本發(fā)明涉及一種用于治療耳聾的藥物組合物的制備方法。技術(shù)背景：聾啞病人是指聽覺和語言障礙兼有的病人。全世界聾啞人約2億人。我國(guó)有聾啞人2700多萬，每年新增2-3萬人。一旦一個(gè)家庭有一位聾啞患兒，就會(huì)給這個(gè)家庭在經(jīng)濟(jì)上、思想上造成嚴(yán)重的困難和壓力。感音神經(jīng)性聾是由于外源性或自身衰老導(dǎo)致的耳蝸毛細(xì)胞的變性和逐漸消失，血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)、聽神經(jīng)或聽覺中樞的退行性病變引起的聽力減退和聽力喪失。目前這被認(rèn)為是一種不可逆的病變且尚無特效藥物或保守療法能使感音神經(jīng)性聾病人完全恢復(fù)聽力。藥物治療對(duì)于改善聽功能有一定療效，但十分有限，有些藥物還有較大的毒副作用。電子耳蝸植入和助聽器的應(yīng)用均依賴于螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的存活，螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的缺失會(huì)影響其效果。因此，尋找一種有效且低毒或無毒的治聾藥物仍是一條重要途徑。近年來，中藥治聾的研究也取得了很大發(fā)展。中國(guó)專利CN1775254A公開了一種治療耳聾的藥物制劑及其制備方法(龍膽、黃芩、地黃、澤瀉、川木通、梔子、當(dāng)歸、九節(jié)菖蒲、甘草、羚羊角等中藥原料制成)。但該專利中未公開臨床療效資料及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料。中國(guó)專利CN101439131A的專利中報(bào)道了一種治療感音神經(jīng)性耳聾的中藥組合物及其應(yīng)用，該中藥組合物的配方和重量比為：熟地黃22-48份，澤瀉8-18份。該專利中的藥物組合物具有滋陰補(bǔ)腎，利水泄熱的功效，對(duì)于感音神經(jīng)性耳聾有一定的防治功效。眾所周知，中藥的炮制對(duì)于藥材的治療效果有著關(guān)鍵的影響。然而在前人研究中，對(duì)于治療耳聾的藥物，并沒有一種很成熟的制備方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：有鑒于此，提出本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種用于治療耳聾的藥物組合物的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為：本發(fā)明提供了三種藥物組合物，其中，藥物組合物1由紅花5-40重量份、黃芪10-60重量份、穿山甲5-40重量份、桃仁10-60重量份、川芎4-40重量份、萊菔子5-40重量份、木香5-40重量份、烏藥6-40重量份、熟地15-70重量份，山萸肉15-70重量份、丹皮6-40重量份、云苓6-40重量份、澤瀉5-50重量份、磁石15-80、皂刺5-50重量份、水蛭5-40重量份、知母5-40重量份、黃柏5-40重量份制成；組合物2由黃芪30-90重量份、當(dāng)歸5-50重量份、川芎3-20重量份、赤芍7-40重量份、桃仁3-30重量份、紅花3-30重量份、肉桂1-10重量份、蘇木5-50重量份、水蛭3-30重量份、王不留10-60重量份、磁石10-60重量份制成。組合物3由銀花15-60重量份、瓜蔞15-60重量份、當(dāng)歸5-30重量份、元胡15-60重量份、川芎20-90重量份、人參3-30重量份、五靈脂5-40重量份、冰片10-60重量份，麝香(或人工麝香)1-10重量份、磁石15-60重量份、杞果7-60重量份、公英15-60重量份、山萸肉15-60重量份制成。本發(fā)明還提供了一種用于制備治療耳聾藥物的藥物組合物，其中，該藥物組合物由組合物2和組合物3組成，使用時(shí)將組合物2和組合物3聯(lián)用。優(yōu)選的，組合物2的組方為黃芪60重量份、當(dāng)歸10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、紅花6重量份、肉桂5重量份、蘇木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份；組合物3的組方為銀花30重量份、瓜蔞30重量份、當(dāng)歸10重量份、元胡30重量份、川芎45重量份、人參6重量份、五靈脂10重量份、冰片20重量份，麝香(或人工麝香)5重量份、磁石30重量份、杞果15重量份、公英30重量份、山萸肉30重量份。一種用于制備上述藥物組合物的制備方法，其特征在于：組合物2、3的制備步驟包括(1)原料的清洗(2)原料的預(yù)處理-炒制(本發(fā)明中提到的炒制意為將藥材炒焦，具體操作方法為，將藥材置于鍋內(nèi)，用中火炒制外呈焦黃，內(nèi)呈黃色的狀態(tài))(3)水煎(4)加入乙醇(5)過濾(6)濃縮包裝。優(yōu)選的，所述藥材從原產(chǎn)地采購(gòu)，并按照《中國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥材進(jìn)行篩選，粉碎和切片。優(yōu)選的，采用低氘水對(duì)藥材進(jìn)行清洗，浸泡10-30min。優(yōu)選的，清洗前將低氘水中加入0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理。低氘水的氘豐度為20-130×104atm％。優(yōu)選的，增氧至水中氧含量為15-60ul/L時(shí)，停止增氧。優(yōu)選的，浸泡時(shí)經(jīng)過超聲處理，功率為280w。優(yōu)選的，炒制過程為中火炒制20min。