本發(fā)明涉及中藥制造及應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物配伍。

背景技術(shù)：

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是關(guān)節(jié)炎里最常見的疾病，根據(jù)人口統(tǒng)計學(xué)資料預(yù)測，到2020年，受關(guān)節(jié)疾病影響的人口比例將占到全世界人口的50％,將有5.7億人受到KOA的困擾。KOA是世界上導(dǎo)致殘疾的第八大疾病。盡管如此，但KOA發(fā)病機(jī)制還不清楚。并且到目前為止，還沒有一種治療方法可以從根本上預(yù)防、改變或中止KOA的疾病進(jìn)程。最后多數(shù)KOA晚期患者不得不通過接受膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，來“治愈”KOA。而很多KOA患者由于自身身體條件及家庭經(jīng)濟(jì)承受能力所限，無法接受膝關(guān)節(jié)置換術(shù)。因此，研究KOA的發(fā)病機(jī)制，并尋找防治KOA的有效治療藥物及手段是保證國民健康，提高KOA患者生活質(zhì)量和減輕國家醫(yī)療負(fù)擔(dān)的迫切需求。

申請?zhí)枮?01310100692.2的專利公開了一種治療骨關(guān)節(jié)炎的內(nèi)服中藥方劑，其中，桂枝6-9克，白芍10-15克，進(jìn)一步的，桂枝7克，白芍13克；申請?zhí)枮?01410491235.5的專利公開了一種用于治療骨關(guān)節(jié)炎的中藥片劑及其制備方法，其中桂枝5-7份，白芍3-9份，但這些專利都未對桂枝白芍以一定的比例共同應(yīng)用于治療KOA的效果進(jìn)行詳細(xì)的說明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人經(jīng)過多年實(shí)驗(yàn)研究，根據(jù)大量臨床實(shí)踐，調(diào)整桂枝白芍配伍比例，證明桂枝白芍以一定比例配伍，治愈率高，復(fù)發(fā)率低。

本發(fā)明的目的是提供一種療效好、治愈率高的治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物配伍。

本發(fā)明的桂枝白芍的配伍比例，是經(jīng)過發(fā)明人在多年基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)得出，它是由下列重量份的原料藥組成：桂枝25～50份，白芍25～50份。

原料藥的重量份的最佳配比：桂枝:白芍＝5:3。

上述原料藥物中：其中白芍、桂枝為通絡(luò)止痛湯的君藥，桂枝辛甘溫，有溫通經(jīng)脈，助陽化氣之功效；白芍苦、酸、微寒，有養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛之功效。兩者合用一斂一散,一補(bǔ)一開，解肌發(fā)表,調(diào)和營衛(wèi),使發(fā)汗而不傷陰，氣血調(diào)而不傷氣。兩藥合用亦可治療氣血不調(diào)導(dǎo)致的四肢酸楚、麻木、疼痛等?！督鹳F要略·血痹虛勞病脈證并治第六》中治療痹癥用黃芪桂枝五物湯方，其中以桂枝白芍配伍為主。桂枝與白芍的配伍，以及其在成方、中成藥中配伍組合、選擇性取代的類似物或者一種或多種前述配伍的組合；還包括二者的有效成分提取物、衍生物，如包括桂皮醛，白芍總苷，桂皮醛與白芍總苷的混合物及白芍與桂枝中其他成分提取物。

本發(fā)明藥物配伍可以采用中藥制劑的常規(guī)方法制備成任何常規(guī)內(nèi)服制劑，例如可以將桂枝白芍原料研成粉末混合均勻然后制成散劑，或丸劑或膠囊，還可以為針或凍干粉針制劑、丸劑、湯劑、片劑、顆粒劑、硬膠囊、軟膠囊、控釋、緩釋制劑、注射劑或口服制劑。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。

圖1是不同比例桂枝白芍作用于膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞NO的濃度變化

圖2是不同比例桂枝白芍作用于膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞TNF的濃度變化

圖3是不同比例桂枝白芍作用于膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞IL-1的濃度變化

圖4是桂枝與白芍比例為1：1作用TLR2、TLR4標(biāo)記的膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞TLR2、TLR4的表達(dá)

圖5是桂枝與白芍比例為1：2作用TLR2、TLR4標(biāo)記的膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞TLR2、TLR4的表達(dá)

圖6是桂枝與白芍比例為5:3作用TLR2、TLR4標(biāo)記的膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞TLR2、TLR4的表達(dá)

