技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽以及其在制備檢測或治療類風(fēng)關(guān)(RA)滑膜細胞(FLS)增生、銀屑病表皮細胞增生及炎癥疾病的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

Cyr61(cysteine-rich 61)，又稱為CCN1，是一種由381個氨基酸殘基的相對分子質(zhì)量為42kDa的分泌蛋白，最早被克隆的Cyr61/CCN1是1985年Lau等在用血清或血小板衍生生長因子(PDGF)刺激小鼠BALB/c 3T3成纖維細胞時發(fā)現(xiàn)的，因富含半胱氨酸(含10％的半胱氨酸殘基)被命名為Cyr61/CCN1。Cyr61/CCN1具有明顯的促有絲分裂活性和趨化性，可誘導(dǎo)成纖維細胞與表皮細胞增殖和分泌細胞外基質(zhì)，參與調(diào)節(jié)細胞增生、分化、胚胎發(fā)育形成,是生命活動的基本蛋白。

在抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)中，抗體參與結(jié)合的部位稱抗體的對位(paratope)，而抗原(Cyr61/CCN1蛋白)參與結(jié)合的部位稱為抗原的表位(epitope)。表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)?？乖砦?小分子肽段)的確定對于明確蛋白的作用位點即小分子肽段、進而設(shè)計采用該小分子肽段而模擬蛋白作用、或者設(shè)計能夠模擬該肽段的小分子化合物用于代替蛋白或肽分子的作用、或者設(shè)計小分子化合物以阻斷該蛋白作用具有重要意義，這也是當(dāng)今國際上流行的新型藥物的發(fā)展和制備方法之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，為GLECNFG。

本發(fā)明還提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽，其為如SEQ ID NO.2所示的環(huán)狀肽段，即在SEQ ID NO.1的肽段的N端添加一個半胱氨基酸，從而構(gòu)成如SEQ ID NO.2所示的環(huán)狀肽段“C-G LECNF G”。

本發(fā)明的Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽是位于Cyr61/CCN1蛋白的第75-81位氨基酸，能夠和特異性抗Cyr61/CCN1單抗093G9結(jié)合(KD為10-7)并在體內(nèi)外中和Cyr61/CCN1功能，當(dāng)N端添加一個C時可經(jīng)人工合成為環(huán)狀肽段“C-G LECNF G”。

本發(fā)明中，Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽可通過蛋白酶水解制備得到，Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽還可以通過常規(guī)的固相多肽合成方法合成或基因工程技術(shù)制備得到。

本發(fā)明中，根據(jù)基因庫檢索所得的人Cyr61/CCN1蛋白全長序列(GenBank：M_001554)，如SEQ ID NO.3所示，為：

其中，黑框中序列為Cyr61/CCN1蛋白的信號肽。

本發(fā)明還提供了特異性抗Cyr61/CCN1單抗，所述特異性抗Cyr61/CCN1單抗能與本發(fā)明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽結(jié)合。

本發(fā)明還提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的抑制劑，其能與本發(fā)明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽結(jié)合、能與GLECNFG環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合、并能夠阻斷由此介導(dǎo)的生物學(xué)功能。

本發(fā)明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的抑制劑，包括能夠阻斷Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽生物學(xué)功能的小分子化合物。較佳地，如本發(fā)明實施例所示的小分子化合物SC1-SC15。具體地，可以根據(jù)Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的肽段構(gòu)象表位能夠設(shè)計具有模擬和抑制該肽段生物學(xué)功能的小分子化合物。能夠阻斷該多肽肽段的小分子化合物具有抑制Cyr61/CCN1分子病理生物學(xué)的作用，這對于進一步發(fā)展成為先導(dǎo)化合物及其在制備抗滑膜增生和骨破壞、抗Cyr61/CCN1高表達乳腺癌細胞增殖、抗表皮細胞過度增生以及抗纖維化(如肝纖維化)的藥物均有重要用途。本發(fā)明抑制劑能夠和GLECNFG環(huán)狀結(jié)構(gòu)相結(jié)合、并能夠阻斷由此介導(dǎo)的病理作用(包括致炎，致纖維母細胞增生、致Cyr61/CCN1高表達乳腺癌細胞增生與轉(zhuǎn)移、致表皮細胞增生與活化等)。