優(yōu)選的，水煎的步驟為，將浸泡過的藥材取出，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入100-130℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流10-30min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液。優(yōu)選的，濃縮包裝的步驟為，將加入乙醇的煎液濃縮，經(jīng)脫色、調(diào)節(jié)pH值或除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥。優(yōu)選的，所述組合物1的制備方法為：制備方法：(1)將上述藥材從原產(chǎn)地采購(gòu)；(2)清洗，將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為20×104atm％的低氘水，加入少量的微量元素硒，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為25ul/L時(shí)，停止增氧；在所得含微量元素的低氘增氧水中加入步驟(1)中的產(chǎn)地藥材進(jìn)行清洗，浸泡15min；(3)藥材的挑選，將水洗浸泡后的藥材照2010年版《中國(guó)藥典》中藥一部的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)藥材進(jìn)行篩選、粉碎和切片；(4)藥材的浸泡，將已經(jīng)粉碎或切片的紅花、黃芪、穿山甲、桃仁、川芎、萊菔子、木香、烏藥、熟地，山萸肉、丹皮、云苓、澤瀉、皂刺、知母、黃柏于40℃的低氘水中浸泡20min；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分鐘；(5)水煎，將步驟(4)中浸泡過的藥材取出，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；(6)濃縮包裝，將步驟(5)中所得煎液濃縮，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為50-150ml。優(yōu)選的，所述組合物2的制備方法為：(1)清洗，將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為20×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為25ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留于40℃的低氘水中浸泡20min；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分鐘；(2)炒制：(3)水煎，將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為30-60％；(5)過濾：靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；(6)濃縮包裝，將步驟(5)中所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.1-1.3g/ml，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為50-150ml。優(yōu)選的，所述組合物3的制備方法為：(1)清洗，將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為20×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為25ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的銀花、瓜蔞、當(dāng)歸、元胡、川芎、人參、五靈脂、冰片，麝香(或人工麝香)、杞果、公英、山萸肉量份于40℃的低氘水中浸泡20min；將已經(jīng)粉碎的磁石于60℃的低氘水中浸泡20分鐘；(2)炒制：(3)水煎，將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為30-60％；(5)過濾：靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；(6)濃縮包裝，將步驟(5)中所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.1-1.3g/ml，調(diào)節(jié)pH值至6，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為50-150ml。優(yōu)選的，所述組合物2的制備方法為：炒制的步驟為，中火對(duì)黃芪，當(dāng)歸，桃仁，蘇木這幾味藥材進(jìn)行炒制。優(yōu)選的，所述組合物3的制備方法為：炒制的步驟為，中火對(duì)銀花，當(dāng)歸，元胡，公英，山萸肉這幾味藥材進(jìn)行炒制。優(yōu)選的，所述組合物2的清洗的步驟為：將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為20×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為25ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留浸泡于40℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w。