本發(fā)明涉及一種口蹄疫病毒樣顆粒(vlps)的新用途，特別涉及口蹄疫病毒樣顆粒在作為重組質(zhì)粒運(yùn)載載體中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

dna疫苗是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型疫苗，它是一種表達(dá)某種抗原基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成、加工、遞呈的過(guò)程與完整病毒很相似，能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)和保護(hù)力，而且比傳統(tǒng)疫苗具有安全、穩(wěn)定、更容易構(gòu)建和生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。因此，目前dna疫苗已經(jīng)成為國(guó)際疫苗研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，并己在人和動(dòng)物的多種傳染病、寄生蟲病以及腫瘤治療等方面取得進(jìn)展。實(shí)現(xiàn)dna疫苗有效免疫的前提條件之一是能夠?qū)⒅亟M質(zhì)粒dna運(yùn)載到細(xì)胞內(nèi)，目前作為質(zhì)粒dna的載體有病毒載體及非病毒載體，前者包括腺病毒、痘病毒等，后者主要包括多聚物，如鮭魚精蛋白、多溶素、peg、pla、多聚糖以及以惰性基質(zhì)材料為主的無(wú)機(jī)納米顆粒。但由于這些載體或多或少存在缺陷，其優(yōu)化還在進(jìn)行中，為了尋找更有效、更具生物相容性的質(zhì)粒dna載體，近年來(lái)出現(xiàn)的病毒樣顆粒(vlps)引起了研究者的關(guān)注。vlps是一類形態(tài)結(jié)構(gòu)與自然病毒粒子相似的生物形式，主要由病毒的單個(gè)或多個(gè)衣殼蛋白構(gòu)成。由于其不攜帶病毒遺傳物質(zhì)，不具有感染性；它作為納米級(jí)生物載體，有較大的體表面積，可承載大量外源物質(zhì)；具有比合成材料更優(yōu)越的生物相容性，幾乎對(duì)生物組織沒有毒性，且容易降解。因此，目前vlps在呈遞藥物和運(yùn)載外源小分子等方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明初次嘗試將口蹄疫病毒vlps作為質(zhì)粒dna載體進(jìn)行應(yīng)用，并進(jìn)行了一系列驗(yàn)證和條件摸索，證實(shí)口蹄疫病毒vlps能成功運(yùn)載外源質(zhì)粒dna，這為口蹄疫病毒vlps作為疫苗應(yīng)用之外，進(jìn)一步擴(kuò)展了其生物應(yīng)用范圍，也為dna疫苗的成功應(yīng)用，提供了新的優(yōu)勢(shì)載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了有效運(yùn)載質(zhì)粒dna，尋找更具生物安全性和生物相容性的載體，本發(fā)明充分利用vlps的優(yōu)勢(shì)，嘗試以口蹄疫病毒vlps作為質(zhì)粒dna運(yùn)載載體，通過(guò)體外、細(xì)胞內(nèi)、動(dòng)物體內(nèi)的試驗(yàn)驗(yàn)證，確定了口蹄疫病毒vlps能夠成功運(yùn)載質(zhì)粒dna，為dna免疫提供了新的載體選擇。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明利用口蹄疫病毒vlps承載質(zhì)粒dna，通過(guò)體外復(fù)合物的穩(wěn)定性研究、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒dna的釋放觀察以及動(dòng)物體內(nèi)特異免疫反應(yīng)的檢測(cè)等，證實(shí)口蹄疫病毒vlps能夠有效承載質(zhì)粒dna，并實(shí)現(xiàn)外源質(zhì)粒dna的生物功能。

在上述研究的基礎(chǔ)上，一方面，本發(fā)明提出了口蹄疫病毒樣顆粒(vlps)在制備重組質(zhì)粒運(yùn)載載體中的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的重組質(zhì)粒為dna疫苗。

另一方面，本發(fā)明還提出了一種口蹄疫病毒vlps/dna疫苗復(fù)合物，所述的dna疫苗以o型口蹄疫vlps作為載體，所述的o型口蹄疫vlps內(nèi)包被有含有asia1型口蹄疫病毒編碼基因的重組質(zhì)粒，所述的含有asia1型口蹄疫病毒編碼基因的重組質(zhì)粒是將asia1型口蹄疫病毒的p1-2a和3c片段串聯(lián)構(gòu)建到真核表達(dá)載體上得到的。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的o型口蹄疫vlps由o型口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白vp0、vp3和vp1組裝而成，其中vp1的基因序列為seqidno.1所示，vp3的基因序列為seqidno.2所示，vp0的基因序列為seqidno.3所示。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的asia1型口蹄疫病毒毒株為asia1/jiangsu/china/2005，所述的真核表達(dá)載體為pcdna3.1(+)。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的重組質(zhì)粒的核苷酸序列如seqidno.4所示。

