的建立；圖2為本發(fā)明中甲基苯丙胺引起miR-219a-5p在伏隔核中表達量的比較圖；圖3為本發(fā)明中甲基苯丙胺引起中樞血管緊張素系統(tǒng)的microRNA聚類圖；圖4為本發(fā)明中靶向中樞血管緊張素系統(tǒng)的microRNA；圖5為本發(fā)明中中樞血管緊張素系統(tǒng)microRNA的表達變化；圖6為本發(fā)明中甲基苯丙胺大鼠進行消退7天的消退結果圖；圖7為本發(fā)明中miR-219a-5p伏隔核過表達對線索誘導復吸的抑制作用；圖8為本發(fā)明中miR-219a-5p伏隔核過表達對甲基苯丙胺引燃誘導的大鼠復吸行為的抑制作用；圖9為本發(fā)明中miR-219a-5p伏隔核過表達在線索誘導重建中對AT1的抑制作用；圖10為本發(fā)明中miR-219a-5p伏隔核過表達在藥物誘導重建中對AT1的抑制作用。具體實施方式以下通過結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明實施例中使用的甲基苯丙胺為標準品，來自寧波市微循環(huán)與莨菪類藥研究所，miR-219a-5p來自上海吉瑪制藥技術有限公司。實施例1甲基苯丙胺靜脈自身給藥模型的建立靜脈自身給藥(IntravenousDrugSelf-Administration)是研究藥物成癮最經(jīng)典的動物模型之一，靜脈自身給藥模型是反映用藥者主動覓藥和用藥行為的經(jīng)典動物模型，可以利用實驗動物考察給藥動機和主動強迫性用藥行為。經(jīng)典的大鼠甲基苯丙胺甲基苯丙胺自身給藥模型可以很好的模擬臨床上吸毒患者的甲基苯丙胺吸食行為，大鼠經(jīng)過訓練可以產(chǎn)生對甲基苯丙胺的自我給藥，同時訓練過程中不斷上升的對甲基苯丙胺的行為反應率和給藥量可以反映吸毒患者從一開始接觸甲基苯丙胺到大量吸食甲基苯丙胺成癮的這樣一個過程。我們采用如下方法來建立大鼠的自身給藥模型：首先，SD大鼠進行頸靜脈插管手術，在右頸靜脈插入一段PE管，并經(jīng)背部穿出體外，手術后抗菌和恢復一周以上。隨后，大鼠分別在自身給藥操作籠內進行訓練，每次訓練前連通大鼠背部的PE管與操作籠內的甲基苯丙胺注射系統(tǒng)；操作籠內設左右兩個鼻觸器，其中一個為有效鼻觸器，大鼠觸鼻一下有效鼻觸器將獲得一針甲基苯丙胺注射，同時操作籠內的籠燈亮起(作為一種伴藥的線索)，計算機記錄；另外一個為無效鼻觸器，大鼠觸鼻一下無效鼻觸器沒有任何甲基苯丙胺注射和燈光，僅計算機記錄。兩次甲基苯丙胺注射之間有20秒的不應期，期間觸鼻有效鼻觸器將不會有甲基苯丙胺注射和燈光，僅計算機記錄，每天的甲基苯丙胺注射針數(shù)限制為50針(防止過量注射死亡)。32個操作籠采用大型服務器的計算機同時控制，自身給藥訓練軟件為自主編寫的AniLabV652，訓練程序為固定比率的FR1，即大鼠觸鼻一次有效鼻觸器獲得一針甲基苯丙胺注射。大鼠經(jīng)過3天，每天4小時的訓練后，有效觸鼻反應率和注射量均明顯上升，在最后幾天趨于穩(wěn)定，從而形成了穩(wěn)定的甲基苯丙胺成癮狀態(tài)。a、方法：對大鼠進行頸靜脈插管手術，之后恢復3天。恢復后，開始自身給藥，分為兩組，即甲基苯丙胺組和生理鹽水組，每組6只老鼠。前三天是給藥訓練期，這個階段讓老鼠學會。學會后連續(xù)十四天給藥。甲基苯丙胺組：配制溶度為0.12mg/ml的甲基苯丙胺，按照0.05mg/kg/infusion劑量給藥。生理鹽水組：該組為對照組，直接用生理鹽水替代甲基苯丙胺進行給藥。從圖1可以看出，給藥次數(shù)甲基苯丙胺組顯著高于生理鹽水組，并維持在一定水平上，說明甲基苯丙胺組已經(jīng)成癮，并且自身給藥模型已經(jīng)建立好。