本發(fā)明涉及苦豆堿的應(yīng)用，尤其涉及苦豆堿在制備預(yù)防和作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物中的用途。

背景技術(shù)：

肺動(dòng)脈高壓是一組以肺動(dòng)脈壓力、肺血管阻力進(jìn)行性增高，進(jìn)而產(chǎn)生右心室后負(fù)荷增大，肺循環(huán)血流減少為特征的臨床綜合征，持續(xù)增加的肺血管阻為可導(dǎo)致右心室衰竭，最終導(dǎo)致死亡。研究發(fā)現(xiàn)，肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制包括肺血管內(nèi)皮功能紊亂、肺部炎癥反應(yīng)、肺動(dòng)脈血管收縮、肺血管壁重構(gòu)和平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡失衡等。就目前治療肺動(dòng)脈高壓的藥物來說，其長(zhǎng)期有效性較差。因此，尋找具有抑制甚至逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈高壓發(fā)展且價(jià)格低廉的藥物，具有深遠(yuǎn)的研究意義。

近年來，越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展中起到重要作用。有研究表明，白芷、氧化苦參堿等藥物可以通過影響氧化應(yīng)激從而抑制肺動(dòng)脈高壓。此外，磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶(NOX)作為一種活性氧物質(zhì)的生成酶，成為肺動(dòng)脈高壓研究中的熱點(diǎn)。研究證實(shí)可以藥物可以通過降低NOX的表達(dá)而抑制肺動(dòng)脈高壓、高血壓等心血管疾病的發(fā)展。其中NOX-4所介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)生成增多可促進(jìn)肺血管平滑肌細(xì)胞的增生和肥大，誘導(dǎo)肺血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生與發(fā)展，而NOX-2源性活性氧物質(zhì)生成增多是導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮損傷的重要原因。所以，對(duì)抗氧化應(yīng)激和NOX-2、NOX-4的表達(dá)可能是治療肺動(dòng)脈高壓的靶點(diǎn)。

苦豆子在寧夏有大量的野生和人工種植資源，是寧夏回族自治區(qū)“十二五科技發(fā)展規(guī)劃”中重點(diǎn)支持大面積規(guī)范化種植和優(yōu)先深度開發(fā)并產(chǎn)業(yè)化的特色植物之一，傳統(tǒng)具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、抗菌消炎、止痛殺蟲等作用。苦豆堿是從苦豆子中提取的一種主要生物堿，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等作用。在本課題組之前的研究中，苦豆堿通過抗氧化應(yīng)激治療神經(jīng)性疼痛。但是否對(duì)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生與發(fā)展具有抑制作用，其作用機(jī)制是否與抗氧化應(yīng)激有關(guān)，目前尚未闡明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過對(duì)苦豆堿的藥理作用研究，提供苦豆堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的：

本發(fā)明提供的苦豆堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途，所述苦豆堿的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

具體地，所述肺動(dòng)脈高壓為右心室肥厚、肺小動(dòng)脈重構(gòu)等多方面的改變，表現(xiàn)為肺動(dòng)脈壓力的升高。苦豆堿的用量在不引起毒副作用的范圍內(nèi)，可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、體表面積、所治療疾病的嚴(yán)重程度等有所變化，每日一次或多次使用，本發(fā)明經(jīng)過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定了所述苦豆堿的單次應(yīng)用量為大鼠25-100mg/kg，人3.97mg/kg–15.87mg/kg；標(biāo)準(zhǔn)體重人70kg單次使用量277.8mg-1111.1mg。

優(yōu)選地，所述苦豆堿單次應(yīng)用劑量為大鼠50-100mg/kg。

優(yōu)選地，所述苦豆堿單次應(yīng)用劑量為大鼠100mg/kg。

具體地，所述苦豆堿單次應(yīng)用劑量?jī)H限于不引起血糖降低的劑量。

具體地，所述藥物的劑型為藥劑學(xué)上允許的口服劑型或注射劑型。

本發(fā)明提供的苦豆堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途具有以下有益效果：

(1)苦豆堿顯著降低野百合堿所致肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺動(dòng)脈壓力，減少右心室的肥大，抑制肺中小動(dòng)脈的肥厚；

(2)苦豆堿減弱氧化應(yīng)激脂質(zhì)過氧化作用，促進(jìn)氧自由基清除劑含量的恢復(fù)，顯著抑制了肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中NOX-2、NOX-4蛋白的表達(dá)。