優(yōu)選的，所述組合物3的清洗的步驟為：將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為20×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為25ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的銀花、瓜蔞、當(dāng)歸、元胡、川芎、人參、五靈脂、冰片，麝香(或人工麝香)、杞果、公英、山萸肉浸泡于40℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將已經(jīng)粉碎的磁石浸泡于60℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w。本發(fā)明的有益效果為：1.采用經(jīng)過特殊處理的水對(duì)藥材進(jìn)行清洗，能夠活化藥材中的有效成分，易于藥物發(fā)揮藥性。2.將不同的藥材分開浸泡超聲，便于藥材中的有效成分更好的逸出。3.將不同的藥材分開浸泡，炒制，便于藥材中的有效成分更好的逸出。4.經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明方法所得的藥物組合物，在治療因感音毛細(xì)胞損傷或缺失導(dǎo)致的耳聾有良好的治療效果，治愈率高。附圖說明圖1是本發(fā)明中對(duì)照組致聾90天后毛細(xì)胞的電鏡觀察圖(20KV×1500)；圖2是本發(fā)明中對(duì)照組致聾90天后毛細(xì)胞的電鏡觀察圖(20KV×3000)；圖3是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組5致聾實(shí)驗(yàn)后治療90天毛細(xì)胞再生的電鏡觀察圖(20KV×1500)；圖4是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組5致聾實(shí)驗(yàn)后治療90天毛細(xì)胞再生的電鏡觀察(20KV×3000)。具體實(shí)施方式實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例目的在于驗(yàn)證炒制對(duì)于制備復(fù)聰湯的有益效果。以組合物2的制備方法為例：實(shí)驗(yàn)中，以藥材提取后，藥液的溶質(zhì)質(zhì)量作為檢測(cè)指標(biāo)，溶質(zhì)質(zhì)量越高，有效成分提取的量越大，推測(cè)該制備方法的治療效果越好。1.不用炒制方法制備：按重量份數(shù)稱取如下藥材：黃芪60重量份、當(dāng)歸10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、紅花6重量份、肉桂5重量份、蘇木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，總計(jì)100g。量取1000ml氘豐度為20×104atm％的低氘水，加入0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為25ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留于40℃的低氘水中浸泡20min；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分鐘。將清洗過的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液。將煎液靜置12h，過濾，濾液減壓干燥獲得粉末，稱重。2.采用炒制方法制備：按重量份數(shù)稱取如下藥材：黃芪60重量份、當(dāng)歸10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、紅花6重量份、肉桂5重量份、蘇木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，總計(jì)100g。量取1000ml氘豐度為20×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為25ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留于40℃的低氘水中浸泡20min；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分鐘。將清洗過的藥材晾干，放入鍋中，中火炒制20min。隨后按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液。將煎液靜置12h，過濾，濾液減壓干燥獲得粉末，稱重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過炒制步驟的煎液，其溶質(zhì)質(zhì)量更大，可以推測(cè)煎液中的有效成分更多。表1經(jīng)炒制步驟與不經(jīng)炒制步驟獲得的煎液的溶質(zhì)質(zhì)量粉末質(zhì)量(g)未經(jīng)炒制5.7經(jīng)過炒制6.8隨后的實(shí)驗(yàn)中，申請(qǐng)人意外的發(fā)現(xiàn)，并非所有藥材都適合炒制，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組合物2中炒制黃芪，當(dāng)歸，桃仁，蘇木這幾味藥材，獲得的煎液溶質(zhì)質(zhì)量最大。組合物3中炒制銀花，當(dāng)歸，元胡，公英，山萸肉這幾味藥材，獲得的煎液溶質(zhì)質(zhì)量最大。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2-3所示。表2組合物2中不同炒制方案中表3組合物3中不同炒制方案中實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例目的在于驗(yàn)證超聲對(duì)于制備復(fù)聰湯的有益效果。以組合物2的制備方法為例：實(shí)驗(yàn)中，以藥材提取后，藥液的溶質(zhì)質(zhì)量作為檢測(cè)指標(biāo)，溶質(zhì)質(zhì)量越高，有效成分提取的量越大，推測(cè)該制備方法的治療效果越好。