本發(fā)明之前的研究已經(jīng)表明，IL-17能夠上調(diào)Cyr61/CCN1的表達，而上調(diào)表達Cyr61/CCN1能夠通過與滑膜細胞表明整合素受體AvB5結(jié)合后而促進滑膜細胞的過度增生，并可促進金屬蛋白酶3和金屬蛋白酶9的合成而參與軟骨和骨破壞。本發(fā)明研究表明，Cyr61/CCN1蛋白能直接促進滑膜細胞產(chǎn)生IL-6，從而參與炎癥發(fā)生發(fā)展。進一步地，本發(fā)明研究表明Cyr61/CCN1還能夠促進人類表皮細胞增生，參與銀屑病發(fā)生。本發(fā)明動物實驗中還發(fā)現(xiàn)Cyr61/CCN1能夠介導(dǎo)干燥綜合征、增生型炎性腸病發(fā)生。本發(fā)明實驗已經(jīng)證實用抗Cyr61/CCN1單抗中和該蛋白表達可以抑制滑膜細胞增生和IL-6產(chǎn)生、減輕CIA模型中關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀和組織破壞與炎癥；抑制表皮細胞增生，減輕銀屑病樣小鼠的皮膚增厚與鱗屑產(chǎn)生、緩解干燥綜合征和增生型腸病動物模型的炎癥和臨床癥狀。

本發(fā)明制備得到能夠結(jié)合Cyr61/CCN1蛋白的單克隆抗體。這些抗體表現(xiàn)出功能的不同，其原因在于這些不同的單克隆抗體所結(jié)合的抗原表位，也就是Cyr61/CCN1蛋白的不同部位所造成的。

本發(fā)明還提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在制備檢測和/或治療炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述炎癥性疾病包括風(fēng)濕性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病。優(yōu)選地，所述炎癥性疾病包括干燥綜合征。優(yōu)選地，所述炎癥性疾病包括增生型炎性腸病。

本發(fā)明還提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在制備抗類風(fēng)關(guān)滑膜細胞增生的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的實施例表明，能夠特異性中和這一抗原表位的單克隆抗體093G9在體內(nèi)和體外可以抑制類風(fēng)關(guān)及其動物模型的滑膜細胞增生抑制銀屑病及其動物模型的表皮細胞增生、抑制干燥綜合征動物模型的癥狀和炎癥、抑制增生型炎性腸病動物模型的炎癥和癥狀。

本發(fā)明還提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在制備抑制乳腺癌細胞高表達的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明實施例表明，能夠特異性中和Cyr61/CCN1蛋白抗原表位的單克隆抗體093G9在體內(nèi)和體外可以抑制高表達Cyr61/CCN1蛋白的乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，在動物模型(體內(nèi))中可以抑制該類型的腫瘤生長和淋巴轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明還提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在制備抗纖維化藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在制備抗銀屑病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明實施例表明，能夠特異性中和這一抗原表位的單克隆抗體093G9在體內(nèi)和體外可以抑制表皮細胞增殖、銀屑病樣小鼠的皮膚增厚與鱗屑產(chǎn)生。

本發(fā)明還提供了Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的抑制劑在制備治療風(fēng)濕性疾病藥物中的應(yīng)用。

對于本發(fā)明位于Cyr61/CCN1蛋白上的抗原表位進行功能分析表明，抗體093G9的識別肽段的環(huán)肽具有刺激類風(fēng)關(guān)滑膜細胞體外增殖的作用，而對照抗體096B7的識別表位不具有這樣的特性，如圖1所示。

將所獲得的抗體識別表位用人工合成肽段，將這些肽段加入細胞培養(yǎng)中觀察其生物學(xué)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)某些肽段能夠抑制滑膜細胞和Cyr61/CCN1高表達乳腺癌細胞株在體外增生，表明其具有模擬抗Cyr61/CCN1單抗的作用。因此，這些肽段及其能夠與之結(jié)合的化合物小分子，均具有抑制Cyr61/CCN1蛋白的作用，具有制藥的潛能。

本發(fā)明有益效果還包括Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽在研究開發(fā)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病、干燥綜合征、增生型炎性腸病的新藥物中的應(yīng)用。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率在中國高達0.4-1％；銀屑病在中國人中的發(fā)病率高達0.3-0.5％，在白種人中的發(fā)病率更高(如美國發(fā)病率為1-3％；挪威發(fā)病率高達7％)，可見，本發(fā)明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽及根據(jù)本表位發(fā)展的新藥物將有廣闊應(yīng)用前景。

