本發(fā)明涉及具有造影功能的納米復合材料制備及應用領域，具體涉及一種新型MRI和CT雙模式成像指導的釓修飾硫化鉍納米診療劑的制備方法。

背景技術：

目前，腫瘤的治療方法有三大傳統(tǒng)治療方法：外科手術治療，放射性治療和化學藥物治療。然而，手術治療無法徹底治愈那些已有腫瘤轉移的晚期病人，而化療和放療給患者的二次傷害更比癌癥本身帶來的傷害更多。雖然三大癌癥的傳統(tǒng)治療手段各有其優(yōu)點，相互補充，從而在腫瘤治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用，但是這三大傳統(tǒng)治療方法都存在一定的不足。因此，探索最新的并且毒副作用小的腫瘤治療方法成為目前醫(yī)學界腫瘤治療亟待解決的問題。

光熱治療是通過利用納米制劑在特定波長存在高的吸收特性，從而在特定波長的近紅外激光照射下，將光能轉化為熱能，并使腫瘤癌細胞處于一個高溫環(huán)境中，最終致使癌細胞凋亡，達到治療惡性腫瘤的目的。光熱療法的優(yōu)點包括:直接針對病變組織，微創(chuàng)性和非侵入性。光熱治療能引發(fā)細胞內(nèi)蛋白結構變化和組織碳化等一系列生物學變化。治療用的近紅外激光只照射在病變組織，而對周圍正常組織的影響很小。這種空間特異性和非侵入性治療方式使光熱治療相比其它手術或者侵入性治療方法，更成為一種廣受歡迎的治療方式。光熱治療是根據(jù)納米材料本身高的吸收，不需要引入一些功能化的分子或者基團。在納米制劑的設計上要求相對較低。所以，諸多納米材料都可以被用于光熱治療。常用的光熱制劑可以分為：有機化合物，包括聚吡咯、吲哚菁綠(ICG)和聚苯乙烯納米顆粒等；金屬納米復合材料；碳基納米材料，包括碳管、石墨烯、以及碳基復合納米材料；硫族化合物，包括WS₂、MoS₂、CuS和CuSe等；金屬納米復合材料，包括各種形貌的金納米材料(金納米顆粒.金納米棒、金納米殼層、納米籠和金星等)、鍺納米顆粒和鈀納米片等。然而這些材料都存在各自的缺點：碳基納米材料在近紅外區(qū)的吸收系數(shù)很低，光熱轉換效率不是很理想；有機化合物納米材料存在嚴重的光漂白，而且光熱轉換效率不盡如人意；金屬納米材料由于種類繁多，形貌各異而受到廣泛的關注和研究。但是，金屬納米材料制備成本大，也就限制其大規(guī)模的生產(chǎn)和進一步推廣。一個最佳的納米微粒的指導光熱治療診療劑的制備必須遵循以下幾個原則：第一，高的X-射線消光能力；第二：低毒性；第三：成本低；第四：尺寸小，因為小尺寸的納米材料相對于大尺寸的材料來說具有更強的X-射線消光效果。

CT成像全稱電子計算機斷層掃描成像，就是人們通常所說的X射線成像。CT成像以X射線的三維重構為基礎。它的基本原理是不同組織有不同的X射線吸收能力，并且其X射線的組織透過劑量也會不同。利用測定不同部位組織X射線的透過劑量并利用數(shù)位幾何處理重建出組織斷層面三維影像。X射線對人體有電離輻射傷害而成為CT成像的主要缺點。除此，CT成像技術很難分辨密度相差不大的軟組織，難以得到腫塊、血管等軟組織的清晰圖像。

