本發(fā)明涉及一種鴉膽子油乳、制備方法及應(yīng)用，屬于中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴉膽子是苦木科鴉膽子屬植物Bruceajavanica(L.)Merr的成熟果實(shí)，又名老鴉膽，苦參子等，其味苦、性寒，有小毒，歸大腸、肝經(jīng)。鴉膽子具有清熱解毒、截瘧、止痢、腐蝕贅疵的功效。用于治療熱性赤痢或便血、瘧疾、雞眼等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明鴉膽子中含有大量的苦木內(nèi)酯類化合物，這類化合物具有抗瘧疾、抗阿米巴痢疾、拒食素、殺蟲劑、抗炎和抗癌等生物活性。鴉膽子油主要存在于鴉膽子仁中，由鴉膽子成熟過程中的糖類轉(zhuǎn)化而成。鴉膽子含油量約為20％，其主要由油酸、亞油酸、硬脂酸和棕櫚酸等組成。鴉膽子油在臨床上主要用于輔助治療癌癥，對(duì)多種腫瘤均有較好的療效，如肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、食道癌等。
目前，鴉膽子油作為注射液的主要?jiǎng)┬蜑轼f膽子油乳劑，其輔料主要為豆磷脂和甘油，其中豆磷脂的豆磷脂的價(jià)格高，且使用量較大，且該劑型的主要抗腫瘤有效成分為鴉膽子油，輔料的作用僅為保持劑型穩(wěn)定性，對(duì)治療作用無貢獻(xiàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的即是針對(duì)上述問題，通過改變輔料的種類和用量，設(shè)計(jì)了一種新型的鴉膽子油乳，該劑型選用的輔料價(jià)格低，輔料使用量小，且新劑型的抗腫瘤效果更好。
本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容一為一種鴉膽子油乳，其組成為：鴉膽子油0.5ml、吐溫-800.12ml、甘油0.125ml、余量為無菌水補(bǔ)足至5ml。
本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容二為一種制備鴉膽子油乳的方法，具體步驟如下：
鴉膽子油0.5ml中加入吐溫-800.12ml、甘油0.125mL，攪拌均勻后，再逐漸加入無菌水至5mL，攪拌均勻經(jīng)過濾后分裝于10mL離心管中，封口。
待用時(shí)經(jīng)微孔濾膜滅菌即得10％鴉膽子油(mL/mL：1mL藥液溶于1mL無菌蒸餾水中)油乳劑成品。
本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容三為鴉膽子油乳在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
所述的抗腫瘤藥物，是指抑制原癌基因ras通路過度激活的抗腫瘤藥物。
有益效果
通過體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)檢測，本發(fā)明中的鴉膽子油乳，其抗腫瘤效果優(yōu)于目前市場上常用的鴉膽子油乳注射劑，吐溫-80的用量極低，符合注射劑中關(guān)于吐溫-80用量的要求，保證了本發(fā)明中鴉膽子油乳的高效、安全、低價(jià)，有極大的應(yīng)用開發(fā)前景。
具體實(shí)施方式
1儀器、試劑及實(shí)驗(yàn)材料
1.1主要儀器
XYJ80-2電動(dòng)離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠)、THZ-80氣浴恒溫振蕩器(金壇市恒豐儀器廠)、GR60DR型高溫滅菌鍋(致微儀器有限公司)、B2生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)、SY-2OOO型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器有限公司)、倒置生物顯微鏡(重慶光電儀器總公司)、CHZQF(60A)型氣浴恒溫?fù)u床、DZF-6020MBE型真空干燥箱、分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。
1.2實(shí)驗(yàn)試劑
石油醚(30％～60％)(天津市百世化工有限公司)、無水乙醇(分析純)(天津市百世化工有限公司)、吐溫-80(天津市光復(fù)精細(xì)化研究所)、丙三醇(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司)、磷酸二氫鉀(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)、磷酸氫二鈉(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司)、磷酸氫二鉀(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司)