本發(fā)明首次證實(shí)，苦豆堿具有治療野百合堿致大鼠肺動(dòng)脈高壓的作用，可用于制備肺動(dòng)脈高壓的治療藥物。

附圖說明

圖1為苦豆堿對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠mPAP、RVSP及RVHI的影響；

(mPAP：肺動(dòng)脈平均壓；RVSP：右心室收縮壓；RVHI：右心室肥厚指數(shù))

圖2為苦豆堿影響野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺小動(dòng)脈重構(gòu)的H.E染色圖(圖2A為對(duì)照組，圖2B為模型組，圖2C為苦豆堿低劑量組，圖2D為苦豆堿中劑量組，圖2E為苦豆堿高劑量組，圖2F為西地那非組)；

圖3為苦豆堿對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺小動(dòng)脈WT％、WA％指標(biāo)的影響；

(WT％：肺小動(dòng)脈管壁厚度占血管外徑的百分比；WA％：肺小動(dòng)脈管壁面積占血管總面積的百分比)

圖4為苦豆堿影響野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺小動(dòng)脈α-SMA染色圖(圖4A為對(duì)照組，圖4B為模型組，圖4C為苦豆堿低劑量組，圖4D為苦豆堿中劑量組，圖4E為苦豆堿高劑量組，圖4F為西地那非組)；

圖5為苦豆堿對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺小動(dòng)脈α-SMA表達(dá)的影響；

(α-SMA：α平滑肌肌動(dòng)蛋白)

圖6為苦豆堿對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中MDA含量、SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC活性的影響；

(SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化氫酶；T-AOC：總抗氧能力；GSH-PX：谷胱甘肽過氧化物酶；MDA：丙二醛)

圖7為苦豆堿對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中NOX-2表達(dá)水平的影響；

(NOX-2：磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶-2)

圖8為苦豆堿對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中NOX-4表達(dá)水平的影響。

(NOX-4：磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶-4)

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1

苦豆堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途，苦豆堿的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

其中，苦豆堿單次應(yīng)用劑量為大鼠25mg/kg，藥物的劑型為口服劑型。

實(shí)施例2

苦豆堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途，苦豆堿的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

其中，苦豆堿單次應(yīng)用劑量為大鼠50mg/kg，藥物的劑型為口服劑型。

實(shí)施例3

苦豆堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途，苦豆堿的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

其中，苦豆堿單次應(yīng)用劑量為大鼠100mg/kg，藥物的劑型為口服劑型。

實(shí)施例1-3的效果可以通過下面的實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果得到證實(shí)：

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物處理

180-220g雄性SD大鼠，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：NCXK(寧)2015-0005。喂養(yǎng)條件包括標(biāo)準(zhǔn)飼料、自來水、室溫保持在(21±2)℃、濕度50-60％、每日光照與黑暗時(shí)間各12小時(shí)。實(shí)驗(yàn)前，將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)7天。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品和儀器

苦豆堿(購(gòu)自寧夏都順公司)，以生理鹽水配制。野百合堿(購(gòu)自Sigma公司)；SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC、MDA試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)；兔抗NOX-2、NOX-4單克隆抗體(購(gòu)自Abcam公司)，兔抗α-SMA單克隆抗體(購(gòu)自Proteintech公司)；酶標(biāo)儀(1510，Thermo Fisher公司)，電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(Powerpac basic，美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠成像分析儀(JS-860B，上海培清公司)，MPA心功能分析儀(上海奧爾科特公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥

雄性SD大鼠，體重180-220g，隨機(jī)分為6組：對(duì)照組、肺動(dòng)脈高壓模型組、模型+西地那非陽(yáng)性藥物(30mg/kg)組、模型+苦豆堿不同劑量(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)組。肺動(dòng)脈高壓模型組、模型+西地那非陽(yáng)性藥物組、模型+苦豆堿不同劑量組在實(shí)驗(yàn)第1天頸背部皮下注射野百合堿溶液(60mg/kg)造模，對(duì)照組頸背部皮下注射等量生理鹽水?？喽箟A各劑量組和陽(yáng)性藥組造模后21天連續(xù)給藥21天(給藥量0.1ml/10g，灌胃，每天一次)，對(duì)照組和模型組大鼠給予等量溶劑，給藥期間大鼠飲食和飲水不受限制。