磁共振成像(MRI)是一種基于核磁共振原理的醫(yī)學成像技術。核磁共振的原理是磁性原子核在外加磁場的作用下，吸收了一定頻率的射頻脈沖后，由低能態(tài)向高能態(tài)躍遷而產(chǎn)生的磁共振現(xiàn)象。MRI成像空間分辨率高，并且多參數(shù)成像和剖面成像不受組織影響等特點，使其成為臨床診斷中主要的成像手段之一。然而，MRI成像的缺點是成像速度不夠快，不能觀察組織和器官的動態(tài)圖像，也無法采集組織和器官的動態(tài)圖像，并且無法對體內(nèi)裝有心臟起搏器或者其它金屬物體的患者進行MRI成像檢查。

目前，MRI診斷技術可以結合CT診斷技術以使得到人體組織的任意斷面清晰圖像。相應地，由于MRI診斷技術與CT診斷技術的結合，配合該結合診斷技術的新型CT/MRI雙模式醫(yī)學造影劑的研發(fā)即成為研究熱點之一。然而，制備上述造影劑材料的結構性能由反應物及其所進行反應的機制決定，要以滿足MRI、CT醫(yī)學檢測診斷需求為目的，采用簡捷的方法，高效制備出具備相應功能的材料仍是這一領域亟待克服的難關。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種新型MRI和CT雙模式成像指導的釓修飾硫化鉍納米診療劑的制備方法，該制備方法通過結合現(xiàn)有醫(yī)學造影劑的研究背景，簡化CT/MRI雙模式造影劑制備方法，具有制備簡單、可控性好、生產(chǎn)效率高、易于工業(yè)化生產(chǎn)等特點。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗研究并不懈努力，最終以油酸、油胺、1-十八烯、新癸酸鉍和硫代乙酰胺為原材料合成硫化鉍，利用二乙三胺五乙酸雙環(huán)酐和三氯化鉍制備Gd-DTPA-OA配體，然后對硫化鉍修飾Gd-DTPA-OA配體，從而得到釓修飾的硫化鉍納米材料(圖1所示)。具體為：

一種新型MRI和CT雙模式成像指導的釓修飾硫化鉍納米診療劑的制備方法，該方法包括如下步驟：

(1)制備硫化鉍納米材料：

a.量取油酸和十八碳烯于反應容器中，在劇烈攪拌的條件下，將新癸酸鉍加至反應容器中，得混合物；

b.在N₂保護下，將混合物加熱至160-170℃，保持15-30min后再冷卻至103-107℃；

c.將含有硫代乙酰胺的油胺溶液在劇烈攪拌下注入上一步驟的混合物中，注入后溶液變成深褐色，反應持續(xù)4-7min；

d.冷卻至室溫后，加入乙醇溶液洗滌，獲得硫化鉍納米材料,將所制備的硫化鉍納米材料按1.2-1.8mg/mL的濃度分散到二氯甲烷中，備用；

(2)制備Gd-DTPA-OA配體：

a.將二乙三胺五乙酸加入到68-72℃下含有DMF和油胺的溶液中，該溫度下攪拌3-5h；

b.待溶液降至室溫后，棄去上清液，加入乙醇后，抽濾，干燥洗滌得到二乙三胺五乙酸雙環(huán)酐；

c.向去離子水中加入二乙三胺五乙酸雙環(huán)酐和氫氧化鈉溶液，超聲混合0.5-1.5h，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH為6-7，放置一夜，以二乙三胺五乙酸雙環(huán)酐/GdCl₃·6H₂O的摩爾比為1.06的比例加入GdCl₃·6H₂O的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為6-7，混合液繼續(xù)攪拌8-16h；

(3)制備Bi₂S₃-Gd納米材料：

取硫化鉍二氯甲烷體系溶液，加水稀釋8-12倍，然后超聲助溶，以2500-3500r/min的轉速離心4-8min后，取淡黃色上清液，加入至步驟(2)制備的溶液中超聲震蕩，得到釓修飾硫化鉍納米診療劑Bi₂S₃-Gd納米材料。