本發(fā)明肽段G LECNF G(114,環(huán)肽為111)表位的意義：根據(jù)“Trends Biochem Sci.2008October；33(10):461–473”報道序列：CCN家族分子序列的IGFBP區(qū)域的第75-81位氨基酸中均含有G L C這樣三個保守氨基酸。

CCN1-LSTCPAAC--HCPLEA-PKCAPGVGLVRDGCGCCKVCAKQLNEDCSKTQPCDHTKGLECNFGAS-STALKGICRAQSE

CCN2VGQNCSGPC--RCPDEPAPRCPAGVSLVLDGCGCCRVCAKQLGELCTERDPCDPHKGLFCHFGSP-ANRKIGVC-TAKD

CCN3ATQRCPPQCPGRCPATP-PTCAPGVRAVLDGCSCCLVCARQRGESCSDLEPCDESSGLYCDRSAD–PSNQTGIC–TAVD

CCN4RPQFCKWPC--ECPPSP–PRCPLGVSLITDGCECCKMCAQQLGDNCTEAAICDPHRGLYCDYSGDRPRYAIGVC–AQVV

上述中，涂色部分的7個氨基酸是這個家族分子(CCN1-6)的保守序列，但是，093G9只能和Cyr61/CCN1結(jié)合。雖然G LECNF G僅位于Cyr61/CCN1上，是093G9的特異性識別表位，但是其中保守的序列G-L-C在所有CCN家族中都有。根據(jù)093G9不與線肽G LECNF G結(jié)合、只與環(huán)肽*C G LECNF G結(jié)合的實驗結(jié)果，提示雖然環(huán)肽C-G-L-C形成構(gòu)象表位可能位于CCN家族分子中，但是G LECNF G是具有致病作用的特異性表位。

本發(fā)明的表位的生物學(xué)意義包括：

環(huán)肽111能夠刺激RA患者滑膜細胞和Cyr61/CCN1高表達乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外增殖，因此，該肽段是Cyr61/CCN1分子的特異性致病表位。

單抗093G9能夠特異性識別Cyr61/CCN1的肽段(IGFBP)中的表位，阻斷這一表位的抗體093G9具有阻斷Cyr61/CCN1致滑膜細胞、高表達乳腺癌MDA-MB-231細胞、其他纖維母細胞增殖的作用。

根據(jù)這一肽段構(gòu)象表位能夠設(shè)計具有模擬和抑制該肽段生物學(xué)功能的化學(xué)小分子(SC)。其中，能夠阻斷該肽段化學(xué)小分子(SC)具有抑制Cyr61/CCN1分子病理生物學(xué)的作用。這對于進一步發(fā)展成為先導(dǎo)化合物及其在制備抗滑膜增生和骨破壞、抗Cyr61/CCN1高表達乳腺癌細胞增殖、以及抗纖維化(如肝纖維化)的藥物中，有重要的用途。

由于Cyr61/CCN1蛋白內(nèi)富含半胱氨酸，容易形成二硫鍵，因此，采用基因工程方法表達十分困難，而該肽段容易進行人工合成，因此能夠代替Cyr61/CCN1分子免疫以獲得抗該功能表位的抗血清，或者制備相應(yīng)單抗，用于進一步的臨床檢測和治療中的應(yīng)用。

本發(fā)明旨在保護多肽111的序列、由該序列所可能產(chǎn)生的立體結(jié)構(gòu)(包括線形結(jié)構(gòu)和環(huán)狀結(jié)構(gòu))，以及與其相結(jié)合并產(chǎn)生相同作用(如促進滑膜細胞增殖、免疫后產(chǎn)生抗體能夠抑制膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠炎癥作用等)或者直接抑制這些肽段功能的小分子化合物。

附圖說明

圖1表示本發(fā)明多肽的模擬構(gòu)象示意圖及化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中，(A)表示線性構(gòu)象的多肽114；(B)表示環(huán)狀構(gòu)象的多肽111；(C)表示多肽111的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2表示本發(fā)明多肽刺激RA滑膜細胞體外增值的實驗結(jié)果。