1.4野百合堿致大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的制備

大鼠在造模之前，配制60mg/kg野百合堿溶液：300mgMCT先溶于1.8ml 1M HCl,然后加入3-4ml雙蒸水，以1M NaOH調(diào)PH至7.4，最后雙蒸水補(bǔ)至15ml。然后以0.1ml/10g的給藥量采用頸背部皮下注射造模：左手拇指與食指輕捏住大鼠頸部背側(cè)松弛的皮膚，將注射針自大鼠頭部向其尾部的方向，插入左手拇食指間夾住的頸背側(cè)皮膚處。在注射后將大鼠放回鼠籠，自由飲食和飲水，21天后造模完成。對(duì)照組動(dòng)物頸背部皮下注射等量生理鹽水。

二、實(shí)驗(yàn)過程

(一)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

1.1實(shí)驗(yàn)方法：

1.1.1右心導(dǎo)管法測(cè)量右心室收縮壓和肺動(dòng)脈平均壓：

將大鼠稱重后，以20％烏拉坦1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，待呼吸均勻穩(wěn)定后，固定于手術(shù)臺(tái)上，打開MPA心功能分析儀，小心分離右側(cè)頸外靜脈，在右頸外靜脈遠(yuǎn)心端絲線結(jié)扎，用鑷子柄承在血管下，以眼科剪于絲線結(jié)扎點(diǎn)近心4mm處向近心端呈45°角斜行剪開血管直徑的1/3，迅速沿此切口方向?qū)?dǎo)管插入血管，利用另一根結(jié)扎線結(jié)扎導(dǎo)管(結(jié)扎松緊適度，既要保證切口處無滲血，又要保證導(dǎo)管可以順利地插入)向前緩慢推進(jìn)導(dǎo)管，如遇阻力不可硬推，要緩慢旋轉(zhuǎn)調(diào)整導(dǎo)管，改變其尖端朝向，一旦合適即可根據(jù)壓力波形曲線壓力值和導(dǎo)管進(jìn)入的長(zhǎng)度來判斷導(dǎo)管口所處的位置，依次進(jìn)入頸總靜脈-上腔靜脈-右心房-右心室，當(dāng)出現(xiàn)典型右心室波形時(shí)穩(wěn)定片刻后測(cè)定并記錄右心室收縮壓(RVSP)，再將導(dǎo)管送入肺動(dòng)脈，出現(xiàn)典型肺動(dòng)脈波形時(shí)穩(wěn)定片刻后記錄肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)，測(cè)定完畢后將導(dǎo)管從肺動(dòng)脈中退出。

1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由表1和圖1可知，肺動(dòng)脈高壓模型組大鼠在造模后mPAP、RVSP等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)相對(duì)對(duì)照組有明顯的升高。在連續(xù)灌胃給予苦豆堿治療之后mPAP、RVSP等指標(biāo)均有下降，當(dāng)劑量增加作用增強(qiáng)，至劑量100mg/kg時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng)(與模型組對(duì)比P﹤0.01)，實(shí)驗(yàn)并設(shè)西地那非(30mg/kg)陽(yáng)性藥對(duì)照組。提示苦豆堿(100mg/kg，50mg/kg，25mg/kg)具有減輕野百合堿所致大鼠肺動(dòng)脈高壓的作用，對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓的保護(hù)作用呈劑量相關(guān)性。

表1.苦豆堿對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓的保護(hù)作用(n＝6)

(與對(duì)照組比較：^#P<0.05，^##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01)

(二)右心室肥厚指數(shù)及肺指數(shù)檢測(cè)

2.1實(shí)驗(yàn)方法：

在血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)完成之后，取出完整的心肺，剪除血管根部和心房等組織，分離心肺，分離右心室(RV)和左心室加室間隔(LV+S)，用濾紙吸去表面水分后，稱取肺組織重、右心室重和左心室加室間隔重，計(jì)算肺指數(shù)和右心室肥厚指數(shù)(RVHI)。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由表1和圖1可知，肺動(dòng)脈高壓模型組大鼠在造模后RVHI、肺指數(shù)相對(duì)對(duì)照組有明顯的升高。在連續(xù)灌胃給予苦豆堿治療之后RVHI、肺指數(shù)均有下降，當(dāng)劑量增加作用增強(qiáng)，至劑量100mg/kg時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng)(與模型組對(duì)比P﹤0.05)，實(shí)驗(yàn)并設(shè)西地那非(30mg/kg)陽(yáng)性藥對(duì)照組。提示苦豆堿(25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg)具有減輕野百合堿所致肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室肥大的作用，對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室肥大的保護(hù)作用呈劑量相關(guān)性。