再一方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建所述的口蹄疫病毒vlpss/dna疫苗復(fù)合物的方法，包括以下步驟：

(1)小泛素樣修飾蛋白融合表達(dá)載體psma以及psmk的構(gòu)建：

a.以釀酒酵母基因組dna為模板，以smt3f與smt3r為引物擴(kuò)增smt3基因，引物序列如下：

smt3f：5’gccatgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaa3’，

smt3r：5’ggatccgagaccttaaggtctcaacctccaatctgttcgcggtg3’，

b.經(jīng)ncoi和bamhi雙酶切后將smt3基因插入到用同樣內(nèi)切酶處理的pet-28a載體中，所得載體為psmk，將psmk的卡那霉素抗性基因替換為氨芐青霉素抗性基因，得載體psma；

(2)口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)已公布的genbank登陸號(hào)為jn998085.1的o型口蹄疫病毒的序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成結(jié)構(gòu)蛋白基因vp0，vp3和vp1；以合成的基因?yàn)槟０?，以下引物?duì)分別擴(kuò)增vp0，vp3和vp1基因片段：

vp1f：5’ggtctctaggtaccaccagcacgggcgaa3’

vp1r：5’cgcggatcctcacagactttgtttgaccgg3’

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vp3r：5’cgcggatcctcattgctgacgggcatcaacc3’

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法，分別用引物vp1f/vp1r、vp3f/vp3r和vp0f/vp0r擴(kuò)增獲得vp1、vp3和vp0基因；擴(kuò)增得到的vp1、vp3和vp0基因片段分別經(jīng)bsmbi/bamhi雙酶切后分別插入經(jīng)bsai酶切處理的psmk和psma，所構(gòu)建重組表達(dá)載體分別命名為psmk/vp0，psmk/vp1和psma/vp3，以psmk/vp1為模板，以t7bamhi/vp1xhoi為引物擴(kuò)增獲得含t7啟動(dòng)子等原核表達(dá)元件和vp1基因的dna片段，經(jīng)bamhi/xhoi雙酶切后插入用同樣酶切處理的psmk/vp0中，所得雙表達(dá)重組載體命名為psmk/vp0-vp1；所述t7bamhi/vp1xhoi引物序列為：

t7bamhi：5’gcaattggatcccgtccggcgtagaggatcga3’

vp1xhoi：5’gcgcacctcgagtcacagagtctgtttctcagg3’

(3)衣殼蛋白的表達(dá)及純化

將表達(dá)載體psma/vp3和psmk/vp0-vp1共轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌bl21(de3)，用卡那霉素和氨芐青霉素篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化；

(4)含有asia1型口蹄疫病毒編碼基因的重組質(zhì)粒pcdna3.1/p12a3c的構(gòu)建

根據(jù)已公布的genbank登陸號(hào)為ef149009的asia1型口蹄疫病毒的序列，分別設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)的p1-2a和3c引物，以asia1型口蹄疫病毒的基因組為模板，分別擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)kpni和ecori的p1-2a片段和含酶切位點(diǎn)ecori和xhoi的3c片段，先用kpni/ecori雙酶切p1-2a片段和pcdna3.1(+)載體，連接構(gòu)建重組載體pcdna3.1/p1-2a，再用ecori/xhoi雙酶切3c片段和pcdna3.1/p1-2a重組載體，連接轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒，命名為pcdna3.1/p12a3c，擴(kuò)增p1-2a和3c所用引物序列如下：

p12akpni：5’atgggtaccatgggagccgggcaatccagtccggcga3’

p12aecori：5’acggaattcgtttgacctgacatcagagaagaag3’

3cecori：5’acggaattcgtgaagaagcctgtcgctttgaa3’

3cxhoi：5’agcctcgagctactcgtggtgtggttcggggtcgat3’