圖3表示本發(fā)明多肽刺激MDA-MB-231細胞增殖作用的實驗結(jié)果。

圖4表示本發(fā)明小分子化合物對肽段刺激的滑膜細胞增殖的抑制效果，其中，(A)表示15個化學(xué)小分子(SC 1-15)分別對肽段111刺激的滑膜細胞增殖的明顯抑制；(B)表示15個化學(xué)小分子(SC 1-15)分別對Cyr61/CCN1蛋白刺激的滑膜細胞增殖的明顯抑制。

圖5表示本發(fā)明小分子化合物對肽段刺激的乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖的抑制效果，其中，(A)表示15個化學(xué)小分子(SC 1-15)對肽段111刺激的乳腺癌細胞株MDA-MB-231體外增殖的明顯抑制；(B)表示15個化學(xué)小分子(SC 1-15)分別對Cyr61/CCN1蛋白刺激的乳腺癌細胞株MDA-MB-231體外增殖的明顯抑制。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實施例1本發(fā)明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的篩選

本發(fā)明中，采用免疫印跡法篩選：采用了改進的傳統(tǒng)測定抗原表位方法，即通過基因工程分段表達Cyr61/CCN1一系列的小肽段，然后用這2株抗體進行蛋白印跡(Western Blot)雜交而篩選結(jié)合表位，從而得到能夠和2株Cyr61/CCN1單抗結(jié)合的肽段。

根據(jù)已有研究結(jié)果將Cyr61/CCN1蛋白分成約25個氨基酸片段長度的小肽段，然后設(shè)計引物將這些片段的基因克隆入大腸桿菌中，經(jīng)表達測序正確后誘導(dǎo)表達，PAGE電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，然后分別用鼠抗人Cyr61/CCN1特異性單克隆抗體093G9(CGMCC No.3351)和鼠抗人Cyr61/CCN1特異性單克隆抗體096B7(CGMCC No.3299)進行雜交和顯色，觀察結(jié)合情況。能夠結(jié)合則顯色陽性，否則陰性。由此判斷這兩種抗體的結(jié)合表位。通過上述方法，篩選出抗體093G9結(jié)合的抗原表位位于Cyr61/CCN1的75－81位氨基酸的表位：Cyr61/CCN1_75-81GLECNFG。這一表位在Cyr61/CCN1序列中的位置(粗體字體標出的部位)：

實施例2Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的合成

本實施例中，Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽合成是由上海強耀公司合成?；驹砣詣庸滔嗪铣煞?。其基本過程如下：基于Fmoc化學(xué)合成，先將所要合成的目標多肽的C-端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點，同其它的氨基酸已經(jīng)活化的羧基作用形成肽鍵，不斷重復(fù)這一過程，即可得到多肽。所合成的多肽純化采用HPLC純化，純度達95％以上。根據(jù)篩選得到的結(jié)合表位，分別合成了線性和環(huán)狀多肽，其中，所合成的多肽分別為：線性多肽(編號114)，其序列為GLECNFG；環(huán)狀多肽(編號111)，其序列為C GLECNFG。

實施例3Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的構(gòu)象與化學(xué)結(jié)構(gòu)

采用Cassion分子模擬計算機軟件，將本發(fā)明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位肽段在純水溶液中進行擬合，以得到可能在體內(nèi)的溶液環(huán)境中最為可能形成的構(gòu)象，獲得具有立體觀察效果的分子結(jié)構(gòu)。如圖1(a)和(b)所示的Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的立體構(gòu)象，其中，圖1(a)表示多肽114，為線性構(gòu)象；圖1(b)表示多肽111，為環(huán)狀構(gòu)象；圖1(c)表示多肽111的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

實施例4Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽刺激滑膜細胞體外增殖

類風(fēng)關(guān)滑膜細胞培養(yǎng)與增殖實驗

臨床樣本：研究中所有樣本均來自于臨床骨科行膝關(guān)節(jié)置換或滑膜切除術(shù)的RA患者，所有病例的診斷符合國際診斷標準?；颊呋そM織用于細胞的體外培養(yǎng)。本研究中所用臨床樣本，均對患者進行知情告知。