在本發(fā)明最優(yōu)選的實施例中，上述新型MRI和CT雙模式成像指導的釓修飾硫化鉍納米診療劑的制備方法具體包括如下步驟：

(1)制備硫化鉍納米材料：

a.量取油酸13.33mL和十八碳烯26.67mL于容器中，在劇烈攪拌的條件下，將新癸酸鉍2.096mL加至容器中；

b.在N₂保護下，將該混合物加熱至165℃，保持20分鐘后再冷卻至105℃，得混合物；

c.將含有硫代乙酰胺0.25g的油胺溶液2.33mL在劇烈攪拌下注入上述混合物，注入后溶液變成深褐色，反應在該溫度下持續(xù)5分鐘，在整個反應過程中要在容器中通過溢流N₂保護；

d.冷卻至室溫后，加入乙醇溶液，洗滌兩次后離心，獲得納米材料,將所制備的硫化鉍納米材料按1.2-1.8mg/mL的濃度分散到二氯甲烷中，備用；

(2)制備Gd-DTPA-OA配體：

a.將二乙三胺五乙酸0.5334g加入到70℃下含有DMF 15mL和油胺0.485mL的溶液中，該溫度下攪拌4h；

b.待溶液降至室溫后，棄去上清液，加入乙醇后，抽濾，干燥洗滌3次即可得到二乙三胺五乙酸雙環(huán)酐；

c.向去離子水19mL中加入二乙三胺五乙酸雙環(huán)酐0.0137g和0.1mol/L的NaOH0.83mL，超聲混合1h，然后用HCl調(diào)節(jié)pH為6-7，放置一夜，以二乙三胺五乙酸雙環(huán)酐/GdCl₃·6H₂O的摩爾比為1.06的比例加入25mmol/L的GdCl₃·6H₂O水溶液中0.650mL，調(diào)節(jié)pH為6-7，混合液繼續(xù)攪拌12h；

(3)制備Bi2S3-Gd納米材料：

取硫化鉍二氯甲烷體系溶液，加水稀釋8-12倍，然后超聲助溶，以2500-3500r/min的轉速離心4-8min后，取淡黃色上清液，加入至步驟(2)制備的溶液中超聲震蕩，得到釓修飾硫化鉍納米診療劑Bi₂S₃-Gd納米材料。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明通過制備油酸、油胺保護的硫化鉍納米材料,然后合成兩親性的Gd-DTPA-OA配體；最后該配體與油相的硫化鉍通過親水疏水作用力結合在一起得到了釓修飾的硫化鉍納米材料,即通過在硫化鉍納米材料表面修飾釓螯合物，從而賦予該材料MRI和CT雙模式成像指導的光熱治療效果，實現(xiàn)了MRI和CT雙模式成像指導的光熱治療。具體的進步性和優(yōu)點體現(xiàn)如下：

(1)硫化鉍納米材料是一種具有潛在應用價值的CT造影劑。鉍元素的X-射線消光系數(shù)比碘的X-射線消光系數(shù)高，具有較低的毒性，在體內(nèi)不會殘留。

(2)硫化鉍是一種半導體材料，在室溫條件下它的禁帶寬度為1.33eV。如此低的禁帶寬度使得硫化鉍在近紅外區(qū)具有非常強的吸收。因此，硫化鉍納米材料可以作為一種有效的光熱治療試劑。

(3)將CT造影劑(Bi2S3)和T1造影劑(Gd-DTPA)結合到一起，將賦予該材料雙模式成像指導的光熱治療效果，有效的彌補單一MRI和CT的缺陷，從而使成像信息更具準確性、精確性和可靠性，更有利于早期病變的診斷。

附圖說明

圖1：(a)硫化鉍納米材料的制備；(b)DTPA-OA的制備示意圖；(c)釓修飾的硫化鉍納米材料制備示意圖；

圖2：(a)DTPA，(b)DTPAA，(c)DTPA-OA的FTIR圖譜；

圖3：Bi₂S₃-Gd納米材料的粒徑圖；

圖4：不同濃度的Bi₂S₃-Gd水溶液的紫外吸收光譜(各曲線代表的濃度按照圖示箭頭的方向依次下降)；

圖5：不同濃度Bi₂S₃-Gd水溶液在808nm激光照射下的溫度-時間圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明。但本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。另外，實施例中未注明具體技術操作步驟或條件者，均按照本領域內(nèi)的文獻所描述的常規(guī)技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