經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序正確后，提取質(zhì)粒備用；

(5)vlps-質(zhì)粒復(fù)合物的包裝

將純化得到的o型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白和攜帶asia1型衣殼編碼基因p1-2a和非結(jié)構(gòu)蛋白3c基因的質(zhì)粒pcdna3.1/p12a3c加入透析袋中，同時(shí)加入小泛素樣修飾蛋白酶，并置于含有500mmnacl，ph8.0的20mmtris-hcl組裝緩沖液中，在4℃組裝過(guò)夜，得到vlps-質(zhì)粒復(fù)合物，即為所述的口蹄疫病毒vlps/dna疫苗復(fù)合物。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，擴(kuò)增得到的vp1、vp3和vp0基因片段的核苷酸序列分別如seqidno.1-3所示。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，構(gòu)建得到的asia1型口蹄疫病毒重組質(zhì)粒pcdna3.1/p12a3c的核苷酸序列如seqidno.4所示。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，o型口蹄疫病毒樣顆粒和攜帶asiai型衣殼編碼基因p1-2a和非結(jié)構(gòu)蛋白3c基因的質(zhì)粒pcdna3.1/p12a3c是按照10:2(w/w)的比例加入透析袋中。

最后，本發(fā)明還提出了所述的口蹄疫病毒vlps/dna疫苗復(fù)合物在制備口蹄疫疫苗中的用途。

本發(fā)明嘗試將口蹄疫病毒vlps作為質(zhì)粒載體，應(yīng)用其潛在的運(yùn)載能力和控釋特性，試圖將質(zhì)粒dna成功運(yùn)載并能在動(dòng)物體內(nèi)釋放，最終刺激機(jī)體產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答反應(yīng)。結(jié)果顯示，vlps可以運(yùn)載質(zhì)粒dna進(jìn)入細(xì)胞并有效釋放，在注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)后，能夠有效釋放承載的外源dna，最終誘導(dǎo)特異的抗體免疫反應(yīng)和顯著的t-淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。這些結(jié)果表明，vlps可以作為載體運(yùn)載質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞并成功釋放，且能在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng)。本發(fā)明為擴(kuò)展vlps的生物學(xué)應(yīng)用進(jìn)行了一次新的嘗試和創(chuàng)新。

附圖說(shuō)明

圖1為融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化；

注：泳道1：marker，泳道2-6：純化的目的蛋白

圖2為體外組裝的口蹄疫vlps電鏡觀察結(jié)果；

圖3為口蹄疫vlps包被質(zhì)粒后電泳圖；

a、b:vlps-質(zhì)粒c:質(zhì)粒

圖4為口蹄疫vlps包被質(zhì)粒后dnasei酶解；

泳道1、3:質(zhì)粒；泳道2:質(zhì)粒+dnasei；泳道4：vlps/質(zhì)粒；泳道5：vlps/質(zhì)粒+dnasei；

圖5為vlps/質(zhì)粒復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞并釋放質(zhì)粒；

fitc標(biāo)記的口蹄疫vlps發(fā)出綠色熒光；popo-3標(biāo)記的質(zhì)粒發(fā)出紅色熒光；dapi染色的細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光；

圖6為豚鼠血清抗體效價(jià)的elisa檢測(cè)結(jié)果；

圖7為t淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建

1、小泛素樣修飾蛋白融合表達(dá)載體psma的構(gòu)建：

a.以釀酒酵母基因組dna為模板，以smt3f與smt3r為引物擴(kuò)增smt3基因，引物序列如下：

上游引物smt3f：5’gccatgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaa3’，

下游引物smt3r：5’ggatccgagaccttaaggtctcaacctccaatctgttcgcggtg3’，

b.經(jīng)ncoi和bamhi雙酶切后將smt3基因插入到用同樣內(nèi)切酶處理的pet-28a載體中，所得載體為psmk，將psmk的卡那霉素抗性基因替換為氨芐青霉素抗性基因，得載體psma。

2、口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)已公布的o型口蹄疫病毒的序列(genbank登陸號(hào)：jn998085.1)，參考hoover等的方法(hooverdm1,lubkowskij.dnaworks:anautomatedmethodfordesigningoligonucleotidesforpcr-basedgenesynthesis.nucl.acidsres.(2002)30(10):e43.)進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成結(jié)構(gòu)蛋白基因vp0，vp3和vp1。

以合成的基因?yàn)槟０澹韵乱飳?duì)分別擴(kuò)增vp0，vp3和vp1基因片段：

vp1f：5’ggtctctaggtaccaccagcacgggcgaa3’

vp1r：5’cgcggatcctcacagactttgtttgaccgg3’

vp0f：5’ggtctctaggtggtgcgggccagtcatctcc3’

vp0r：5’cgcggatcctcattctttactcggaaattc3’

vp3f：5’ggtctctaggtggtatcttcccggtggcgtg3’

vp3r：5’cgcggatcctcattgctgacgggcatcaacc3’