(三)超聲心動(dòng)圖

3.1實(shí)驗(yàn)方法：

將大鼠稱重后，以10％水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，待呼吸均勻穩(wěn)定后，胸前備毛，固定于手術(shù)臺(tái)上，使用GE VIVID7超聲心動(dòng)儀、。依次分別檢測(cè)肺動(dòng)脈加速時(shí)間(PAAT)、肺動(dòng)脈減速率(PAD)等指標(biāo)。

3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由表2可知，肺動(dòng)脈高壓模型組大鼠在造模后PAAT、PAD等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)相對(duì)對(duì)照組有明顯的升高。在連續(xù)灌胃給予苦豆堿治療之后PAAT、PAD等指標(biāo)均有下降，當(dāng)劑量增加作用增強(qiáng)，至劑量100mg/kg時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng)(與模型組對(duì)比P﹤0.05，P﹤0.01)，實(shí)驗(yàn)并設(shè)西地那非(30mg/kg)陽(yáng)性藥對(duì)照組。提示苦豆堿(25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg)具有減輕野百合堿所致大鼠肺動(dòng)脈高壓的作用，對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓的保護(hù)作用呈劑量相關(guān)性。

表2.苦豆堿對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)的影響

(與對(duì)照組比較：^#P<0.05，^##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01)

(四)HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)病理變化

4.1實(shí)驗(yàn)方法：

在血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)完成之后，取出完整的心肺，分離右肺下葉組織，用6-8ml 4％多聚甲醛沖洗緩慢其中的殘留的血液，放入4％多聚甲醛固定48小時(shí)。蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，H.E staining)，石蠟切片于65℃烘箱中烘烤20min，之后將玻片依次浸泡于二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(5min)，無水乙醇Ⅰ(1min)，無水乙醇Ⅱ(1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗三次，之后于蘇木素中浸泡5min，水洗3次，在1％的鹽酸酒精溶液中浸泡20s，水洗3次，伊紅溶液中浸泡2min，水速洗，之后石蠟切片繼續(xù)依次浸泡于80％乙醇(30s)，95％乙醇(30s)，無水乙醇Ⅰ(1min)，無水乙醇Ⅱ(3min)，二甲苯Ⅰ(2min)和二甲苯Ⅱ(2min)，最后用中性樹膠封片。每組大鼠肺組織石蠟切片HE染色完成后，置于顯微鏡下觀察，每張切片使用400×視野，每個(gè)切片分別取20個(gè)相對(duì)圓整的血管進(jìn)行拍照記錄。選取直徑50～300μm肺小動(dòng)脈，使用顯微鏡專用測(cè)微尺，計(jì)算管壁厚度占血管外徑的百分比(WT％)和管壁面積占血管總面積的百分比(WA％)。

4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖2和圖3所示，肺動(dòng)脈高壓模型組大鼠在造模后WT％、WA％相比對(duì)照組有明顯的升高。對(duì)比模型組，苦豆堿給藥組隨劑量增加大鼠肺組織肺中小動(dòng)脈肥厚病理變化減輕，WT％、WA％下降(與模型組對(duì)比P﹤0.05，P﹤0.01)，實(shí)驗(yàn)并設(shè)西地那非(30mg/kg)陽(yáng)性藥對(duì)照組，提示苦豆堿(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、)具有減輕野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中小動(dòng)脈肥厚的作用。

(五)免疫組化檢測(cè)大鼠肺中小動(dòng)脈α平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)

5.1實(shí)驗(yàn)方法：

在血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)完成之后，取出完整的心肺，分離右肺下葉組織，用6-8ml 4％多聚甲醛沖洗緩慢其中的殘留的血液，放入4％多聚甲醛固定48小時(shí)。制作成石蠟切片后，于65℃烘箱中烘烤20min，之后將玻片依次浸泡于二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(5min)，無水乙醇Ⅰ(1min)，無水乙醇Ⅱ(1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗三次脫蠟。蒸餾水浸泡3次,每次各5分鐘，PBS浸泡5分鐘；將切片水浴加熱至95-98℃，恒溫15分鐘后取出；