(1)硫化鉍納米材料的制備：

①量取油酸(13.33mL)和十八碳烯(26.67mL)于燒瓶中，在劇烈攪拌的條件下，將新癸酸鉍(2.096mL)加至燒瓶中；

②在N₂保護下，將該混合物加熱至165℃，保持20分鐘后再冷卻至105℃；

③將含有硫代乙酰胺(0.25g)的油胺溶液(2.33mL)在劇烈攪拌下注入上述混合物。注射后溶液變成深褐色，反應在該溫度下持續(xù)5分鐘，在整個反應過程中要在燒瓶中通過溢流N2保護，以獲得最好的結果；

④冷卻至室溫后，加入乙醇溶液，洗滌兩次后離心，獲得納米材料,將所制備的硫化鉍納米材料(300mg)分散到200mL二氯甲烷中；

(2)二乙三胺五乙酸雙環(huán)酐的制備：

①將二乙三胺五乙酸(0.5334g)加入到70℃下含有DMF(15mL)和油胺(0.485mL)的溶液中，該溫度下攪拌4小時；

②待溶液降至室溫后，棄去上清液，加入乙醇后，抽濾，干燥洗滌3次即可得到二乙三胺五乙酸雙環(huán)酐；

(3)Gd-DTPA-OA配體的制備：

向去離子水(19mL)中加入二乙三胺五乙酸雙環(huán)酐(0.0137g)和NaOH(0.1mol/L,0.83mL)?；旌弦撼?h，然后用HCl調(diào)節(jié)pH為6.91(6-7)。放置一晚后pH變?yōu)?.64。然后，以摩爾比為1.06的比例加入GdCl₃·6H₂O的水溶液中(25mmol/L,0.650mL)。調(diào)pH為6.47(6-7)?；旌弦豪^續(xù)攪拌12h；

(4)Bi₂S₃-Gd納米材料的制備：

取硫化鉍二氯甲烷體系溶液10mL，取0.1ml溶液，稀釋至1ml，然后超聲助溶，以3000r/min離心5min后，取上清液為淡黃色液體，將上清液加入至GdL溶液中超聲震蕩。

(5)材料的表征和性能測試：

①傅里葉變換紅外光譜測試：分別取0.5mg的DTPA，DTPAA和DTPA-OA配體材料，壓片放入Bruker Vertex 70光譜儀中檢測紅外圖譜；

②動態(tài)光散射檢測粒徑:分別取2ml釓修飾的硫化鉍納米材料，在Nanosizer Nano-ZS馬爾文公司納米粒度分析儀上檢測粒徑；

③紫外吸收測試：取兩份超純水放入樣品池對紫外分光光度計進行標定(紫外分光光度計的掃描波長范圍為500nm-1000nm)。取出樣品池用超純水清洗后加入制備好的4種不同濃度的Bi₂S₃-Gd水溶液。在CARY 500紫外-可見-近紅外光譜儀進行波長掃(不同樣品用不同樣品池)。

④光熱轉換性能測試:在規(guī)格為2W 808nm的激光光源的照射下，于固定時間內(nèi)在室溫下對不同濃度相同體積的Bi₂S₃-Gd水溶液進行溫度測量。平均每10s對放入Bi₂S₃-Gd水溶液的熱電耦溫度計進行讀數(shù)并記錄，Bi₂S₃-Gd水溶液與超純水的初始溫度統(tǒng)一控制為26℃。