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法，分別用引物vp1f/vp1r、vp3f/vp3r和vp0f/vp0r擴(kuò)增獲得vp1、vp3和vp0基因，擴(kuò)增得到的vp1、vp3和vp0基因片段分別如seqidno.1-3所示。擴(kuò)增得到的vp1、vp3和vp0基因片段分別經(jīng)bsmbi/bamhi雙酶切后插入經(jīng)bsai酶切處理的psmk或psma，所構(gòu)建重組表達(dá)載體分別命名為psmk/vp0，psmk/vp1和psma/vp3。以psmk/vp1為模板，以t7bamhi/vp1xhoi為引物擴(kuò)增獲得含t7啟動(dòng)子等原核表達(dá)元件和vp1基因的dna片段，經(jīng)bamhi/xhoi雙酶切后插入用同樣酶切處理的psmk/vp0中，所得雙表達(dá)重組載體命名為psmk/vp0-vp1。所述t7bamhi/vp1xhoi引物序列為：

t7bamhi：5’gcaattggatcccgtccggcgtagaggatcga3’

vp1xhoi：5’gcgcacctcgagtcacagagtctgtttctcagg3’

3、衣殼蛋白的表達(dá)及純化

將表達(dá)載體psma/vp3和psmk/vp0-vp1共轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌bl21(de3)。用卡那霉素和氨芐青霉素篩選陽(yáng)性克隆。挑選陽(yáng)性克隆菌于雙抗性lb培養(yǎng)基中37℃220rpm過(guò)夜培養(yǎng)。將上述菌液以1:100接種lb培養(yǎng)基，于37℃、220rpm培養(yǎng)至菌液的od600達(dá)0.6左右，以終濃度為1mmiptg、25℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)，隨后以5000rpm、30min離心收集菌體沉淀，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

用10-20ml冰浴的緩沖液a(20mmtris-hcl，500mmnacl，20mmimidazol，ph＝8.4)重懸細(xì)菌沉淀，超聲破碎菌體細(xì)胞(超聲時(shí)間3s，間隔時(shí)間3s，共8min，功率200w)。12,000×g離心30min，取上清，棄沉淀，上清與ni-ntahis·bindresins混勻，4℃結(jié)合1h左右。用緩沖液a洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白，用緩沖液b(20mmtris-hcl，500mmnacl，300mmimidazol，ph＝8.4)洗脫目的蛋白，-70℃保存。sds-page和免疫印記(westernblot)檢測(cè)結(jié)果顯示獲得了預(yù)期大小的蛋白質(zhì)(如圖1)。

4、口蹄疫病毒樣顆粒體外組裝

參照invitrogn的試劑使用說(shuō)明，用小泛素化修飾蛋白酶酶切融合蛋白，按照如下方法和比例進(jìn)行：20μg上述純化的融合蛋白，200μl酶切緩沖液(50mmtris-hcl，150mmnacl，ph8.0,0.2％igepal(np-40)，1mmdtt)，10μl小泛素化修飾蛋白酶(1u/μl)，37℃酶切30min或4℃過(guò)夜。將酶切混合物通過(guò)histraphp除去小泛素化修飾標(biāo)簽蛋白，收集含有vp0、vp1和vp3的流穿液在組裝緩沖液(20mmtris-hcl，500mmnacl，ph8.0)中，4℃過(guò)夜組裝vlps。

過(guò)夜組裝的vlps經(jīng)截留分子量100kd的超濾管濃縮后，透射電鏡觀察：將10μl含vlps的濃縮液加到200目的銅網(wǎng)上，室溫吸附2-3min，用濾紙吸干銅網(wǎng)上剩余的液體后用3％的磷鎢酸染色，用hitachi,h-7100fa透射電鏡觀察，組裝的vlps電鏡觀察，如圖2所示，在此條件下組裝的病毒樣顆粒直徑主要分布在20-30nm之間。

