本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種預(yù)防和控制人乳頭狀瘤病毒感染的敷料及其制備方法。
背景技術(shù)：
：在科技不斷進步的今天，人們?nèi)匀粚Π┌Y束手無策。隨著科學(xué)家不斷的努力探索，對癌癥的發(fā)病機制仍不了解。但是有一種癌癥發(fā)病機制被世衛(wèi)組織所確認—宮頸癌，宮頸癌是由感染人乳頭狀瘤病毒(HPV病毒)所致。HPV病毒是一種乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是球形雙鏈DNA病毒，能引起人體皮膚及黏膜上皮的鱗狀上皮增殖。會引起多樣的病狀，包括刺瘤、疣、生殖器扁平濕疣等。不同型別的HPV病毒會引起不同的病癥，它們的分布存在組織特異性。例如HPV2主要引起皮膚疣。經(jīng)過科學(xué)家不斷的研究，目前已發(fā)現(xiàn)與人相關(guān)的HPV已達100多種，它們的核苷酸序列有著本質(zhì)的區(qū)別，根據(jù)生物學(xué)和生存期的不同大致可分為兩類：α種屬和β種屬；其中α種屬僅存在于人類及靈長類動物，它們與宮頸癌的發(fā)生緊密相關(guān)，其中50％宮頸癌的發(fā)生與HPV16有關(guān)，20％的宮頸癌發(fā)生與HPV18有關(guān)。同時，α種屬又分為高危型HPV14種，其余的為低危型HPV。高危型HPV包括HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。美國國家癌癥研究所的一項研究指出，約10％感染HPV16型和18型的女性會在感染后3年內(nèi)發(fā)展至高度宮頸癌前病變(感染其它高危型HPV的女性中約有4％會出現(xiàn)這種情況)，20％的女性會在10年內(nèi)發(fā)展至高度宮頸癌前病變(其它高危型HPV約7％)。低危型HPV不會引起宮頸癌，但是這些HPV會引起生殖道尖銳濕疣或非常微弱的宮頸細胞變化，如HPV-6、11、40、42、43、44、53、54、61、72、73和81。其中，HPV6和11是最常見的低危型HPV，90％的生殖道尖銳濕疣與之相關(guān)。因此，高危型HPV感染是引起宮頸病變尤其是惡性病變的首要原因。目前，宮頸癌是危害女性健康的主要殺手。研究表明90％以上的宮頸癌中都能檢測到HPVDNA，這也是世界衛(wèi)生組織確認宮頸癌是由HPV引起的主要證據(jù)。我國宮頸癌發(fā)病率居于世界第二，而且呈年輕化趨勢，每年有將近15萬新發(fā)病例，約占世界患者的1/3，約8萬人因此死去。而人類是HPV病毒唯一宿主，從感染HPV病毒到發(fā)展成宮頸癌至少需要十年時間，其中病毒與細胞接觸是HPV感染宿主的必要和先決條件；期間經(jīng)過感染人粘膜上皮、上皮受損產(chǎn)生創(chuàng)傷、病毒接觸并進入細胞(預(yù)防和清除的最佳時期)、病毒成熟并釋放感染更多的組織上皮，進一步導(dǎo)致創(chuàng)傷擴大，最終導(dǎo)致病情加重惡化使免疫系統(tǒng)無法清除形成疣、宮頸糜爛、宮頸癌等。目前，國內(nèi)外公認的預(yù)防HPV病毒最有效的方式是注射HPV病毒疫苗，經(jīng)過大面積臨床實驗驗證HPV疫苗的確可以預(yù)防一些HPV病毒的感染。市面上已有針對HPV16和HPV18葛蘭素史克的二價疫苗和HPV-6、11、16、18、31、33、45、52、58默沙東的九價疫苗。但是，HPV疫苗不能預(yù)防所有型別的HPV，同時價格也比較昂貴。此外，在治療上目前沒有對應(yīng)的特效藥物治療HPV病毒引起的病癥，大部分采用諸如干擾素等治療。干擾素類藥物在不僅容易產(chǎn)生抗性，同時也存在著療效不明顯且價格昂貴等缺陷。因此，現(xiàn)階段急需一種能有效清除人體內(nèi)HPV病毒且對人無毒害作用的生物制劑及藥物。近年來，抗HPV病毒的藥物及生物制劑研究發(fā)展極為迅速。其中，傳統(tǒng)中藥在治療HPV病毒方面發(fā)揮著重要作用，例如雄黃、黃連等可用于治療持續(xù)性HPV病毒引起的宮頸上皮瘤變。另外一些中藥復(fù)方在HPV治療方面發(fā)揮著作用，例如清毒栓等。