本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種組合物及其在制備改善黃褐斑的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：黃褐斑也稱肝斑，為面部的黃褐色色素沉著。多對稱蝶形分布于頰部。多見于女性，血中雌激素水平高是主要原因，其發(fā)病與妊娠、長期口服避孕藥、月經(jīng)紊亂有關(guān)。黃褐斑一般為黃褐或深褐色斑片，常對稱分布于顴頰部，也可累及眶周、前額、上唇和鼻部，邊緣一般較明顯。無主觀癥狀和全身不適。色斑深淺與季節(jié)，日曬，內(nèi)分泌因素有關(guān)。精神緊張，熬夜，勞累可加重皮損。對于黃褐斑的療法主要分為局部治療和全身治療2種，全身治療大多為給予維生素C以促進(jìn)色素減退，局部治療是更加常用的方式。局部治療分為以下3種方式：1、外用藥物：這是最簡單、最常用的治療方法。外用酪氨酸酶抑制劑軟膏，如5％氫醌霜、2％～4％曲酸霜及3％熊果苷等。涂搽后都有不同程度的療效。該類藥物為抗氧化劑，易在空氣和日光中氧化，應(yīng)封閉、避光保存。近年有人報(bào)道使用0.1％維A酸軟膏治療黃褐斑，外用糖皮質(zhì)激素等也有一定療效。2、剝脫療法：三氯醋酸溶液局部涂搽可使表皮剝脫，而除去色素斑。液氮冷凍治療可使表皮冷凍壞死后剝離，以除去色素，磨削手術(shù)是用磨頭將表皮磨去一層，而達(dá)到除去色素的目的。術(shù)后待創(chuàng)面愈合后搽用防曬霜等，否則日曬后易于復(fù)發(fā)。3、面膜療法：面膜療法包括單純面膜劑、面膜膏按摩法和倒模面膜法。其中倒模面膜法已廣泛應(yīng)用于黃褐斑的治療。面膜倒模療法集藥物、按摩、理療于一體，從而具有多種治療作用。其治療程序?yàn)椋宏栯x子蒸氣潤面－面膜膏按摩－成形倒模劑倒模。面膜膏的藥物成分對黃褐斑的治療起著關(guān)鍵影響。目前有去色素的面膜膏、增白面膜膏和專治黃褐斑的中草藥物面膜等。4、激光或強(qiáng)脈沖光治療：近來有報(bào)道應(yīng)用光子嫩膚術(shù)及應(yīng)用Q開關(guān)激光治療黃褐斑部分患者有效。然而，以上這些療法對黃褐斑的改善效果皆非常有限，很難令人滿意。因此，進(jìn)一步開發(fā)用于改善黃褐斑的產(chǎn)品具有十分重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種組合物及其在制備改善黃褐斑的產(chǎn)品中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的組合物能夠抑制酪氨酸酶活性、降低細(xì)胞黑色素含量，從而有效改善黃褐斑。本發(fā)明提供的組合物中包括當(dāng)歸提取物、干細(xì)胞提取物A和干細(xì)胞提取物B；當(dāng)歸提取物由當(dāng)歸粉碎后水煎提取制得；干細(xì)胞提取物A由干細(xì)胞的培養(yǎng)上清液過濾、濃縮后凍干制得；干細(xì)胞提取物B由干細(xì)胞裂解后經(jīng)過濾制得。每100mL本發(fā)明提供的組合物中包括干細(xì)胞提取物A10mg～50mg；干細(xì)胞提取物B5mL～20mL；余量為當(dāng)歸提取物。每100mL本發(fā)明提供的組合物中包括干細(xì)胞提取物A20mg～40mg；干細(xì)胞提取物B5mL～20mL；余量為當(dāng)歸提取物。一些實(shí)施例中，每100mL本發(fā)明提供的組合物中包括干細(xì)胞提取物A20mg；干細(xì)胞提取物B5mL；余量為當(dāng)歸提取物。一些實(shí)施例中，每100mL本發(fā)明提供的組合物中包括干細(xì)胞提取物A40mg；干細(xì)胞提取物B20mL；余量為當(dāng)歸提取物。本發(fā)明提供的組合物中，干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。具體的，干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得方法為市場購得或自行制備本發(fā)明對此不做限定，其實(shí)施皆在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。