滑膜細胞的制備及原代培養(yǎng)：將無菌獲取滑膜組織，PBS清洗后用無菌手術(shù)剪刀剪切成約1mm×1mm×1mm的碎塊；用2－3倍體積0.5mg/ml的膠原酶I或膠原酶II，37℃，消化2小時；經(jīng)200目紗網(wǎng)過濾后，離心去上清后，將細胞重懸于DMEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)皿中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)。之后待FLS生長成片>80％時，消化傳代。顯微鏡下觀察，3-5代的RA FLS生長迅速，細胞形態(tài)趨向于長梭形，排列整齊，取向一致。用特異性淋巴細胞分化抗原如CD3，CD14，CD19，CD11C等標記后用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)上述分子表達為陰性(<2％CD1Ib,<2％CD14+,<1％CD3+,and<5％CD19+)，表明所培養(yǎng)的細胞為均一的FLS，極少有淋巴細胞污染。

滑膜細胞的增殖實驗：取對數(shù)生長期的FLS，經(jīng)0.25％的胰蛋白酶消化后調(diào)整細胞濃度1×10⁴細胞/毫升，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，加入不同濃度的上述肽段(肽段終濃度為：2.5ug/ml,5.0ug/ml 10ug/ml)。同時采用Cyr61/CCN1完整蛋白作為陽性對照(Proptech公司，美國，San Diego)。也設(shè)培養(yǎng)液對照。將肽段或者純Cyr61/CCN1蛋白與FLS共同培養(yǎng)，在培養(yǎng)結(jié)束前16個小時加入1μCi的3H(每孔)，收集細胞，β液閃儀檢測增殖。

II型膠原誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎(CIA)模型實驗：

肽段免疫預(yù)防CIA小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎實驗：將肽段與CFA完全混勻，DBA1小鼠背部皮下免疫3次：第一次：肽+CFA，第二次和第三次：肽+IFA(不完全佐劑)，免疫劑量：100ug肽/mouse,背部免疫2－3點，每次間隔1個月，第三次免疫后7天，尾部采血，用ELISA檢測是否產(chǎn)生抗血清；同時用CII100ug加等量IFA免疫小鼠，觀察小鼠的發(fā)病情況、發(fā)病速度和炎癥強度。

肽段治療或者沖擊CIA小鼠：即先制備CIA小鼠模型，待炎癥達到4分時用肽段進行粘膜給藥。方法：肽段2500ug/ml,10ul/mouse,終濃度為25ug/mouse/day。采用溶劑為陰性對照。

將本發(fā)明Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽的上述肽段分別加入類風(fēng)關(guān)原代培養(yǎng)的滑膜細胞中，于48小時后檢測其對于滑膜細胞增殖的刺激能力，實驗結(jié)果表明，肽段111能夠明顯刺激滑膜細胞增生，并呈劑量依賴性，如圖2所示。這一實驗結(jié)果表明，位于Cyr61/CCN1的75－81位置的肽段111，在水溶液中可能形成的環(huán)狀構(gòu)象能夠模擬Cyr61/CCN1蛋白刺激滑膜細胞增殖的作用。

實施例5Cyr61/CCN1蛋白抗原表位多肽刺激Cyr61/CCN1高表達乳腺癌細胞株(MDA-MB-231)體外增殖

將1×10⁴個MDA-MB-231細胞接種至96孔板中，然后加入不同濃度(2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml)的肽段，4小時后加入3H-TdR，繼續(xù)孵育16小時，收集細胞，Beta閃爍儀檢測c.p.m.值，用于判斷細胞增殖狀態(tài)。結(jié)果如圖3所示，肽段111有明顯的刺激細胞增殖作用。

實施例6篩選得到與環(huán)肽111結(jié)合并抑制其活性的小分子化合物(SC 1-15)

根據(jù)肽段構(gòu)象表位(環(huán)狀多肽C GLECNFG，編號111)設(shè)計具有模擬和抑制該肽段生物學(xué)功能的化學(xué)小分子(SC)，其中，能夠阻斷該肽段化學(xué)小分子(SC)具有抑制Cyr61/CCN1分子病理生物學(xué)的作用。這對于進一步發(fā)展成為先導(dǎo)化合物及其在制備抗滑膜增生和骨破壞、抗Cyr61/CCN1高表達乳腺癌細胞增殖、以及抗纖維化(如肝纖維化)的藥物中，有重要的用途。本發(fā)明采用開發(fā)新藥中常用的虛擬篩選方法，通過計算法篩選出可能有治療效用的化學(xué)分子。目前應(yīng)用較為廣泛的是對藥物的標靶利用X-ray繞射或核磁共振(NMR)的實驗，或運用生物信息結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法，得到標靶的三維高分辨率結(jié)構(gòu)后，再進行虛擬篩選。