實施例2采用上海吉瑪制藥技術有限公司qRCR檢測試劑盒對miR-219a-5p的表達進行檢測①miR-219a-5p逆轉錄反應體系(20μl)：組分體積1rxns5XMMLVRTBuffer4μldNTP(10mM)0.75μlMiRAN&U6snRNARTprimermix(1μM)1.2μlRNasin(40U/μl)RNase-freeH2O代替0.25μlMMLVReverseTranscriptase(200U/μl)0.2μlRNASampleXμlRNase-freeH2OTo20μl以上體系混勻后，25℃孵育30分鐘，42℃孵育30分鐘，85℃孵育5分鐘，4℃?zhèn)溆谩＂趍icroRNAreal-timePCR(PCR試劑盒源于上海吉瑪制藥技術有限公司，miR-219a-5p的引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成)引物為：FPrimer:CTGATTCCCTGATTGTCCAAACRPrimer:TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC組分體積1rxns2XReal-timePCRMasterMix(SYBR)1X10μlmiRAN/U6snRNAspecificPrimerset(10μM)0.2μM0.4μlROXreferencedye(50X)SterilizedH2O代替1Xor5X0.4or2μlTaqDNApolymerase(5U/μl)1U0.2μlmiRNARTproduct2μlSterilizedH2OTo20μl③實時定量PCR反應程序通過qRT-PCR方法擴增DNA來鑒定得到的即為目的RNA(miR-219a-5p，其核苷酸序列為序列1)。④結果顯示，甲基苯丙胺模型大鼠伏隔核中miR-219a-5p含量較對照正常組小鼠有明顯下降，說明在甲基苯丙胺大鼠伏隔核中，miR-219a-5p表達水平下調(結果如圖2所示)。實施例3microRNA芯片由于miRNA本身分子片段小，種類多，豐度低，要總覽miRNAs的全局表達和相互關系、不同條件下表達差異、特別是與疾病的關系，以及miRNA靶基因和功能研究等等，芯片技術無疑是很好的選擇。這一技術的原理是收集待測樣品中的miRNA，與特定芯片上互補的探針雜交，通常待測樣品中的miRNA3'端會標記上熒光基團，雜交洗滌后可掃描熒光強度，大量數(shù)據(jù)處理后便可篩選出有顯著表達差異的miRNA。由于芯片技術采用大規(guī)模微陣列技術，一張芯片上可以同時分析成百上千的探針，大大提高了篩選的速度和通量，因此是miRNA高通量研究的首選。而且由于miRNA芯片的高通量特點，比較于Northern雜交，RT-PCR，液相雜交等方法，miRNA芯片技術是一種更理想的快速有效的檢測miRNA表達圖譜的方法。方法：微陣列實驗由LCSciences公司進行，微陣列實驗使用4-8μg總RNA樣品。使用Poly(A)聚合酶在總RNA3'端加上poly(A)尾巴，再將一個寡聚核苷酸標記與這個poly(A)尾巴連接(ligation)用于后續(xù)的熒光標記。雜交反應利用微循環(huán)泵(AtacticTechnologies)的循環(huán)作用在μParaflo微流體芯片上過夜進行。在微流體芯片上,每條檢測探針都是由一個化學修飾核苷酸編碼段(與目標microRNA互補(來源于miRBase,http://www.mirbase.org/)或是與其他RNA(質控或是客戶定制序列)互補)和一個由聚乙二醇組成的間隔段(擴大編碼段與基質的間距)組成。檢測探針均使用PGR(photogeneratedreagent)化學法進行原位合成。雜交解鏈溫度是通過化學修飾檢測探針進行平衡。雜交使用含有25％甲酰胺的100μL6xSSPE緩沖液(0.90MNaCl,60mMNa2HPO4,6mMEDTA,pH6.8)，雜交溫度為34℃。