干細(xì)胞的制備方法包括：步驟1：臍帶以含有200U/m雙抗的PBS溶液沖洗3遍后，剪成2cm長小段，剝?nèi)?dòng)、靜脈管和外膜后，剪碎成1-2mm2小塊，均勻貼附于10cm培養(yǎng)皿，37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)倒放1-2h；培養(yǎng)基為X-VIVO15無血清培養(yǎng)基；步驟2：加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養(yǎng)基，37℃5％CO2培養(yǎng)2～3天后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)6～8天，待細(xì)胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續(xù)培養(yǎng)；步驟3：待生長至80％融合，倒去培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS終止消化，400g離心5min收集臍帶間充質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明中，干細(xì)胞的培養(yǎng)的采用含有EGF的X-VIVO15無血清培養(yǎng)基；其中EGF的濃度為10ng/mL。干細(xì)胞的培養(yǎng)方法為，將細(xì)胞接種至含有EGF的X-VIVO15無血清培養(yǎng)基37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至80％融合后繼續(xù)傳代。干細(xì)胞提取物A的制備方法包括：將干細(xì)胞培養(yǎng)上清液以0.45μm濾膜過濾后，濾液再經(jīng)0.22μm濾膜過濾，所得濾液以切向流過濾器循環(huán)過濾3h后，經(jīng)冷凍干燥制得干細(xì)胞提取物A。干細(xì)胞培養(yǎng)上清液為P2或P3代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。干細(xì)胞提取物B的制備方法包括：收集干細(xì)胞以水重懸后，反復(fù)凍融3次后，0℃～4℃超聲震蕩3次，每次3min；所得細(xì)胞裂解液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后制得干細(xì)胞提取物B。本發(fā)明采用的干細(xì)胞為培養(yǎng)至P2或P3代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。重懸至細(xì)胞密度為1×106cell/mL～5×106cell/mL。凍融過程中，冷凍采用液氮，融化的溫度為37℃。超聲的功率為300w，頻率為20Hz～40Hz。當(dāng)歸的水煎提取中，當(dāng)歸與水的質(zhì)量-體積比為1g：(10mL～20mL)。水煎提取的溫度為80-100℃，時(shí)間為30-60min。水煎提取后，以100目篩網(wǎng)過濾，獲得當(dāng)歸提取物。本發(fā)明提供的組合物在制備抑制酪氨酸酶活性、降低細(xì)胞黑色素含量的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述細(xì)胞為小鼠B16黑色素細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，相對于不經(jīng)處理的空白對照，本發(fā)明提供的組合物能夠?qū)⒗野彼崦傅南鄬钚越档椭?9.8％，而細(xì)胞中黑色素的相對含量也被降低至82.8％。說明本發(fā)明提供的組合物能夠有效抑制酪氨酸酶活性、降低細(xì)胞黑色素含量。本發(fā)明提供的組合物在制備改善黃褐斑的產(chǎn)品中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明，給予本發(fā)明提供的組合物能夠有效改善黃褐斑，有效率可達(dá)95％；緩解率可達(dá)70％。本發(fā)明還提供了一種改善黃褐斑的產(chǎn)品，包括本發(fā)明提供的組合物。本發(fā)明提供的組合物可單獨(dú)用于改善黃褐斑，也可添加其他輔料制成不同的劑型用于改善黃褐斑，本發(fā)明對此不做限定。本發(fā)明還提供了一種改善黃褐斑的方法，該方法為給予本發(fā)明提供的組合物。給予本發(fā)明提供的組合物的劑量為每10cm2面積涂抹1-2ml。給予的方式為涂敷于黃褐斑區(qū)域。給藥過程中，還可以輔助刮痧處理等方式。刮痧采用玉石刮痧，刮痧板的形狀為魚形或四方形。本發(fā)明提供了一種組合物，其中包括當(dāng)歸提取物、干細(xì)胞提取物A和干細(xì)胞提取物B。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的組合物能夠?qū)⒗野彼崦傅南鄬钚越档椭?9.8％，而細(xì)胞中黑色素的相對含量也被降低至82.8％。說明本發(fā)明提供的組合物能夠有效抑制酪氨酸酶活性、降低細(xì)胞黑色素含量。該效果顯著優(yōu)于單獨(dú)給予當(dāng)歸提取物或單獨(dú)給予干細(xì)胞提取物的對照組。另外，將本發(fā)明提供的組合物用于改善黃褐斑，有效率可達(dá)95％；緩解率可達(dá)70％。