圖7是白芍作用TLR2、TLR4標(biāo)記的膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞TLR2、TLR4的表達(dá)

圖8是桂枝作用TLR2、TLR4標(biāo)記的膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞TLR2、TLR4的表達(dá)

圖9是對照組

具體實(shí)施方式

本實(shí)施例用于對本發(fā)明權(quán)利要求的解釋，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列描述。

本發(fā)明的目的是提供一種療效好、治愈率高的治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物配伍。

一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物配伍，包括下列重量份的原料藥：桂枝25～50份，白芍25～50份；其中，原料藥的重量份的最佳配比：桂枝:白芍＝5:3，桂枝與白芍配伍以及其在成方、中成藥中配伍組合、選擇性取代的類似物或者一種或多種前述配伍的組合；還包括二者的有效成分提取物、衍生物，在制備骨關(guān)節(jié)炎預(yù)防、治療、輔助治療和/或預(yù)后防復(fù)發(fā)的藥物中都可進(jìn)行應(yīng)用。

實(shí)施例1：

如圖1-3所示，應(yīng)用ELISA法檢測應(yīng)用不同比例桂枝白芍作用于膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞，NO、TNF、1L-1等炎癥因子的影響。

1.材料和方法

1.1組織來源

人KOA炎性滑膜組織源于行關(guān)節(jié)置換治療的KOA患者廢棄滑膜組織。無菌條件下將取得的滑膜組織去除脂肪、纖維等,加入PBS洗滌，PBS清洗兩次后放在無菌小青霉素瓶中用解剖剪切碎成糊狀。置于2mL 0.4％I型膠原酶的25cm2培養(yǎng)瓶中消化2.5h(期間搖勻數(shù)次)。經(jīng)200目金屬篩過濾。取未黏附的細(xì)胞移至離心管中，用2000轉(zhuǎn)離心5min，,棄上清，加入含有10％胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基,反復(fù)吹打后將細(xì)胞接種在25cm2的培養(yǎng)瓶中,置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.2主要試劑及設(shè)備

NO、TNF、1L-1人酶聯(lián)免疫試劑盒，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；胎牛血清購自四季青公司；RPMI－1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶－EDTA消化液(0.25％)、I型膠原酶均購自Gibco公司；ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀，美國生物技術(shù)儀器公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific；25cm²培養(yǎng)瓶，丹麥NUCU公司；四環(huán)凍干機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3藥物制備及劑量

桂枝、白芍、桂芍比1:1、桂芍比1:2、桂芍比5:3。將上述中藥飲片按成方比例置煎煮容器內(nèi),加水浸泡,煮沸30分鐘,棄藥渣取湯劑，經(jīng)過離心機(jī)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心，棄藥渣取湯劑，利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，粉末狀，PBS溶解至等體積，對照組為等體積PBS，用0.22μm微孔濾器過濾除菌。-20度儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4觀察項(xiàng)目及檢測方法

將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，棄上清液，鋪板，加入桂枝、白芍、桂芍比1:1、桂芍比1:2、桂芍比5:3、對照組(PBS)各組藥物。繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，吸取上清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定NO、TNF、1L-1的水平，嚴(yán)格按照試劑使用說明書操作。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,采用One-way ANOVA分析，多變量之間的關(guān)系采用多元直線回歸，兩變量之間的關(guān)系采用相關(guān)分析以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.6結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桂枝白芍配伍比桂枝配伍和芍藥配伍對于膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的作用明顯。

而各組濃度較對照組降低、桂芍比5:3的配伍炎癥因子濃度最低(圖1-3)，由此可以得出結(jié)論，桂芍比為5:3時作用最佳。

實(shí)施例2：

如圖4-9所示，應(yīng)用流失細(xì)胞術(shù)檢測應(yīng)用不同比例桂枝白芍作用于用TLR2、TLR4標(biāo)記的膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞TLR2、TLR4的表達(dá)情況。

1.材料和方法

1.1組織來源

人KOA炎性滑膜組織源于關(guān)節(jié)置換治療的KOA患者廢棄滑膜組織。無菌條件下將取得的滑膜組織去除脂肪、纖維等,加入PBS洗滌，PBS清洗兩次后放在無菌小青霉素瓶中用解剖剪切碎成糊狀。置于2mL 0.4％I型膠原酶的25cm2培養(yǎng)瓶中消化2.5h(期間搖勻數(shù)次)。經(jīng)200目金屬篩過濾。取未黏附的細(xì)胞移至離心管中，用2000轉(zhuǎn)離心5min，棄上清，加入含有10％胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基,反復(fù)吹打后將細(xì)胞接種在25cm2的培養(yǎng)瓶中,置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中。1～2d換液1次，選取3～4代細(xì)胞，純度大于98％，經(jīng)鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與儀器