RNA與探針雜交后，與標記特異結合的Cy3染料在微流體芯片上循環(huán)流動進行染色。利用激光掃描儀(GenePix4000B,MolecularDevice)采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件(MediaCybernetics)進行圖像數(shù)字化轉換。數(shù)據(jù)分析首先是減除背景值，然后使用LOWESS過濾(Locally-WeightedRegression)進行信號歸一化。從圖3看出甲基苯丙胺成癮后相對于甲基苯丙胺被動組和生理鹽水組有顯著性差異表達的microRNA有近200個。實施例4靶基因預測根據(jù)篩選出來的表達有差異的microRNA，進行靶基因預測(基于TargetScan與KEGGpathway等數(shù)據(jù)庫)，篩選出目標microRNA。圖4聚類圖，直觀反映microRNA表達狀態(tài)，圖4可以看出，在眾多表達差異的microRNA中，經(jīng)過靶基因預測，有26個與中樞血管緊張素系統(tǒng)有關。從圖5中，可以看出miR-219a-5p的表達倍數(shù)最高，這就是本發(fā)明的目標。實施例5miR-219a-5p在伏隔核的過表達在大鼠甲基苯丙胺復吸的抑制作用復吸是臨床上治療甲基苯丙胺成癮的難點，甲基苯丙胺患者進行脫毒戒斷以后，再次接觸以往吸毒相關環(huán)境、毒品本身或者毒友唆使誘導下，往往會產(chǎn)生吸食甲基苯丙胺的沖動，并最終導致再一次的甲基苯丙胺成癮。大鼠的復吸模型能夠反映處于甲基苯丙胺戒斷期的患者再次接觸以往吸食甲基苯丙胺相關的環(huán)境或者甲基苯丙胺本身后，導致甲基苯丙胺復吸(再次成癮)的行為。為了評價miR-219a-5p過表達是否對于甲基苯丙胺成癮大鼠的復吸行為有影響，我們分別建立了條件性線索或甲基苯丙胺引燃誘導的大鼠復吸模型。首先，訓練48只大鼠在自身給藥操作籠內經(jīng)過14天的甲基苯丙胺自身給藥訓練，隨后所有大鼠消退7天，最后在飼養(yǎng)籠內自然戒斷7天，最后在操作籠內分別測定條件性線索或甲基苯丙胺引燃誘導的大鼠甲基苯丙胺復吸行為。(1)條件性線索誘導的大鼠甲基苯丙胺復吸行為測定：從所有大鼠中選取24只甲基苯丙胺成癮訓練成功的大鼠，進行消退7天，消退(如圖6)后，給大鼠做腦立體，將包裝好的慢病毒注射到大鼠伏隔核(NAc)，再進行7天的戒斷，戒斷后進行甲基苯丙胺復吸測定。分成2組，每組8只。①LV1CN：腦立體微注射LV1CN的慢病毒；②LV1-miR-219a-5p組：腦立體微注射LV1-miR-219a-5p的慢病毒。慢病毒注射劑量可為6-20μl/kg，此處注射量為14μl/kg。其中LV1-miR-219a-5p組微注射含有目標microRNA的慢病毒，LV1CN組微注射含空質粒的microRNA。兩組大鼠戒斷后分別對應放置于之前自身給藥訓練時所待的操作籠，利用條件性線索(大鼠之前訓練給予甲基苯丙胺注射時亮起的籠燈、注射泵的響聲)來誘導大鼠產(chǎn)生復吸的行為，程序也是固定比率的FR。程序開始時，操作籠內的籠燈亮起，此時大鼠觸鼻有效鼻觸器，注射泵會發(fā)出響聲，但是沒有甲基苯丙胺注射，測試時間為2h，從而來評價miR-219a-5p伏隔核內過表達對條件性線索誘導的大鼠甲基苯丙胺復吸行為是否有影響。從圖7可以看出，LV1-miR-219a-5p組相對于LV1CN組，有效鼻觸顯著下降(p<0.01)，可以說明大鼠伏隔核miR-219a-5p過表達可以顯著抑制線索誘導復吸行為。(2)甲基苯丙胺引燃誘導的大鼠甲基苯丙胺復吸行為測定從所有大鼠中選取24只甲基苯丙胺成癮訓練成功的大鼠，進行消退7天，消退后，給大鼠做腦立體，將包裝好的慢病毒注射到大鼠伏隔核(NAc)，再進行7天的戒斷，戒斷后進行甲基苯丙胺復吸測定。