1.不用超聲方法制備：按重量份數(shù)稱取如下藥材：黃芪60重量份、當(dāng)歸10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、紅花6重量份、肉桂5重量份、蘇木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，總計(jì)100g。量取1000ml氘豐度為20×104atm％的低氘水，加入0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為25ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留于40℃的低氘水中浸泡20min；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分鐘。將清洗過的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液。將煎液靜置12h，過濾，濾液減壓干燥獲得粉末，稱重。2.采用超聲方法制備：按重量份數(shù)稱取如下藥材：黃芪60重量份、當(dāng)歸10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、紅花6重量份、肉桂5重量份、蘇木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，總計(jì)100g。量取1000ml氘豐度為20×104atm％的低氘水，加入0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為25ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留浸泡于40℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w。隨后按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液。將煎液靜置12h，過濾，濾液減壓干燥獲得粉末，稱重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過超聲步驟的煎液，其溶質(zhì)質(zhì)量更大，可以推測(cè)煎液中的有效成分更多。表4經(jīng)超聲步驟與不經(jīng)超聲步驟獲得的煎液的溶質(zhì)質(zhì)量粉末質(zhì)量(g)未經(jīng)超聲6.7經(jīng)過超聲12.3對(duì)比例1按照CN1775254A中的制備方法，制備治療耳聾藥劑。稱取龍膽125g，黃芩125g，地黃125g，澤瀉125g，川木通125g，梔子125g，當(dāng)歸125g，九節(jié)菖蒲125g，甘草125g，羚羊角6.25g。當(dāng)歸、羚羊角分別粉碎成細(xì)粉；其余龍膽等八味加乙醇回流提取二次，第一次2小時(shí)，第二次1.5小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至稠膏狀；藥渣加水煎煮二次，第一次1.5小時(shí)，第二次1小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.30～1.35(50℃)的清膏，與上述稠膏合并，攪勻，真空干燥，粉碎成細(xì)粉，加入當(dāng)歸、羚羊角細(xì)粉，混勻，加入適量淀粉及2％微粉硅膠，混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得。對(duì)比例2按照CN101439131A中的制備方法，制備治療耳聾藥劑。稱取熟地黃24g、澤瀉9g，加入10倍量雙蒸水浸泡2h，武火煮沸后，文火煎煮0.5h，取藥液。再次加入8倍量的雙蒸水，浸泡1h，武火煮沸后，文火煎煮0.5h，取藥液。將兩次藥液合并，90℃水浴濃縮。按體積比2∶3加入無水乙醇，充分混勻，4℃靜置24h，1500rpm離心15min，取上清，棄沉淀。90℃水浴揮發(fā)乙醇，三蒸水定容至270ml液體。0.22μm小濾器過濾除菌，制得藥劑。對(duì)比例3按照組合物2的組方，稱取黃芪60重量份、當(dāng)歸10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、紅花6重量份、肉桂5重量份、蘇木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，共計(jì)100g。將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為55×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為30ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留于40℃的低氘水中浸泡20min；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分鐘；將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為50％；靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；將上一步所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.2g/ml，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為100ml。對(duì)比例4按照組合物2的組方，稱取黃芪60重量份、當(dāng)歸10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、紅花6重量份、肉桂5重量份、蘇木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，共計(jì)100g。