胎牛血清，購自四季青公司；RPMI－1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶－EDTA消化液(0.25％)、I型膠原酶，均購自Gibco公司；1L-1β、MMP-13人酶聯(lián)免疫試劑盒，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；PE-anti-human-TLR4、FITC-anti-human-TLR2，美國eBioscience公司；流式細(xì)胞儀，美國BD公司FACS Calibur；4℃低溫高速離心機(jī)，美國Thermo；ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀，美國生物技術(shù)儀器公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific；四環(huán)凍干機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3藥物制備及劑量

桂枝、白芍、桂芍比1:1、桂芍比1:2、桂芍比5:3。將上述中藥飲片按成方比例置煎煮容器內(nèi),加水浸泡,煮沸30分鐘,棄藥渣取湯劑，經(jīng)過離心機(jī)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心，棄藥渣取湯劑，利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，粉末狀，PBS溶解至等體積，對照組為等體積PBS，用0.22μm微孔濾器過濾除菌。-20度儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞中TLR2、TLR4表達(dá)情況

采用細(xì)胞免疫熒光直接標(biāo)記法，樣品中依次加入PE-抗人TLR4單克隆抗體和FITC-抗人TLR2單克隆抗體兩種熒光標(biāo)記抗體，振蕩器充分混勻，2)室溫避光染色15min。3)1500rpm/min，離心6min，如此反復(fù)PBS洗3遍，將細(xì)胞碎片及未結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體去除。將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個/ml上機(jī)。流式細(xì)胞儀檢測采用SSC和FSC設(shè)門，測定10000個滑膜細(xì)胞中TLR4、TLR2陽性表達(dá)百分率，用FACSDiva Version 6.1.3軟件對數(shù)據(jù)獲取及分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,采用One-way ANOVA分析，多變量之間的關(guān)系采用多元直線回歸，兩變量之間的關(guān)系采用相關(guān)分析以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.6結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桂枝白芍配伍比桂枝配伍和芍藥配伍對于膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的作用明顯。

桂枝芍藥配伍隨著芍藥的比例減少表達(dá)明顯降低，其中桂芍比為5：3的配伍TLR2、TLR4的表達(dá)最低(圖4-9)，即桂芍比為5:3為最佳配比。

實(shí)施例3

通絡(luò)止痛方是治療膝骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)方，組成包括：桂枝10g、白芍6g、桃仁5g、紅花5g、制草烏1g、細(xì)辛0.3g、川椒2g、牛膝2g、乳香3g、沒藥3g；君藥為桂枝，白芍；主要功效包括活血化瘀，通絡(luò)止痛。

1研究方案

1.1一般資料

本研究病例來源于門診及住院部診治的患者，按照納入、排除標(biāo)準(zhǔn)納入受試者30例。其中女16例，男14例；年齡最小44歲，最大65歲，平均年齡59.3歲。所有病例均經(jīng)B超檢査證實(shí)存在關(guān)節(jié)積液，積液范圍最大10cm×5cm，最小2cm×3cm。所有病例均經(jīng)X線或CT檢查排除結(jié)核或胂瘤。

隨機(jī)分為超聲促透通絡(luò)止痛湯組(治療組)與超聲促透生理鹽水組(對照組)，治療組15例，無脫落病例，其中男6例，女9例，共19個膝關(guān)節(jié)，平均病程5.1年；對照組15例，脫落1例，其中男7例，女7例，共20個膝關(guān)節(jié)，平均病程5.2年。兩組病例性別、年齡、病程無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(具有可比性。

1.2病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1診斷標(biāo)準(zhǔn)

參考中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會制定的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南》(2007年版)。

(1)近1個月內(nèi)反復(fù)膝關(guān)節(jié)疼痛

(2)X線片站立或負(fù)重位示關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和或囊性變、關(guān)節(jié)緣

骨贅形成

(3)關(guān)節(jié)液(至少2次)清亮、黏稠，WBC＜2000個/ml

(4)中老年患者(≥40歲)

