本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種干細(xì)胞制劑及其在制備治療慢性腎炎的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：慢性腎炎：即慢性腎小球腎炎，系指蛋白尿、血尿、高血壓、水腫為基本臨床表現(xiàn)，起病方式各有不同，病情遷延，病變緩慢進(jìn)展，可有不同程度的腎功能減退，具有腎功能惡化傾向和最終將發(fā)展為慢性腎衰竭的一組腎小球病。大部分慢性腎炎的發(fā)病機(jī)制是免疫介導(dǎo)炎癥。另外，非免疫、非炎癥機(jī)制在疾病發(fā)展過程中起重要作用，如存在腎單位長(zhǎng)期代償處于血流高灌注、高濾過和高跨膜壓的“三高”狀態(tài)，久之導(dǎo)致健存腎小球硬化。慢性腎炎可發(fā)生于任何年齡，但以青中年為主，男性多見。多數(shù)起病緩慢、隱襲。慢性腎炎是一種自身免疫性疾病，其病理?yè)p害主要與免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，其結(jié)果是導(dǎo)致腎小球硬化，腎小管間質(zhì)纖維化。對(duì)于慢性腎炎的治療，盡管已經(jīng)闡釋了很多治療方式，仍無法阻止該病的發(fā)展。慢性腎炎的治療目前西醫(yī)多采用激素療法，但激素對(duì)病情的掩蓋性較強(qiáng)，副作用明顯，治標(biāo)不治本；中醫(yī)采用具有解毒、消炎作用的中藥材制成，但中藥治療的效果差強(qiáng)人意。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種干細(xì)胞制劑及其在制備治療慢性腎炎的藥物中的應(yīng)用，該制劑能夠有效治療慢性腎炎。本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和生理鹽水，其中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為1×105cell/mL～5×105cell/mL。一些實(shí)施例中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為1×105cell/mL。一些實(shí)施例中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為2×105cell/mL。一些實(shí)施例中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為5×105cell/mL。本發(fā)明制劑中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD29表達(dá)量≥95％；CD44表達(dá)量≥90％；CD105表達(dá)量≥95％；CD34表達(dá)量≤5％；CD45表達(dá)量≤2％；CD86表達(dá)量≤5％；HLA-DR不表達(dá)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得方法為市場(chǎng)購(gòu)得或自行制備本發(fā)明對(duì)此不做限定，其實(shí)施皆在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。干細(xì)胞的制備方法包括：步驟1：臍帶以含有200U/m雙抗的PBS溶液沖洗3遍后，剪成2cm長(zhǎng)小段，剝?nèi)?dòng)、靜脈管和外膜后，剪碎成1～2mm2小塊，均勻貼附于10cm培養(yǎng)皿，37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)倒放1～2h；培養(yǎng)基為X-VIVO15無血清培養(yǎng)基。步驟2：加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養(yǎng)基，37℃5％CO2培養(yǎng)2～3天后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)6～8天，待細(xì)胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續(xù)培養(yǎng)；步驟3：待生長(zhǎng)至80％融合，倒去培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS終止消化，400g離心5min收集臍帶間充質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明中，干細(xì)胞的培養(yǎng)的采用含有EGF的X-VIVO15無血清培養(yǎng)基；其中EGF的濃度為10ng/mL。干細(xì)胞的培養(yǎng)方法為，將細(xì)胞接種至含有EGF的X-VIVO15無血清培養(yǎng)基37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至80％融合后繼續(xù)傳代。本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑在制備抑制T細(xì)胞表面抗原CD8的表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑能夠?qū)細(xì)胞表面抗原CD8的表達(dá)量降低5％以上。本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑在制備促進(jìn)IL-4分泌的藥物中的應(yīng)用。所述IL-4為外周血T淋巴細(xì)胞的IL-4。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑能夠?qū)⑼庵苎猅淋巴細(xì)胞中IL-4的表達(dá)量上調(diào)15％以上。本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑在制備抑制INF-γ分泌的藥物中的應(yīng)用。所述INF-γ為外周血T淋巴細(xì)胞的INF-γ。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑能夠?qū)⑼庵苎猅淋巴細(xì)胞中INF-γ的表達(dá)量降低12％以上。本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑在制備降低尿蛋白含量、尿紅細(xì)胞數(shù)量的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)表明，給予本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑，38％的慢性腎炎患者的尿蛋白減少，與給予前相比下降50％以上，腎功能正常或基本正常，癥狀、體征有所改善，尿鏡檢紅細(xì)胞＜2個(gè)/HP。另有49％的慢性腎炎患者的尿蛋白減少，定量值小于0.4g/24h，腎功能正?；蚧菊＃Y狀、體征有所改善，尿鏡檢紅細(xì)胞＜2個(gè)/HP。說明本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑具有降低尿蛋白含量、尿紅細(xì)胞含量的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑在制備治療慢性腎炎的藥物中的應(yīng)用。綜合上述結(jié)果，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑能夠具有治療慢性腎炎的作用。本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑可單獨(dú)用于改善慢性腎炎，也可添加其他輔料制成不同的藥物劑型用于治療慢性腎炎，本發(fā)明對(duì)此不做限定。