將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為55×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為30ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留浸泡于40℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為50％；靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；將上一步所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.2g/ml，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為100ml。對(duì)比例5按照組合物2的組方，稱取黃芪60重量份、當(dāng)歸10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、紅花6重量份、肉桂5重量份、蘇木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，共計(jì)100g。將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為55×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為30ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留浸泡于40℃的低氘水中；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中；中火對(duì)黃芪、當(dāng)歸、桃仁、蘇木這幾味藥材進(jìn)行炒制；將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為50％；靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；將上一步所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.2g/ml，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為100ml。制備例1組合物2的組方：黃芪30重量份、當(dāng)歸5重量份、川芎3重量份、赤芍7重量份、桃仁3重量份、紅花3重量份、肉桂1重量份、蘇木5重量份、水蛭3重量份、王不留10重量份、磁石10重量份，共稱取藥材100g。制備方法：(1)清洗，將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為20×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為15ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、赤芍、川芎、紅花、肉桂、蘇木、王不留于40℃的低氘水中浸泡于40℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；(2)炒制：中火對(duì)黃芪，當(dāng)歸，桃仁，蘇木這幾味藥材進(jìn)行炒制；(3)水煎，將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為30％；(5)過濾：靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；(6)濃縮包裝，將步驟(5)中所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.1g/ml，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為100ml。制備例2組合物2的組方：黃芪90重量份、當(dāng)歸50重量份、川芎20重量份、赤芍40重量份、桃仁30重量份、紅花30重量份、肉桂10重量份、蘇木50重量份、水蛭30重量份、王不留60重量份、磁石60重量份，共稱取藥材100g。制備方法：(1)清洗，將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為130×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為60ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留于40℃的低氘水中浸泡于40℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；(2)炒制：中火對(duì)黃芪，當(dāng)歸，桃仁，蘇木這幾味藥材進(jìn)行炒制；(3)水煎，將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為60％；(5)過濾：靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；(6)濃縮包裝，將步驟(5)中所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.3g/ml，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為100ml。制備例3組合物2的組方：黃芪60重量份、當(dāng)歸10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、紅花6重量份、肉桂5重量份、蘇木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，共稱取藥材100g。