實(shí)施例2含有asia1型口蹄疫病毒編碼基因的重組質(zhì)粒pcdna3.1/p12a3c的構(gòu)建

1、pcdna3.1/p12a3c的構(gòu)建

根據(jù)已公布的genbank登陸號(hào)為ef149009的asia1型口蹄疫病毒的序列，分別設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)的p1-2a和3c引物，以asia1型口蹄疫病毒的基因組為模板，分別擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)kpni和ecori的p1-2a片段和含酶切位點(diǎn)ecori和xhoi的3c片段，先用kpni/ecori雙酶切p1-2a片段和pcdna3.1(+)載體，連接構(gòu)建重組載體pcdna3.1/p1-2a，再用ecori/xhoi雙酶切3c片段和pcdna3.1/p1-2a重組載體，連接轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒，命名為pcdna3.1/p12a3c。

擴(kuò)增p1-2a和3c所用引物序列如下：

p12akpni：5’atgggtaccatgggagccgggcaatccagtccggcga3’

p12aecori：5’acggaattcgtttgacctgacatcagagaagaag3’

3cecori：5’acggaattcgtgaagaagcctgtcgctttgaa3’

3cxhoi：5’agcctcgagctactcgtggtgtggttcggggtcgat3’

經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序正確后，提取質(zhì)粒備用，pcdna3.1/p12a3c測(cè)序結(jié)果如seqidno.4所示。

2、vlps包被質(zhì)粒及對(duì)質(zhì)粒的保護(hù)作用

將實(shí)施例1制備得到的o型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白和攜帶asiai型衣殼編碼基因p1-2a和非結(jié)構(gòu)蛋白3c基因的質(zhì)粒pcdna3.1/p12a3c按10:2(w/w)比例加入透析袋中，同時(shí)參照invitrogn的試劑使用說(shuō)明，加入小泛素化修飾蛋白酶，并置于含有500mmnacl，ph8.0的20mmtris-hcl組裝緩沖液中，在4℃組裝過(guò)夜，對(duì)組裝后的vlps-質(zhì)粒復(fù)合物進(jìn)行核酸電泳，檢測(cè)質(zhì)粒是否能夠被vlps包被進(jìn)去。結(jié)果表明，vlps包被質(zhì)粒后由于分子量變大電泳條帶出現(xiàn)滯后現(xiàn)象，說(shuō)明質(zhì)粒被vlps包被，形成了vlps-質(zhì)粒復(fù)合物(圖3)。用dnasei分別酶解質(zhì)粒和vlps-質(zhì)粒復(fù)合物。結(jié)果表明，質(zhì)粒被dnasei降解，而vlps-質(zhì)粒復(fù)合物沒有被降解，說(shuō)明vlps包被質(zhì)粒后對(duì)質(zhì)粒有保護(hù)作用(圖4)。

3、vlps運(yùn)載質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞并釋放

先用popo-3染色液加入質(zhì)粒混勻后在室溫孵育一小時(shí)，根據(jù)上述方法用vlps將質(zhì)粒包被形成vlps-質(zhì)粒復(fù)合物，將vlps/質(zhì)粒復(fù)合物加入bhk-21細(xì)胞中在37℃孵育1h，棄去培養(yǎng)液，用pbs洗三遍，加入多聚甲醛固定細(xì)胞20min，用pbs洗三遍，加入0.1％tritonx-100室溫作用15min，用pbs洗三遍，加入5％nbs封閉15min，然后細(xì)胞中加入o豬血清(1:200稀釋)在37℃孵育1h，用pbs洗5遍，接著在細(xì)胞中加入fitc標(biāo)記的山羊抗豬二抗(1：200稀釋)，用pbs洗5遍，用dapi對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，最后在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，在vlps-質(zhì)粒復(fù)合物作用細(xì)胞1h后，細(xì)胞周圍出現(xiàn)綠色熒光并且細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)紅色的熒光，說(shuō)明o型口蹄疫vlps包被asia1型口蹄疫病毒重組質(zhì)粒后可以攜帶質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞，并將質(zhì)粒釋放到細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果如圖5所示。

實(shí)施例3vlps-質(zhì)粒復(fù)合物的免疫效力實(shí)驗(yàn)

1、抗體效價(jià)的elisa檢測(cè)

將32只4周齡的豚鼠分為4組，第一組用pbs免疫作為對(duì)照，第二組用質(zhì)粒pcdna3.1/p12a3c免疫，第三組用實(shí)施例2制備得到的口蹄疫病毒vlps-質(zhì)粒復(fù)合物進(jìn)行免疫。分別在免疫前和免疫后第一周開始每周對(duì)各組豚鼠進(jìn)行采血。在第一次免疫后檢測(cè)到抗體水平下降時(shí)對(duì)豚鼠進(jìn)行二次免疫。分別對(duì)第一次免疫后第4周和第二次免疫后第3周每組各隨機(jī)取1只豚鼠處死，無(wú)菌條件下取其脾臟分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