本發(fā)明還提供了一種治療慢性腎炎的藥物，其中包括本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑。本發(fā)明還提供了一種治療慢性腎炎的方式，具體為給予本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑。所述給予的方式為滴注，具體為靜脈滴注。給予的劑量為100mL/次。2天一次連續(xù)3次，3個(gè)月一個(gè)療程。本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑由生理鹽水重懸臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制成，其通過抑制T細(xì)胞表面抗原CD8的表達(dá)和INF-γ的分泌，并上調(diào)外周血T淋巴細(xì)胞的IL-4的分泌，進(jìn)而降低患者尿蛋白含量、尿紅細(xì)胞數(shù)量，從而起到治療慢性腎炎的作用，其治療的有效率可達(dá)88％，緩解率可達(dá)54％。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞制劑及其在制備治療慢性腎炎的藥物中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臍帶以含有200U/m雙抗的PBS溶液沖洗3遍后，剪成2cm長(zhǎng)小段，剝?nèi)?dòng)、靜脈管和外膜后，剪碎成1-2mm2小塊，均勻貼附于10cm培養(yǎng)皿，37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)倒放1-2h；培養(yǎng)基為X-VIVO15無血清培養(yǎng)基。加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養(yǎng)基，37℃5％CO2培養(yǎng)2～3天后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)6～8天，待細(xì)胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續(xù)培養(yǎng)；待生長(zhǎng)至80％融合，倒去培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS終止消化，400g離心5min收集臍帶間充質(zhì)細(xì)胞。以含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無血清培養(yǎng)基重懸臍帶間充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果接種2-3皿(接種密度為1-5×105cell/ml)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合后繼續(xù)傳代，至P2或P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞和培養(yǎng)上清液的收集。對(duì)收集后的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，選擇符合表1標(biāo)準(zhǔn)的干細(xì)胞制備干細(xì)胞制劑。表1干細(xì)胞篩選標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施例2干細(xì)胞制劑的制備收集實(shí)施例1中經(jīng)篩選的P2和P3代干細(xì)胞，以生理鹽水重懸至細(xì)胞密度為2×106cell/mL。實(shí)施例3干細(xì)胞制劑的制備收集實(shí)施例1中經(jīng)篩選的P2和P3代干細(xì)胞，以生理鹽水重懸至細(xì)胞密度為1×106cell/mL。實(shí)施例4干細(xì)胞制劑的制備收集實(shí)施例1中經(jīng)篩選的P2和P3代干細(xì)胞，以生理鹽水重懸至細(xì)胞密度為5×106cell/mL。實(shí)施例5檢測(cè)實(shí)施例2～4的干細(xì)胞制劑對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)炎癥相關(guān)抗原CD8的作用，及對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞分泌IL-4和INF-γ的作用實(shí)驗(yàn)方法為：在聚羥基脂肪酸酯(PHA，10g/ml濃度)存在條件下，將外周血T淋巴細(xì)胞(PBMC)與本發(fā)明制備的干細(xì)胞制劑共同培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3天。分組為：陽(yáng)性對(duì)照組：PHA+PBMC；實(shí)驗(yàn)組1：PHA+PBMC+實(shí)施例2干細(xì)胞制劑；實(shí)驗(yàn)組2：PHA+PBMC+實(shí)施例3干細(xì)胞制劑；實(shí)驗(yàn)組3：PHA+PBMC+實(shí)施例4干細(xì)胞制劑；3天后測(cè)定收集各組PBMC檢測(cè)CD8差異；收集各組上清液檢測(cè)IL-4和INF-γ濃度差異；結(jié)果如表1：表1細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3CD829.8％24.5％22.3％23.8％IL-40.27ug/ml0.35ug/ml0.32ug/ml0.41ug/mlINF-γ0.18ug/ml0.13ug/ml0.12ug/ml0.15ug/ml實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑能夠?qū)細(xì)胞表面抗原CD8的表達(dá)量降低5％以上。將外周血T淋巴細(xì)胞中IL-4的表達(dá)量上調(diào)15％以上。將外周血T淋巴細(xì)胞中INF-γ的表達(dá)量降低12％以上。實(shí)施例6隨機(jī)選取志愿患者200例，診斷結(jié)果符合原發(fā)性腎小球腎炎。其中男性112例，女性88例，年齡20-55歲，平均年齡33歲，病程1～5年，平均2.2年，血肌酐(SCr)≤177umol/L，并簽訂知情同意書。所有病人隨機(jī)分為4組進(jìn)行治療。對(duì)照組：現(xiàn)有專利藥物；實(shí)驗(yàn)組1：給予實(shí)施例2干細(xì)胞制劑；實(shí)驗(yàn)組2：給予實(shí)施例3干細(xì)胞制劑；實(shí)驗(yàn)組3：給予實(shí)施例4干細(xì)胞制劑；實(shí)驗(yàn)組1～3每人每次滴注本發(fā)明的干細(xì)胞制劑100mL，隔天回輸一次，3次一療程，間隔3個(gè)月進(jìn)行第二個(gè)療程。所有病人持續(xù)治療跟蹤3年，進(jìn)行療效評(píng)價(jià)：緩解：尿蛋白定量＜0.4g/24h，尿鏡檢紅細(xì)胞＜2個(gè)/HP，腎功能正常、癥狀、體征消失；有效：尿蛋白檢測(cè)持續(xù)減少比治療前下降50％以上，腎功能正常或基本正常，癥狀、體征有所改善。評(píng)價(jià)結(jié)果如表3：表3評(píng)價(jià)結(jié)果分組病例數(shù)緩解數(shù)有效數(shù)緩解率有效率陽(yáng)性對(duì)照5092818％74％實(shí)驗(yàn)組150251850％86％實(shí)驗(yàn)組250271754％88％實(shí)驗(yàn)組350222244％88％結(jié)果表明，本發(fā)明提供的組合物對(duì)慢性腎炎的有效率可達(dá)88％，緩解率可達(dá)54％。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3