(5)晨僵≤30分鐘

(6)活動時有骨摩擦音(感)

注綜合臨床、實(shí)驗(yàn)室及線檢査，符合1+2條或1+3+5+6條或1+4+5+6條，可診斷KOA。

1.2.2納入標(biāo)準(zhǔn)：

(1)符合膝骨關(guān)節(jié)炎診斷；

(2)年齡在40～65歲之間；

(3)經(jīng)B超檢查證實(shí)存在關(guān)節(jié)積液；

(4)自愿簽署知情同意書。

1.2.3排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)合并有心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重危及生命的原發(fā)性疾病及精神病患者；

(2)孕婦及哺乳期的婦女；年齡＞65歲者；

(3)過敏體質(zhì)及對多種藥物過敏者。

1.3治療方案

隨機(jī)、對照、盲法方案

列出流水號01-30，借助SAS 8.2統(tǒng)計軟件提前完成隨機(jī)化安排，即治療組與對照組提前完成相鏈接的編碼。

本試驗(yàn)按1：1的比例隨機(jī)分為對照組和治療組。對照組、治療組連接超聲電導(dǎo)儀時外加常溫紗墊，超聲電導(dǎo)儀正常工作，使兩組治療在形式上相同。

操作者(護(hù)士)不是本實(shí)驗(yàn)的參與人，僅按要求進(jìn)行搡作；試驗(yàn)的療效評定為本實(shí)驗(yàn)的參與者，但評定前并不知道分組情況；數(shù)據(jù)完成后交與第三方處理。

1.4治療藥物

本研究選用藥物為自擬方通絡(luò)止痛湯，主要藥物組成為：桃仁、紅花、桂枝、白芍、草烏、細(xì)辛、川椒、牛膝、乳香、沒藥。

1.5治療具體操作

本研究采用超聲電導(dǎo)凝膠貼片貼于皮膚患處，使超聲電導(dǎo)儀的探頭與皮膚偶聯(lián)，在治療前在超聲電導(dǎo)凝膠貼片中注入中藥通絡(luò)止痛湯5ml。對照組在超聲電導(dǎo)凝膠貼片中注入5ml生理鹽水。

1.6治療時間

每天兩次治療，每次治療25分鐘。14日為一療程，間隔一周，用藥二療程。

1.7療效指標(biāo)

(1)彩B超下關(guān)節(jié)積液療效標(biāo)準(zhǔn)治愈：膝關(guān)節(jié)積液經(jīng)超證實(shí)消失，膝關(guān)節(jié)腫脹完全消退，浮髕試驗(yàn)陰性，膝關(guān)節(jié)功能活動正常；好轉(zhuǎn)：膝關(guān)節(jié)積液明顯減少，但仍有少量積液，關(guān)節(jié)腫脹已基本消退，浮髕試驗(yàn)陰性，膝關(guān)節(jié)功能基本恢復(fù)正常，但活動后膝關(guān)節(jié)仍有腫脹；無效：膝關(guān)節(jié)積液無變化或增加，浮髕試驗(yàn)陽性，膝關(guān)節(jié)功能無改善。

(2)治療前后膝關(guān)節(jié)周徑的對比選取膝關(guān)節(jié)髕骨上極為測量點(diǎn)，測量膝關(guān)節(jié)周徑，并對治療前、治療1療程、治療2療程的膝關(guān)節(jié)周徑進(jìn)行評定。

統(tǒng)計學(xué)處理

用統(tǒng)計軟件SAS 8.2建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用配對檢驗(yàn)，組間比較用檢驗(yàn)。

2治療結(jié)果

兩組治療前后膝關(guān)節(jié)周徑變化比較見表1。

治療組治療2周和4周后分別與治療前比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。對照組治療后2周與治療前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)；治療后4周與治療前比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意(p＜0.01)。2組治療前比較，差異無顯著性意義(p＞0.05)。

表1：治療前后膝關(guān)節(jié)周徑變化

注：兩組治療前比較，p＞0.05；兩組治療2療程分別與治療前、治療1療程比較ap＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；治療組治療1療程與治療前比較cp＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；對照組治療1療程與治療前比較dp＞0.05，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；治療組治療1療程、治療2療程分別與對照組相應(yīng)對應(yīng)時間點(diǎn)比gp＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，超聲組優(yōu)于對照組。

兩組治療前后膝關(guān)節(jié)超聲變化比較見表2。

表2：B超示膝關(guān)節(jié)積液變化