分成2組，每組8只。①LV1CN：腦立體微注射LV1CN的慢病毒；②LV1-miR-219a-5p組：腦立體微注射LV1-miR-219a-5p的慢病毒(每個位點1μl)。所有大鼠在測試前15min皮下均注射一針甲基苯丙胺(10mg/kg)，隨后分別對應放置之前自身給藥訓練時所待的操作籠，在甲基苯丙胺引燃誘導大鼠復吸測定時，籠燈以及注射泵聲音不再出現(xiàn)，大鼠觸鼻有效鼻觸器僅計算機記錄，也一樣沒有甲基苯丙胺注射，測試時間為2h。從而來評價miR-219a-5p伏隔核內過表達對甲基苯丙胺自身引燃誘導的大鼠甲基苯丙胺復吸行為是否有影響。從圖8可以看出LV1-miR-219a-5p組相對于LV1CN組，有效鼻觸數(shù)顯著下降(p<0.01),可以說明大鼠伏隔核miR-219a-5p過表達可以顯著抑制藥物誘導復吸行為。實施例5miR-219a-5p大鼠伏隔核過表達在復吸抑制對血管緊張素II受體1表達的影響伏隔核(NAc)：接受前額皮層、海馬、杏仁核的谷氨酸能神經(jīng)傳入，研究表明NAc參與了與成癮有關的“刺激獎賞”學習，NAc的神經(jīng)纖維主要終止于其外殼區(qū)，并與投射到VTA的GABA能神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，直接參與與藥物獎賞的動機和情緒活動。方法：①大鼠經(jīng)過14天訓練達到穩(wěn)定的甲基苯丙胺成癮狀態(tài)，將SD大鼠分為兩組，每組6只，分別為LV1CN組和LV1-miR-219a-5p組，斷頭取腦，進行WesternBlotting實驗，將NAc腦區(qū)剝離，分裝在干凈的研磨管中置于冰上待用。在各個研磨管中加入研磨珠、裂解液(RIPA)以及蛋白酶抑制劑，各種試劑準確加好后，置于研磨機中研磨30s后迅速取出置于冰上。5min后4℃13，000g下離心15分鐘，離心后取其上清液，利用BCA試劑盒測定所取蛋白的濃度，并進行相應的調整使蛋白濃度盡量保持一致。隨后在每管上清液中加入5x的蛋白緩沖液35ul并放在沸水浴中10min后冷卻置于冰上待用。②電泳，將上述水浴后的樣品，進行SDS-PAGE凝膠電泳，每個腦區(qū)做3個復孔。③轉膜，轉膜液要預冷NC膜要平衡預處理10至15分鐘因為轉膜液含甲醛，而且手袋有的甲蛋白會造成膜的污染，所以必須帶上干凈的手套。注意海綿要充分濕潤，氣泡要趕走干凈，將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。在海綿墊子上墊三層濾紙，一手固定濾紙，一手用玻棒搟去其中的氣泡，停止跑膠后要馬上轉膜，否則蛋白會擴散，導致條帶發(fā)生變化進而影響實驗結果。在分離膠和濃縮膠之間畫一條線，輕輕的撥開濃縮膠，并把它移除，把NC膜蓋在分離膠上面，并且對齊，加少許轉膜液，使膜保持在濕潤的狀態(tài)中，膜下不能帶有氣泡。④免疫反應，將上述制好的膜放入盒中，將如封閉液(一般為脫脂奶粉)，常溫封閉2小時或者4℃過夜。封閉完成后，去除封閉液，加入一抗過夜(或者常溫5h)，一抗孵育完了后，回收一抗并用1X的TBST清洗3次每次5min，加入二抗，避光2h。避光結束后，回收二抗，并用1X的TBST清洗3遍后在用1XTBS清洗1次。⑤顯色，上述步驟完成后，將膜置于儀器上進行顯色，并進行蛋白條帶的觀察和灰度值的測定。從圖9可以看出，線索誘導重建中，LV1-miR-219a-5p組相對于LV1CN組，AT1的表達顯著下降(p<0.01)，說明miR-219a-5p過表達可以抑制AT1的表達。從圖10可以看出，藥物誘導重建中，LV1-miR-219a-5p組相對于LV1CN組，AT1的表達顯著下降(p<0.05)，說明miR-219a-5p過表達可以抑制AT1的表達。當前第1頁1 2 3