制備方法：(1)清洗，將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為55×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為30ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的黃芪、當(dāng)歸、桃仁、川芎、赤芍、紅花、肉桂、蘇木、王不留于40℃的低氘水中浸泡于40℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將已經(jīng)粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；(2)炒制：中火對(duì)黃芪，當(dāng)歸，桃仁，蘇木這幾味藥材進(jìn)行炒制；(3)水煎，將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為50％；(5)過濾：靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；(6)濃縮包裝，將步驟(5)中所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.2g/ml，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為100ml。制備例4組合物3的組方：銀花15重量份、瓜蔞15重量份、當(dāng)歸5重量份、元胡15重量份、川芎20重量份、人參3重量份、五靈脂5重量份、冰片10重量份，麝香(或人工麝香)1重量份、磁石15重量份、杞果7重量份、公英15重量份、山萸肉15重量份，共稱取藥材100g。制備方法：(1)清洗，將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為20×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為25ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的銀花、瓜蔞、當(dāng)歸、元胡、川芎、人參、五靈脂、冰片，麝香(或人工麝香)、杞果、公英、山萸肉浸泡于40℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將已經(jīng)粉碎的磁石浸泡于60℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；(2)炒制：中火對(duì)銀花，當(dāng)歸，元胡，公英，山萸肉這幾味藥材進(jìn)行炒制；(3)水煎，將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為30％；(5)過濾：靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；(6)濃縮包裝，將步驟(5)中所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.1g/ml，調(diào)節(jié)pH值至6，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為100ml。制備例5組合物3的組方：銀花60重量份、瓜蔞60重量份、當(dāng)歸30重量份、元胡60重量份、川芎90重量份、人參30重量份、五靈脂40重量份、冰片60重量份，麝香(或人工麝香)10重量份、磁石60重量份、杞果60重量份、公英60重量份、山萸肉60重量份，共稱取藥材100g。制備方法：(1)清洗，將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為130×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為60ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的銀花、瓜蔞、當(dāng)歸、元胡、川芎、人參、五靈脂、冰片，麝香(或人工麝香)、杞果、公英、山萸肉浸泡于40℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將已經(jīng)粉碎的磁石浸泡于60℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；(2)炒制：中火對(duì)銀花，當(dāng)歸，元胡，公英，山萸肉這幾味藥材進(jìn)行炒制；(3)水煎，將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為60％；(5)過濾：靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；(6)濃縮包裝，將步驟(5)中所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.3g/ml，調(diào)節(jié)pH值至6，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為100ml。制備例6組合物3的組方：銀花30重量份、瓜蔞30重量份、當(dāng)歸10重量份、元胡30重量份、川芎45重量份、人參6重量份、五靈脂10重量份、冰片20重量份，麝香(或人工麝香)5重量份、磁石30重量份、杞果15重量份、公英30重量份、山萸肉30重量份，共稱取藥材100g。