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種組合物及其在制備改善黃褐斑的產(chǎn)品中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臍帶以含有200U/m雙抗的PBS溶液沖洗3遍后，剪成2cm長小段，剝?nèi)?dòng)、靜脈管和外膜后，剪碎成1-2mm2小塊，均勻貼附于10cm培養(yǎng)皿，37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)倒放1-2h；培養(yǎng)基為X-VIVO15無血清培養(yǎng)基；加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養(yǎng)基，37℃5％CO2培養(yǎng)2～3天后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)6～8天，待細(xì)胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續(xù)培養(yǎng)；待生長至80％融合，倒去培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS終止消化，400g離心5min收集臍帶間充質(zhì)細(xì)胞。以含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養(yǎng)基重懸臍帶間充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果接種2-3皿(接種密度為1-5×106cell/mL)。待細(xì)胞生長至80％融合后繼續(xù)傳代，至P2或P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞和培養(yǎng)上清液的收集。實(shí)施例2干細(xì)胞提取物A的制備收集實(shí)施例1中制得的P2和P3代干細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用Slice200切向流過濾器濃縮，循環(huán)過濾的時(shí)間為3h，該過程中，經(jīng)0.45μm濾膜過濾除去大顆粒物質(zhì)，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾，除去3kDa以下小顆粒物質(zhì)；濃縮液用凍干機(jī)制成凍干粉，即為干細(xì)胞提取物A。實(shí)施例3干細(xì)胞提取物B的制備收集實(shí)施例1中制得的P2或P3代細(xì)胞，加入純水重懸至細(xì)胞密度為1×106cell/mL～5×106cell/mL，放入液氮速凍5min，取出后37℃解凍；解凍后又放入液氮速凍，反復(fù)3次；在0～4℃冰水浴中超聲振蕩3min(功率300W，頻率20Hz～40Hz)，超聲振蕩3次；合并所得混懸液，在無菌條件下經(jīng)0.22μm濾膜過濾，制得干細(xì)胞提取物B。實(shí)施例4當(dāng)歸提取物的制備取當(dāng)歸洗凈晾干，研磨成粉，水煎提取(1g當(dāng)歸加水10mL～20mL；100℃，提取30min)，經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾得到濾液，制得100ml當(dāng)歸提取物。實(shí)施例5組合物的制備混合實(shí)施例4制得的當(dāng)歸提取物、實(shí)施例3制得的干細(xì)胞提取物B，加入實(shí)施例2制得的干細(xì)胞提取物A，制得組合物每100ml組合物中含有：干細(xì)胞提取物A20mg干細(xì)胞提取物B5mL其余為當(dāng)歸提取物。實(shí)施例6組合物的制備混合實(shí)施例4制得的當(dāng)歸提取物、實(shí)施例3制得的干細(xì)胞提取物B，加入實(shí)施例2制得的干細(xì)胞提取物A，制得組合物每100ml組合物中含有：干細(xì)胞提取物A40mg干細(xì)胞提取物B20mL其余為當(dāng)歸提取物。實(shí)施例7組合物對小鼠B16黑色素細(xì)胞的作用黃褐斑與黑色素細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑色素生成有直接的關(guān)系，所以對酪氨酸酶活性和黑色素生成能力的測定能直接反應(yīng)制劑治療黃褐斑的效果。對比試驗(yàn)流程如下：取小鼠B16黑色素細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml的密度接種于2個(gè)6孔板，(培養(yǎng)液為5％胎牛血清的1640培養(yǎng)基)。