來源于動植物的天然產(chǎn)物如多糖、糖脂、多肽等物質(zhì)，在抗流感病毒方面有著顯著的活性。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一些多糖可以治療和預(yù)防HPV感染，實驗數(shù)據(jù)表明這些多糖類病毒清除率達到100％。本發(fā)明解決了市面上缺乏有效抗HPV病毒的生物制劑，給婦女同胞帶來了福音。香菇擔子菌綱傘菌屬，含有多種生物活性物質(zhì)，其中香菇菌多糖是其中重要活性成分。它在抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗感染以及提高人的免疫力方面發(fā)揮著重要的作用。香菇菌多糖是由葡萄糖聚合而成，側(cè)鏈部分還含有其他的糖基、蛋白等基團可提高它的生物學(xué)活性。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了香菇菌多糖硫酸酯在制備預(yù)防和治療HPV病毒感染的藥物中的應(yīng)用。香菇菌多糖硫酸酯對HPV病毒具有很好的清除效果。香菇菌多糖硫酸酯在制備預(yù)防和治療HPV病毒感染的藥物中的應(yīng)用。將香菇菌多糖與硫酸反應(yīng)產(chǎn)生香菇菌多糖硫酸酯。由于該多糖攜帶了硫酸基團，而硫酸基團帶有負電荷，使得香菇菌多糖硫酸酯表面帶有大量的負電荷。HPV病毒蛋白外殼L1區(qū)C端和L2區(qū)N端帶有正電荷，因此香菇菌多糖硫酸酯可以競爭性的結(jié)合HPV蛋白外殼L1區(qū)C端和L2區(qū)N端帶有正電荷區(qū)域，占位阻斷HPV與基底膜受體HSPG結(jié)合。阻斷了HPV識別宿主細胞的唯一途徑，從而使HPV病毒不能感染人。同時，經(jīng)過驗證，被修飾過的香菇菌多糖并不影響其原有的功能，如增強人體免疫力、誘發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生干擾素等。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率的大小對香菇菌多糖硫酸酯清除HPV病毒具有重要影響。在硫酸根修飾率較低時，香菇菌多糖硫酸酯清除HPV病毒能力隨著硫酸根修飾率的增大而增強；當硫酸根修飾率到達一定水平后，大約為20％左右，此時再增加硫酸根修飾率，則香菇菌多糖硫酸酯清除HPV病毒能力將減小。優(yōu)選的，所述的香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率不小于10％。進一步優(yōu)選的，所述的香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率不小于20％。本發(fā)明又提供了一種香菇菌多糖硫酸酯敷料，質(zhì)量百分比組成為：優(yōu)選的，所述的香菇菌多糖硫酸酯敷料，質(zhì)量百分比組成為：優(yōu)選的，所述的香菇菌多糖硫酸酯敷料中，所述的香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率不小于10％。進一步優(yōu)選的，所述的香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率不小于20％。優(yōu)選的，所述的香菇菌多糖硫酸酯敷料的制備方法，包括以下步驟：(1)將香菇菌多糖硫酸酯溶于水中，膜過濾除菌；(2)將卡波姆在水中充分溶脹、溶解；(3)將泊洛沙姆、甘油、三氯生溶于水中，調(diào)節(jié)pH至三氯生完全溶解；(4)將步驟(1)(2)(3)所得溶液以及EDTA二鈉混勻，補足水同時調(diào)節(jié)pH到4.5～6.5。優(yōu)選的，所述的制備方法中，所述香菇菌多糖硫酸酯采用氯磺酸-吡啶法制備，氯磺酸與吡啶的體積比為1∶1～5，酯化反應(yīng)時間不少于2小時，酯化反應(yīng)溫度為30～90℃。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)香菇菌多糖硫酸酯對清除HPV病毒具有很好的效果，而且香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率大小對香菇菌多糖硫酸酯清除HPV病毒具有重要影響。