PBS沖洗3次,每次5分鐘；用3％雙氧水37℃孵育15分鐘以淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS沖洗3次,每次5分鐘；之后封閉、加入一抗室溫孵育2小時(shí)；PBS清洗3次,每次5分鐘；甩去PBS后，加入二抗，37℃孵育30分鐘；PBS清洗3次,每次5分鐘；甩去PBS后，DAB顯色，復(fù)染、分化、透明，中性樹膠封片。每組大鼠肺組織石蠟切片免疫組化染色完成后，使用400×視野，置于顯微鏡下觀察拍照，記錄α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)大鼠肺組織小動(dòng)脈中的表達(dá)情況。

5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖4和圖5所示，肺動(dòng)脈高壓模型組大鼠在造模后α-SMA表達(dá)水平相比對(duì)照組有明顯的升高。對(duì)比模型組，苦豆堿給藥組隨劑量增加大鼠肺組織肺中小動(dòng)脈肥厚病理變化減輕，α-SMA表達(dá)下降(與模型組對(duì)比P﹤0.05，P﹤0.01)。實(shí)驗(yàn)并設(shè)西地那非(30mg/kg)陽(yáng)性藥對(duì)照組，提示苦豆堿(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)具有減輕野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中小動(dòng)脈肌化的作用。

(六)生化指標(biāo)檢測(cè)

6.1實(shí)驗(yàn)方法：

在血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)完成之后，取出完整的心肺，分離左肺組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗其中的殘留的血液，放入-80℃冰箱中待用。使用硫酸浸泡過的玻璃勻漿器按按9：1(V/W)加入組織裂解液冰上操作，反復(fù)勻漿20次至肉眼不見組織塊，離心取上清液。使用牛血清白蛋白按考馬斯亮藍(lán)法在酶標(biāo)儀562nm處檢測(cè)待測(cè)樣品吸光度，做總蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(R²>0.99)并測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織蛋白濃度，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。

6.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由表3和圖6可知，連續(xù)灌胃給予苦豆堿對(duì)野百合堿所致大鼠肺組織生化指標(biāo)變化呈現(xiàn)雙向反應(yīng)，隨劑量的增加，腦組織中抗氧化劑(SOD、GSH-px、CAT、T-AOC)活性增強(qiáng)，丙二醛(MDA)含量降低，至100mg/kg時(shí)肺組織內(nèi)的氧自由基清除劑活性最強(qiáng)，丙二醛含量最低(與模型組對(duì)比P﹤0.05，P﹤0.01)。實(shí)驗(yàn)并設(shè)西地那非(30mg/kg)陽(yáng)性藥對(duì)照組。提示苦豆堿(100mg/kg)均具有減輕野百合堿致大鼠肺組織的氧化應(yīng)激損傷作用。

表3.苦豆堿對(duì)野百合堿致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中MDA含量、SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC活性的影響(n＝6)

(與對(duì)照比較：^##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01)

(七)Western blot檢測(cè)大鼠肺組織NOX-2、NOX-4蛋白的表達(dá)

7.1實(shí)驗(yàn)方法：

使用凱基全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣本總蛋白質(zhì)濃度并標(biāo)定蛋白統(tǒng)一濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜(NC膜)進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出硝酸纖維素膜，將膜置入5％脫脂奶粉封閉液中封閉1h。封閉結(jié)束孵育5％脫脂奶粉稀釋的一抗，4℃過夜，室溫復(fù)溫1h，洗膜后孵育二抗。用PBST洗NC膜三次，每次10min。滴加蛋白化學(xué)發(fā)光劑(ECL)，NC膜固定于片盒內(nèi)，壓入膠片進(jìn)行曝光。取出膠片，放入顯影液和定影液中各1min，最后清水清洗。凝膠圖像分析成像系統(tǒng)(培清，JS-860B)對(duì)膠片上每個(gè)目的條帶進(jìn)行掃描和圖像分析。

7.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖7和圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織NOX-2、NOX-4蛋白表達(dá)明顯增加(與對(duì)照組相比P<0.01)；與模型組比較，苦豆堿(100mg/kg)、西地那非(30mg/kg)組大鼠肺組織NOX-2、NOX-4蛋白表達(dá)顯著減少(與模型組相比P<0.05，P﹤0.01)。提示苦豆堿的保護(hù)作用可能通過降低NOX-2、NOX-4的表達(dá)與活化，減少肺組織活性氧物質(zhì)(ROS)的異常增加，對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠起到一定的保護(hù)作用。

以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。