制備方法：(1)清洗，將1000ml去離水照常規(guī)方法制備氘豐度為55×104atm％的低氘水，0.0001％亞硒酸鈉，攪拌均勻后，進(jìn)行增氧處理，至水中氧含量為30ul/L時(shí)，停止增氧；將已經(jīng)粉碎或切片的銀花、瓜蔞、當(dāng)歸、元胡、川芎、人參、五靈脂、冰片，麝香(或人工麝香)、杞果、公英、山萸肉浸泡于40℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；將已經(jīng)粉碎的磁石浸泡于60℃的低氘水中，超聲處理20min，超聲功率280w；(2)炒制：中火對(duì)銀花，當(dāng)歸，元胡，公英，山萸肉這幾味藥材進(jìn)行炒制；(3)水煎，將上述步驟獲得的藥材，按照先加入根莖類藥物，后加入葉片類藥物的順序加入120℃的低氘水中，恒溫恒壓下封閉回流20min；回流完畢后，收集煎液，并于相同溫度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：將煎液中加入乙醇，使得乙醇濃度為50％；(5)過濾：靜置12h，過濾沉淀獲得藥液；(6)濃縮包裝，將步驟(5)中所得藥液蒸餾濃縮，直到藥液密度達(dá)到1.2g/ml，調(diào)節(jié)pH值至6，除菌后用無菌軟包、玻璃瓶或塑料瓶包裝成藥，裝量為100ml。效果例1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.造模選用健康青年雜色豚鼠，耳廓反射正常，體重250-300g，雌雄各半。隨機(jī)分為慶大霉素致聾組(Gentamyci,GM組)，正常對(duì)照組。動(dòng)物用戊巴比妥鈉80mg/Kg劑量麻醉，進(jìn)行腦干誘發(fā)電位(ABR)和畸變耳聲發(fā)射(DPOAE)測(cè)定。測(cè)定后的GM組每天肌注慶大霉素(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H37021973)按80mg/kg。連續(xù)肌肉注射14-20天，測(cè)定慶大霉素注射動(dòng)物的ABR閾值在50dBSPL以上，DPOAE幅值明顯下降后，再分為致聾后對(duì)照組、致聾后中藥治療組和對(duì)比例治療組。正常對(duì)照組肌肉注射生理鹽水同樣時(shí)間。注射后的所有動(dòng)物進(jìn)行ABR和DPOAE測(cè)定。2.聽功能測(cè)定方法美國(guó)InteligentHearingSmart聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射儀(腦干誘發(fā)電位、耳蝸電圖、多頻穩(wěn)態(tài))。動(dòng)物麻醉后，用針電極插入顱頂為記錄電極，同側(cè)為參考電極，對(duì)側(cè)接地。刺激率19.1/ms,高通300，低通3000，平均疊加256-512次。DPOAE記錄是將大小合適的探頭塞入外耳道，使外耳道密封，當(dāng)刺激信號(hào)平穩(wěn)后進(jìn)行測(cè)試，重復(fù)兩次。每個(gè)受試者均接受兩個(gè)初始音強(qiáng)度分別為為L(zhǎng)1＝70dBSPL，L2＝70dBSPL的純音信號(hào)刺激，初始音的頻率比為f1/f2＝1.22，f1、f2的幾何均數(shù)的范圍位于0.5～8.0kHz。分別選擇f2為0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16，32kHz各點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試，測(cè)量不同刺激強(qiáng)度時(shí)DPOAE的幅值，以引出反應(yīng)幅值高出本底噪聲3dB時(shí)的最小刺激強(qiáng)度作為DPOAE有無的指標(biāo)，確定檢出率。上述測(cè)試均疊加100次。3.治療方法及藥物用量3.1將GM致聾豚鼠隨機(jī)分組，每組各20只。按陳奇主編的《中藥藥理研究方法學(xué)》方法，按成人量(mg/kg)換算成動(dòng)物劑量的倍數(shù)簡(jiǎn)表，換算豚鼠為4.5倍的劑量(mg/kg)，計(jì)算出豚鼠的口服用藥劑量為10ml。如本發(fā)明表1所述，致聾后對(duì)照組、致聾后中藥治療組和對(duì)比例治療組的小鼠每天服用中藥組合物2，組合物3，二者的組合物，對(duì)比例中的中藥組合物，連續(xù)治療3個(gè)月。慶大霉素致聾后對(duì)照組同樣為20只，給予口服同劑量的生理鹽水，時(shí)間同治療組。3.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用MicrosoftOfficeExcel錄入數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值，制作數(shù)據(jù)表格。分析數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0forWindow軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。3.3DPOAE實(shí)驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知(見表6-8)，在高頻區(qū)(2844Hz-8040Hz)，組合物2、3單獨(dú)使用均有一定的復(fù)聰作用，但是當(dāng)聯(lián)用組合物2、3時(shí)，如實(shí)驗(yàn)組5的治療方案，藥效最佳(見表6、7)(P＜0.01)。此外，如表5所示，與對(duì)比例的五種處方相比，組合物2、3聯(lián)用的復(fù)聰效果要更好。其中，采用制備例3方法制得的復(fù)聰湯，其效果要優(yōu)于采用對(duì)比例3-5方法制備的復(fù)聰湯，這說明在藥物炮制過程中，超聲及炒制都是必要步驟。此外，組合物2、3的聯(lián)用效果最佳，可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聽力的高頻區(qū)基本恢復(fù)到正常水平。