在硫酸根修飾率較低時，香菇菌多糖硫酸酯清除HPV病毒能力隨著硫酸根修飾率的增大而增強；當硫酸根修飾率到達一定水平后，大約為20％左右，此時再增加硫酸根修飾率，則香菇菌多糖硫酸酯清除HPV病毒能力將減小。具體實施方式實施例1～4香菇菌多糖購買自上海源葉生物科技有限公司(貨號37339-90-5)。利用氯磺酸-吡啶法制備香菇菌多糖硫酸酯，無水吡啶10mL置于裝有冷凝管和攪拌裝置的三頸燒瓶中，經(jīng)冰鹽浴冷卻后，劇烈攪拌，緩慢滴加4mL氯磺酸，繼續(xù)攪拌30分鐘，出現(xiàn)大量淡黃色固體，反應(yīng)結(jié)束，即制得酯化反應(yīng)試劑。稱取精制的0.5g香菇菌多糖溶于25mL無水甲酰胺，渦旋制成均勻的懸液，倒入預(yù)熱的酯化試劑的燒瓶中，不停攪拌，水浴溫度維持在60℃，脂化反應(yīng)時間t小時。反應(yīng)結(jié)束后去除燒瓶冷卻至室溫，加入3倍體積的無水乙醇，靜置離心，沉淀即為香菇菌多糖硫酸酯。將沉淀在雙蒸水中透析3天，在PBS中透析一天，通過BaCl2-明膠法確定硫酸根的修飾率；使用葡萄糖標準曲線法確定最終多糖濃度。結(jié)果如表1所示，在一定范圍內(nèi)，增加酯化反應(yīng)時間有利于增加所得香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率，而多糖回收率基本不影響。表1實施例酯化反應(yīng)時間t(h)硫酸根修飾率(％)多糖回收率(％)實施例118.963.4實施例2217.366.5實施例3421.965.2實施例4625.264.5實施例5～7檢測不同氯磺酸與吡啶比例對所得香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率的影響。其余參數(shù)與實施例3相同，僅氯磺酸與吡啶的體積比不一樣，氯磺酸的用量均為4mL，所以只是吡啶的量有差別。分別檢測硫酸根修飾率和多糖回收率，實驗結(jié)果如表2所示，隨著氯磺酸與吡啶的體積比降低，所得香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率也降低，但多糖回收率增加。表2實施例氯磺酸與吡啶的體積比硫酸根修飾率(％)多糖回收率(％)實施例51∶125.343.4實施例61∶2.519.266.5實施例71∶512.171.8實施例8～10檢測不同酯化反應(yīng)溫度對所得香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率的影響。其余參數(shù)與實施例3相同，僅酯化反應(yīng)溫度不一樣。分別檢測硫酸根修飾率和多糖回收率，實驗結(jié)果如表3所示，酯化反應(yīng)溫度越高，香菇菌多糖硫酸酯的硫酸根修飾率越高，而多糖回收率則越低。表3實施例酯化反應(yīng)溫度(℃)硫酸根修飾率(％)多糖回收率(％)實施例83018.759.5實施例96025.363.4實施例109031.029.3實施例111)構(gòu)建HPV假病毒假病毒是指一種反轉(zhuǎn)錄病毒能夠整合另外一種不同種類病毒的囊膜糖蛋白，從而形成的具有外源性病毒的囊膜，而基因組保持著反轉(zhuǎn)錄病毒本身基因組特性的病毒。假病毒的感染能力與正常病毒沒有區(qū)別，但是假病毒進入細胞不能進行正常增殖，而后會自行滅亡，對細胞沒有危害。因此，這也是公認的模擬HPV病毒感染最有效的方式。據(jù)Buck等人報道(Buck,C.B.,D.V.Pastrana,D.R.Lowy,andJ.T.Schiller,Efficientintracellularassemblyofpapillomaviralvectors.JVirol,2004.78(2):p.751-7.)，他們將優(yōu)化的HPV膜結(jié)構(gòu)蛋白L1、L2的基因構(gòu)建到真核生物表達載體與報告質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染真核細胞，他們發(fā)現(xiàn)L1、L2在真核細胞內(nèi)能高效的表達且自我進行組裝，形成具有免疫原性的假病毒顆粒。利用Buck等人的構(gòu)建方法，不僅方便而且產(chǎn)生的假病毒滴度較高可達107TU。