本實施例中，藥物虛擬篩選成功的要件包括：(1)足夠大的化學(xué)空間(chemical space)，(2)準確的評分函數(shù)(scoring function)，(3)高效率的搜尋演算法(searching algorithm)?；瘜W(xué)空間，即所用的化學(xué)數(shù)據(jù)庫；廣義來講，化學(xué)空間則包括配體(ligand)和受體較可能存在的構(gòu)形(conformation)；評分函數(shù)，其設(shè)計主要是從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Databank，http://www.pdb.org)中尋找分辨率較好的配體與受體的結(jié)合體(complex)，運用能量的計算，加上諸如多變量線性回歸(multivariate linear regression)的統(tǒng)計方法，建立一個準確的數(shù)學(xué)函數(shù)，并可快速有效地推測未知的配體對一給定的受體是否可穩(wěn)定地結(jié)合，甚至預(yù)測結(jié)合強度(binding affinity)或結(jié)合的自由能(binding free energy)。上述評分函數(shù)是根據(jù)配體分子相對于受體做平移(translation)、旋轉(zhuǎn)(rotation)、或者是構(gòu)形變化(conformational changes)時十分復(fù)雜的能量變化情形，尋找具有最佳評分值的結(jié)合模式。

本實施例在對靶標環(huán)狀多肽C GLECNFG(編號111)能有效模擬Cyr61/CCN1蛋白的生物學(xué)作用的研究基礎(chǔ)上，篩選得到具有結(jié)構(gòu)實體的靶向環(huán)肽111的先導(dǎo)化合物，這些小分子結(jié)構(gòu)的化合物能與環(huán)肽111結(jié)合并抑制其活性。根據(jù)環(huán)狀多肽111的化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用本方法篩選到能夠和這一環(huán)狀多肽結(jié)合的小分子化合物SC有15個，其結(jié)構(gòu)和名稱如下表1中所示的SC-1至SC-15化合物。這些小分子化合物SC的結(jié)構(gòu)及合成方法均為現(xiàn)有技術(shù)。

實施例7能與肽段111結(jié)合的化學(xué)小分子(SC)1-15在體外抑制由環(huán)肽111刺激滑膜細胞增殖的作用

本實施例中臨床樣本、滑膜細胞制備及原代培養(yǎng)均與實施例4中所述相同。

滑膜細胞的增殖實驗：取對數(shù)生長期的FLS，經(jīng)0.25％的胰蛋白酶消化后調(diào)整細胞濃度1×10⁴細胞/毫升，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，分別加入10ug/ml的肽段111和2.5ug/ml的Cyr61/CCN1蛋白(Proptech公司，美國，San Diego)。然后分別加入按實施例6方法篩選得到的10μM化學(xué)小分子SC-1～SC-15，詳見下表1，共同培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)結(jié)束前16個小時加入1μCi的3H(每孔)，收集細胞，β液閃儀檢測增殖，實驗結(jié)果如圖4所示，15個化學(xué)小分子(SC-1～SC-15)分別對肽段111(如圖4A所示)和Cyr61/CCN1蛋白(如圖4B所示)刺激的滑膜細胞增殖有明顯抑制作用。

實施例8能與肽段111結(jié)合的化學(xué)小分子1-15在體外抑制由環(huán)肽111和Cyr61/CCN1刺激乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖的作用

將1×10⁴個MDA-MB-231細胞接種至96孔板中，加入10ug/ml的肽段111和2.5ug/ml的Cyr61/CCN1蛋白(Proptech公司，美國，San Diego)。然后分別加入按實施例6方法篩選得到的10μM化學(xué)小分子SC-1～SC-15，詳見下表1，共同培養(yǎng)4小時后加入1μCi的3H(每孔)，繼續(xù)孵育16小時，收集細胞，Beta閃爍儀檢測c.p.m.值，用于判斷細胞增殖狀態(tài)。實驗結(jié)果如圖5所示，所述15個化學(xué)小分子(SC 1-15)對肽段111(如圖5A所示)和Cyr61/CCN1蛋白(如圖5B所示)刺激的乳腺癌細胞株MDA-MB-231體外增殖有明顯抑制作用。