3塊6孔板每孔分別添加：孔1：不添加任何成分孔2：實(shí)施例3提供的干細(xì)胞提取物B孔3：實(shí)施例5提供的組合物5％體積濃度孔4：實(shí)施例5提供的組合物10％體積濃度孔5：實(shí)施例6提供的組合物5％體積濃度孔6：實(shí)施例6提供的組合物10％體積濃度置于37℃、5％CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。酪氨酸酶活力測定：第一塊6孔板培養(yǎng)3天后，用PBS清洗兩遍，消化細(xì)胞，加入96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞(設(shè)置5個(gè)復(fù)孔)，并同時(shí)分別設(shè)置空白組(培養(yǎng)基)和對照組(孔1，細(xì)胞加培養(yǎng)基)，加入加含1％的Triton-100(MERCK公司)的PBS100ul，冰浴超聲擊碎細(xì)胞，每孔添加再添加10ul的0.01mol/L的L-dopa(美國SIGMA公司)，37℃孵育1小時(shí)，于490nm處比色，測吸光度值。以A值表示酪氨酸酶活性大?。篈＝(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對照組-空白組)×100％黑色素含量測定：第二塊6孔板培養(yǎng)3天后，用PBS清洗兩遍，消化細(xì)胞，加入96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞(設(shè)置5個(gè)復(fù)孔)，并同時(shí)分別設(shè)置空白組(無細(xì)胞)和對照組(孔1細(xì)胞)，每孔加入200ul含10％二甲基亞砜(DMSO)的NaOH(1mol/L)溶液，于65℃水浴完全溶解黑色素顆粒，酶聯(lián)免疫檢測490nm處吸光度值，。以B值表示酪氨酸酶活性大?。築＝(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對照組-空白組)×100％檢測結(jié)果如表1：表1檢測結(jié)果組別酪氨酸酶活性A值(％)黑色素含量測定B值(％)孔1100±2.58100±1.15孔297.3±2.2897.5±1.83孔390.6±1.7285.4±1.23孔489.9±1.6986.3±1.17孔589.8±2.0588.7±0.98孔690.2±1.8482.8±1.08結(jié)果分析：從酪氨酸酶活性和黑色素含量測定分析結(jié)果可知，實(shí)施例5和6提供的組合物對酪氨酸酶活性具有明顯的抑制作用，該效果顯著(p<0.05)優(yōu)于單獨(dú)給予干細(xì)胞提取物B(干細(xì)胞裂解液)，并且，本發(fā)明提供的組合物對黑色素的形成的抑制效果更佳，該效果也顯著(p<0.05)優(yōu)于單獨(dú)使用干細(xì)胞提取物B(干細(xì)胞裂解液)。實(shí)施例7組合物對黃褐斑的改善作用隨機(jī)選擇患者100例，診斷結(jié)果為典型性黃褐色皮疹(黃褐斑)。其中男性34例，女性66例，年齡18～40歲，平均年齡25歲，病程1～8年，平均2.7年。所有病人隨機(jī)分為5組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對照組1：進(jìn)行常規(guī)面部護(hù)理；對照組2：僅以實(shí)施例4當(dāng)歸提取物涂敷對照組3：以實(shí)施例3干細(xì)胞提取物B涂敷實(shí)驗(yàn)組1：涂敷實(shí)施例5組合物；實(shí)驗(yàn)組2：涂敷實(shí)施例6組合物；所有病人持續(xù)治療跟蹤3年，療效評價(jià)參照黃褐斑的臨床診斷和療效判定標(biāo)準(zhǔn)?；局斡喝庋垡暽呙娣e消退﹥90％，顏色基本消失，評分法計(jì)算和治療后總積分下降指數(shù)﹥0.8；顯效：肉眼視色斑面積消退﹥60％，顏色明顯變淡，評分法計(jì)算和治療后總積分下降指數(shù)﹥0.5；緩解率＝治愈數(shù)/病例數(shù)有效率＝(顯效數(shù)+治愈數(shù))/病例數(shù)得到結(jié)果如表2：表2治療效果分組病例數(shù)治愈數(shù)顯效數(shù)緩解率有效率對照組1200000對照組22002010％對照組320185％40％實(shí)驗(yàn)組12012660％90％實(shí)驗(yàn)組22014570％95％結(jié)果表明，本發(fā)明提供的組合物對黃褐斑的改善效果優(yōu)于單獨(dú)給予當(dāng)歸提取物或干細(xì)胞提取物B，該效果具有顯著性。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3