利用該方法包裝的假病毒已成功應(yīng)用于生產(chǎn)HPV疫苗和藥物篩選。本發(fā)明利用該法構(gòu)建了低危型HPV6和高危型的HPV16、HPV18三種HPV假病毒模型。具體構(gòu)建方式如下：利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)將優(yōu)化好的HPV基因L1L2擴增，克隆到真核細胞表達載體，然后進行酶切和測序鑒定，形成穩(wěn)定表達的pHPV6、pHPV16、pHPV18的表達載體。將測序鑒定正確的三個表達載體質(zhì)粒和報告質(zhì)粒pSEAP(內(nèi)含堿性磷酸酶報告基因)大量擴增，備用。培養(yǎng)293FT細胞，分別傳代至4個100mm培養(yǎng)板，37℃5％CO2培養(yǎng)待細胞生長至融合度至80％時，利用lipoFilter轉(zhuǎn)染試劑分別將質(zhì)粒pHPV6、pHPV16、pHPV18與pSEAP報告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293FT細胞，同時設(shè)對照組僅轉(zhuǎn)染pSEAP報告質(zhì)粒。將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的細胞放置37℃5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h后去除培養(yǎng)基用DPBS洗2次，用0.25％的胰酶消化細胞3分鐘，加入10mL培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入15mL離心管，1000g離心5分鐘去除上清，加入與沉淀等體積的細胞裂解液(0.3％Brij58，0.2％Benzonase，0.2％plasmidsafeATPdependentDNase的DPBS)37℃24小時，然后置于冰上5分鐘，加入0.17體積的5MNaCl，渦旋混勻，置于冰上20分鐘，5000g4℃離心10分鐘，將上清分裝備用置于-80℃。2)病毒滴度測定將293FT細胞傳代至96孔板，每孔細胞數(shù)為1×105個37℃5％CO2培養(yǎng)8h；將HPV假病毒進行梯度稀釋，把96孔中的培養(yǎng)基去除，加入50uL假病毒稀釋液，再加入50uL正常培養(yǎng)基，37℃5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)72h，取50uL培養(yǎng)液上清，利用Clontech堿性磷酸酶檢測試劑盒檢測，以此計算TCID50，當實驗組與對照組之比達到106即可收取假病毒。3)香菇菌多糖硫酸酯對HPV6、HPV16和HPV18的抑制活性檢測將293FT細胞傳代至96孔板，每孔細胞數(shù)為1×105個37℃5％CO2培養(yǎng)8h；將香菇菌多糖硫酸酯(實施例3中制備)和香菇菌多糖進行梯度稀釋，把96孔板中的培養(yǎng)基去除，分別加入50uL香菇菌多糖硫酸酯稀釋液和香菇菌多糖稀釋液，37℃5％CO2培養(yǎng)30分鐘，然后將50uL100TCID50假病毒加入到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)12小時候換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)72小時后，取50uL培養(yǎng)液上清，利用Clontech堿性磷酸酶檢測試劑盒檢測，利用SigmaPlot計算香菇菌多糖硫酸酯和香菇菌多糖的IC50(一定濃度的某種藥物誘導(dǎo)細胞凋亡50％時的劑量)，結(jié)果見表4，香菇菌多糖硫酸酯對三種HPV病毒均具有良好的去除率，而香菇菌多糖對三種HPV病毒的去除率均很差。表4實施例12香菇菌多糖硫酸酯含有不同硫酸根含量對清除HPV的影響。僅硫酸根修飾率不同，其余實驗方法與實施例11中相同，實驗結(jié)果如表5所示，硫酸根修飾率不同的香菇菌多糖硫酸酯清除HPV的能力不同，而這種能力隨著硫酸根修飾率的增加而增強，但硫酸根修飾率達到一定程度后，再增加則對清除HPV的能力基本沒影響。