3.4ABR實(shí)驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)表9、表10可知，正常豚鼠的ABR平均閾值應(yīng)當(dāng)在20-30dBSPL，GM致聾后ABR閾值上升到43-57dBSPL，與正常豚鼠相比，數(shù)據(jù)有顯著性差異(P＜0.01)。組合物治療90天后，ABR的平均閾值均有不同程度的下降，其中，采用組合物2、3聯(lián)用的治療方案，ABR閾值基本恢復(fù)到正常程度，與正常組相比沒有顯著性差異(P＞0.05)。表5：對(duì)大慶素致聾豚鼠給藥分組和給藥情況表6：致聾實(shí)驗(yàn)0日時(shí)正常組與慶大霉素致聾組致聾后DPOAE各頻率幅值(dBSPL,x±s)表7：致聾實(shí)驗(yàn)90日后正常組與慶大霉素致聾普通組DPOAE各頻率幅值(dBSPL,x±s)表8：致聾實(shí)驗(yàn)90日后對(duì)比例組DPOAE各頻率幅值(dBSPL,x±s)表9：致聾實(shí)驗(yàn)0日時(shí)各組ABR反應(yīng)域(dBSPL,x±s)組別耳數(shù)ABR反應(yīng)域14024.64±4.8324052.53±6.12表10：致聾實(shí)驗(yàn)90日后各組ABR反應(yīng)域(dBSPL,x±s)效果例2掃描電鏡觀察方法：對(duì)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組5進(jìn)行掃描電鏡的觀察。步驟如下。將取材的左側(cè)耳蝸樣品用緩沖液把組織表面洗凈，在解剖顯微鏡下(OLYMPUS，TOKYO，297261)，用纖細(xì)鋼針在耳蝸頂部打一小孔，一定要挑破前庭膜，再挑破圓窗膜和卵圓窗膜，并去除鐙骨及足板，用細(xì)滴管將2.5％戊二醛固定液從蝸尖小孔和圓窗卵圓窗反復(fù)滴灌3-5次，明顯看到液體從兩窗流出。將樣品浸泡在固定液中，置于4℃冰箱中4小時(shí)。置于0.1MPB緩沖液中，在解剖顯微鏡下在耳蝸各回骨壁鉆孔，使耳蝸各回與固定液相通，再浸泡于固定液中4小時(shí)。用0.1MPB漂洗三次后，用1％OsO4后固定2小時(shí)。用0.1MPB漂洗20-30分鐘。用乙醇梯度脫水，乙醇的濃度依次為30％-50％-70％-90％-100％(3次)，乙醇與乙酸異戊酯1:1的混合液10-20分鐘；純乙酸異戊酯10-20分鐘。臨界點(diǎn)干燥：裝樣：將樣品從乙酸異戊酯中放入濾紙6中，移入臨界點(diǎn)干燥儀的樣品杯(高壓容器)內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。注入液態(tài)二氧化碳，依次打開二氧化碳鋼瓶的排氣閥和儀器的進(jìn)氣閥在0-10℃下，向樣品杯注入液態(tài)二氧化碳。當(dāng)液態(tài)二氧化碳充至樣品杯容積的50％時(shí)，關(guān)閉儀器進(jìn)氣閥，靜置15-20分鐘，讓乙酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分?jǐn)U散，然后打開儀器打開儀器排氣閥門和進(jìn)氣閥門，讓其邊排氣邊充氣10分鐘，再關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)沖入液態(tài)二氧化碳至樣品杯的80％左右關(guān)閉進(jìn)氣閥。加溫置換：將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20℃處經(jīng)15-20分鐘后，由于溫度升高，樣品杯內(nèi)液態(tài)二氧化碳逐漸氣化，因此，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的乙酸異戊酯將二氧化碳充分置換。氣化：將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上(35-40℃)，此時(shí)隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐漸增加達(dá)到二氧化碳的臨界點(diǎn)，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達(dá)到7134Pa時(shí)經(jīng)5分鐘后，即可排氣。排氣：在保持溫度不變的情況下(即不關(guān)電源)打開流量計(jì)的排氣閥門，以1.0L/分鐘的速度排氣，經(jīng)2小時(shí)左右排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零將溫度調(diào)節(jié)至室溫約5分鐘后，即可取出樣品。離子濺射鍍膜：將樣品用雙面膠帶樣品臺(tái)上(注意樣品觀察的方向性)。將樣品放入離子濺射儀的真空罩內(nèi)，當(dāng)真空罩內(nèi)的真空度抽到10-1Pa時(shí)在陰極與陽極中間加上1000-3000V的直流電壓，兩極之間產(chǎn)生弧光放電的電場(chǎng)。在電場(chǎng)的作用下罩內(nèi)殘余的氣體分子被電離為正離子和電子，正離子被陰極吸引轟擊金屬靶，激發(fā)出金屬離子和電子，并被陽極吸引附著在樣品表面而形成金屬導(dǎo)電膜。掃描電鏡觀察在S-2700ScanningElectionMicroscopeHITACHI下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-4所示。圖1，圖2為慶大霉素致聾90天后的毛細(xì)胞形態(tài)，可見毛細(xì)胞表面的纖毛破損嚴(yán)重且不規(guī)則。圖3，圖4為致聾后，采用實(shí)驗(yàn)組5制備的復(fù)聰湯進(jìn)行治療90天后的情況，由圖可見，纖毛數(shù)量有了顯著的提升，排列也較為均勻，規(guī)則。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3