為了考察是否成功地制備了DTPA-OA配體，我們借助傅里葉變換紅外光譜進行分析。如圖2顯示，對于DTPAA來說，在1820和1774cm^-1處可以觀察到兩個尖而強的峰。這來自于酸酐中C＝O的伸縮振動。作為對照，DTPA-OA配體的紅外光譜，表現(xiàn)出了一系列的酰胺特征吸收峰。比如，位于3283cm^-1處的N–H伸縮振動峰；位于3070cm^-1處的N–H彎曲振動峰；位于1690cm^-1處的來自–CO–NH–基團的C＝O伸縮振動峰；以及C–N伸縮振動與N–H彎曲振動重疊而形成的位于1309cm^-1處的吸收峰。此外，由于–HC＝CH–基團而出現(xiàn)的位于1655cm^-l的C–H伸縮振動峰，以及位于2924cm^-1和2851cm^-1的兩個來自于烷基鏈中CH₂的伸縮振動的強吸收峰，進一步證實了我們已經(jīng)成功地得到了DTPA-OA配體。

接下來考察Bi₂S₃-Gd納米材料的粒徑大小，由圖3可知，Bi₂S₃-Gd納米材料，粒徑大小均一，粒徑大小為211nm左右，分散性好，而且粒徑的大小很符合實驗的需求。對Bi₂S₃修飾做了進一步的改進，選擇DTPA-OA作為修飾配體，通過疏水-疏水相互作用包覆在Bi₂S₃納米點表面。如圖3所示，Bi₂S₃-Gd納米材料沒有明顯的聚集現(xiàn)象，仍然保持良好的分散性。

然后，為了考察Bi₂S₃-Gd納米材料的紫外吸收,我們用CARY 500紫外-可見-近紅外光譜儀對不同濃度的Bi₂S₃-Gd水溶液進行紫外吸收，圖4表明制備的Bi₂S₃-Gd水溶液在我們進行紫外掃描吸收波峰的數(shù)據(jù)中沒有任何吸收波峰的出現(xiàn)。本實驗中紫外吸收波峰掃描的波長范圍為500nm-1000nm，在此范圍內(nèi)我們發(fā)現(xiàn)硫化鉍納米材料在近紅外區(qū)具有很強的吸收，并且隨著濃度的增加，在808nm處的紫外吸收值呈現(xiàn)線性增加的趨勢。近紅外區(qū)的吸收預示著它們可以應用于光熱治療。

為了探索Bi₂S₃-Gd納米材料在光熱治療方面的可行性，我們考察了它們的光熱轉換性能。我們分別將62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml的Bi₂S₃-Gd納米材料水溶液用808nm激光器照射，記錄溶液的溫度變化，結果顯示在圖5中。很明顯，純水溶液在激光照射下溫度沒有明顯的變化。相反，當給予激光照射后，Bi₂S₃-Gd納米材料水溶液的溫度快速升高，并且隨著Bi₂S₃-Gd納米材料濃度的增加，溶液溫度變化會更加明顯。造成這種結果的原因是，隨著濃度的增加，Bi₂S₃-Gd納米材料在808nm處的光吸收值變強，從而導致其光熱轉換能力增強。通過光熱轉化實驗，我們得出Bi₂S₃-Gd納米材料具有良好的光熱轉換能力，并且濃度越高，光熱轉換能力越好。

綜上，本發(fā)明采用已被臨床應用的T1造影劑Gd-DTPA和具有潛在應用價值的CT造影劑硫化鉍納米材料，首先制備油酸、油胺保護的硫化鉍納米材料；接下來合成一種一端可以與釓螯合，另一端為長鏈烷基鏈的兩親性的配體；最后，該配體與油相的硫化鉍通過親水疏水作用力結合在一起得到了釓修飾的硫化鉍納米材料。實驗結果證實，我們通過在硫化鉍納米材料表面修飾釓螯合物，從而賦予該材料MRI和CT雙模式成像指導的光熱治療效果，這為發(fā)展多功能納米診療劑提供了一個良好的平臺。