將96孔板(nuncmaxisorp)以滅活的asia1型fmdv細(xì)胞毒為包被抗原(1:10稀釋)。pbst清洗3次，96孔板用含5％脫脂奶粉的pbst(150μl)37℃封閉1h。pbst清洗3遍后，待檢豚鼠血清及陽(yáng)性陰性血清分別用含1％脫脂奶粉pbst按1:100稀釋后，每孔100μl加于封閉孔板中，于37℃孵育1h。pbst清洗3次后，hrp標(biāo)記的二抗(兔抗豚鼠igg，sigma)用含1％脫脂牛奶的pbst按1:20000稀釋并每孔100μl加于封閉孔板中，于37℃孵育1h。pbst清洗3次后，50μl底物溶液(opd,sigma)加于各孔中于37℃孵育15min。然后用50μl2nh2so4加于各孔終止顏色反應(yīng)，于490nm檢測(cè)光密度(od值)。結(jié)果顯示，和用pbs對(duì)照組豚鼠相比，質(zhì)粒和vlps-質(zhì)粒復(fù)合物免疫組的豚鼠血清抗體水平持續(xù)升高，免疫后第三周達(dá)到了最高峰，并且vlps-質(zhì)粒復(fù)合物免疫組的抗體水平比質(zhì)粒單獨(dú)免疫組的水平高，抗體水平在第四周下降。而第二次免疫后，質(zhì)粒免疫組抗體水平?jīng)]有上升，vlps-質(zhì)粒復(fù)合物免疫組的抗體水平持續(xù)上升并保持很高的水平。這說(shuō)明口蹄疫病毒vlps對(duì)質(zhì)粒有保護(hù)和緩釋作用，并且口蹄疫病毒vlps能夠進(jìn)一步增強(qiáng)質(zhì)粒的免疫效果，使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生更高水平的特異抗體(圖6)。

2、t-淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

分別在第一次免疫后第4周和第二次免疫后第3周各組隨機(jī)收取1只豚鼠將其處死，然后放入酒精中浸泡5min消毒，無(wú)菌取脾，加入1ml無(wú)血清rpmi1640培養(yǎng)液于200目銅網(wǎng)上研磨，用無(wú)血清rpmi1640培養(yǎng)液沖洗銅網(wǎng)，將研磨獲得的脾細(xì)胞懸液加入裝有2ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，4℃2500r/min離心10min，用長(zhǎng)針頭吸出淋巴細(xì)胞層放入新離心管中，用無(wú)ca²⁺、mg²⁺hanks液洗兩次并以rpmi1640培養(yǎng)液混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以含10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)液稀釋成10⁷個(gè)/ml濃度。將稀釋好的淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞板中(100μl/孔)，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每孔加入終濃度為40μg/ml的cona特異性刺激物，同時(shí)以不加刺激物的淋巴細(xì)胞為對(duì)照，培養(yǎng)板在含5％co2的37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，加入20μlmts試劑，于37℃培養(yǎng)4h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm的光密度值。計(jì)算刺激指數(shù)(stimulationindex,si)。si＝(cona刺激孔的平均od490－未刺激組的平均od490)/(未刺激組的平均od490－空白1640培養(yǎng)液組的平均od490)。結(jié)果顯示，質(zhì)粒和vlps-質(zhì)粒復(fù)合物免疫組豚鼠的淋巴細(xì)胞經(jīng)cona刺激劑刺激后，t-淋巴細(xì)胞的增值效果高于pbs對(duì)照組。t-淋巴細(xì)胞增殖效果為：vlps-質(zhì)粒復(fù)合物免疫組﹥質(zhì)粒免疫組，這說(shuō)明口蹄疫病毒vlps可作為疫苗載體，運(yùn)載質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生比單獨(dú)質(zhì)粒更強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答(圖7)。

序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

<120>口蹄疫病毒樣顆粒在作為重組質(zhì)粒載體中的應(yīng)用

<130>klpi160938

<160>4

<170>patentin3.5

<210>1

<211>639

<212>dna

<213>vp1

<400>1

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<210>4

<211>3314

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<213>pcdna3.1-p1-2a/3c

<400>4

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