表5實施例13不同種類的多糖硫酸酯對清除HPV的影響。以實施例3所用的方法(參數(shù)相同)，分別制備香菇菌多糖硫酸酯、茯苓菌多糖硫酸酯和靈芝菌多糖硫酸酯，然后分別檢測硫酸根修飾率和多糖回收率，結(jié)果如表6所示。表6香菇菌多糖硫酸酯茯苓菌多糖硫酸酯靈芝菌多糖硫酸酯硫酸根修飾率(％)17.321.519.3多糖回收率(％)63.466.564.5然后以實施例11相同的方法檢測不同多糖硫酸酯對清除HPV的影響，結(jié)果如表7所示，在類似的硫酸根修飾率條件下，香菇菌多糖硫酸酯清除HPV的能力強于靈芝多糖硫酸酯以及茯苓多糖硫酸酯。表7實施例14以制備100kg敷料為例，a)稱取10g香菇菌多糖硫酸酯溶于10kg水中，用0.22um濾膜真空過濾，備用；b)稱取2kg卡波姆溶于10kg水中，高速攪拌混勻，過夜溶脹，然后高壓滅菌121℃30分鐘，備用；c)稱取3kg甘油、1kg泊洛沙姆、100g三氯生溶于10kg水中，滴加2MNaOH攪拌至三氯生完全溶解，然后高壓滅菌121℃30分鐘，備用；d)將a)b)c)所得溶液以及EDTA二鈉10g混合在一起，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至4.5，同時用無菌水補足至100kg。實施例15以制備100kg敷料為例，a)稱取50g香菇菌多糖硫酸酯溶于10kg水中，用0.22um濾膜真空過濾，備用；b)稱取0.5kg卡波姆溶于10kg水中，高速攪拌混勻，過夜溶脹，然后高壓滅菌121℃30分鐘，備用；c)稱取3kg甘油、5kg泊洛沙姆、150g三氯生溶于10kg水中，滴加2MNaOH攪拌至三氯生完全溶解，然后高壓滅菌121℃30分鐘，備用；d)將a)b)c)所得溶液以及EDTA二鈉50g混合在一起，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至6.0，同時用無菌水補足至100kg。實施例16以制備100kg敷料為例，a)稱取100g香菇菌多糖硫酸酯溶于10kg水中，用0.22um濾膜真空過濾，備用；b)稱取3kg卡波姆溶于10kg水中，高速攪拌混勻，過夜溶脹，然后高壓滅菌121℃30分鐘，備用；c)稱取1kg甘油、10kg泊洛沙姆、300g三氯生溶于10kg水中，滴加2MNaOH攪拌至三氯生完全溶解，然后高壓滅菌121℃30分鐘，備用；d)將a)b)c)所得溶液以及EDTA二鈉100g混合在一起，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至6.5，同時用無菌水補足至100kg。實施例17敷料穩(wěn)定性實驗。將上述實施例(實施例14～16)配制的敷料，制備完成后立即評估，從形態(tài)顏色、有無顆粒物以及pH等方面進行評估。將上述三種各取三份分別置于4℃、25℃、37℃存放一個月，每周觀察。最終結(jié)果顯示，制備的敷料在各個溫度條件及時間下，無論從形態(tài)還是pH方面均保存完好。時間點：0周時間點：1周時間點：2周時間點：3周時間點：4周實施例18動物安全實驗。通過動物特定部位給藥，觀察藥物對該部位的影響，例如是否發(fā)生刺激反應(yīng)，是否引起皮膚紅腫等癥狀。選取皮膚和陰道部分，進行完整皮膚和破損皮膚給敷料，以及陰道給敷料，在一定時間內(nèi)觀察給敷料情況，結(jié)果如下：實施例14～16制得的敷料經(jīng)GLP單位實驗室驗證安全性良好，動物安全實驗如下：1、復(fù)給小鼠完好皮膚及破損皮膚給敷料，涂藥部位為背部脊柱兩側(cè)區(qū)脫毛(8％硫化鈉將毛脫去，脫毛面積為30cm2)；破損皮膚用細砂紙在脫毛部位造成擦傷，以皮膚輕度密集滲血點為度，即刻涂藥，按5.0g/kg，每天2次，連續(xù)四周，未見皮膚刺激反應(yīng)。2、重復(fù)給新西蘭兔完好皮膚及破損皮膚給敷料，涂藥部位為背部脊柱兩側(cè)區(qū)脫毛(8％硫化鈉將毛脫去，脫毛面積為30cm2)；破損皮膚用細砂紙在脫毛部位造成擦傷，以皮膚輕度密集滲血點為度，即刻涂藥，按5.0g/kg，每天2次，連續(xù)四周，未見皮膚刺激反應(yīng)。3、同時重復(fù)給小鼠及新西蘭兔陰道給敷料，按5.0g/kg，每天2次，連續(xù)四周，未見陰道刺激反應(yīng)。當前第1頁1 2 3