1.3實(shí)驗(yàn)材料：
新鮮鴉膽子(2016年3月購于黃河藥材市場，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王明偉鑒定為正品)；秀麗隱桿線蟲：MT2124，基因型：Let-60(n1046sd，gf)IV，由Howard Hughes MedicaL Institute惠贈(zèng)；大腸桿菌：E.coiL OP50，尿嘧啶滲漏突變株，作為秀麗隱桿線蟲的食物，購于CGC(Caenorhabditis Genetics Center)。
M9緩沖液：每升緩沖液中含15g Na2HPO4·12H2O，3g KH2PO4，5g NaCl，0.25g MgSO4·7H2O。
實(shí)施例1鴉膽子油的制備
根據(jù)鴉膽子提取物主要成分油酸為油性物質(zhì)，一般采用有機(jī)溶劑提取法提取，常用的溶劑主要是石油醚。將鴉膽子原料嚴(yán)格挑選，由于鴉膽子果皮堅(jiān)硬而致密，而其脂肪油含于鴉膽子仁中，提取前需將鴉膽子果皮及種子破碎。精密稱取500g，置于浸藥鍋內(nèi)，以1:6(Kg/L,其中“1”為鴉膽子粉末重量Kg，“6”為溶劑體積L)的溶劑體積比例加入3000mL石油醚，在室溫下進(jìn)行密封浸泡24h，期間需定期攪拌以利于有效成分充分溶解，然后進(jìn)行真空抽濾得到濾液和濾渣，濾液備用，濾渣再加入原溶劑(石油醚)同體積3000mL，浸泡24h，抽濾，合并2次濾液，并分別回收溶劑得棕色的油狀物，即為鴉膽子油，稱重，并將其放置于-18℃冰箱中保存。通過提取，共獲得鴉膽子油提取46.25g，鴉膽子油含量為9.25％，提取物顏色為棕色澄明。
實(shí)施例2鴉膽子油乳的制備
鴉膽子油為棕黃色、澄明的油狀物液體，易溶于氯仿、乙醚，微溶于乙醇，不溶于水，其主要成份為油酸，臨床制成鴉膽子油乳劑(為水包油型O/W乳劑)，乳劑粒為1μm左右，成品外觀呈乳白色的均勻乳狀液體。根據(jù)文獻(xiàn)及經(jīng)過篩選得到鴉膽子油乳處方鴉膽子油0.5mL，吐溫-800.12mL，甘油0.125mL，無菌蒸餾水加至5mL。具體制法：鴉膽子油0.5mL加入吐溫-800.12mL，甘油0.125mL，攪拌均勻后，再逐漸加入注射水至5mL，攪拌均勻經(jīng)過濾后分裝于10mL離心管中，封口，待用時(shí)經(jīng)微孔濾膜滅菌即得10％鴉膽子油(mL/mL：1mL藥液溶于1mL無菌蒸餾水中)油乳劑成品。具體篩選過程：在每一個(gè)離心管里均加入0.5mL鴉膽子油，其余試劑加入量見表1。
表1鴉膽子油乳的制備試劑加入量
以上制備得到的油乳的外觀性狀如下：
鴉膽子油乳劑(為水包油型O/W乳劑)，經(jīng)分析，C號(hào)鴉膽子油乳劑溶解度較好，乳劑粒為1μm左右，成品外觀呈乳白色的均勻乳狀液體，故本實(shí)驗(yàn)中所用鴉膽子油乳劑采用C號(hào)制備方法制得，即鴉膽子油0.5ml，吐溫-800.12ml，甘油0.125ml，無菌水加至5ml。
實(shí)施例3
鴉膽子油0.5mL加入吐溫-800.12mL、鹽酸半胱氨酸0.05g、甘油0.125mL，攪拌均勻后，再逐漸加入注射水至5mL，攪拌均勻經(jīng)過濾后分裝于10mL離心管中，封口，待用時(shí)經(jīng)微孔濾膜滅菌即得10％鴉膽子油(mL/mL：1mL藥液溶于1mL無菌蒸餾水中)油乳劑成品。
對(duì)照例1
為了與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照，采用了豆磷脂作為替換吐溫-80的原料，對(duì)照試驗(yàn)如下
表2采用常規(guī)輔料制備鴉膽子油乳的加入量
以上制備得到的油乳的外觀性狀如下：
實(shí)施例4秀麗隱桿線蟲
1.大腸桿菌OP50培養(yǎng)
將大腸桿菌(OP50)涂布于LB固體培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，后從培養(yǎng)箱中取出OP50培養(yǎng)基，用移液槍挑出1～2個(gè)單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基中，將該LB液體培養(yǎng)基放置于搖床中，轉(zhuǎn)速180r/min 37℃培養(yǎng)24h。
2.線蟲大量培養(yǎng)
從－80℃超低溫冰箱中取出一個(gè)凍存管MT2124株系線蟲迅速解凍，倒于涂布了大腸桿菌OP50并已長成菌苔的培養(yǎng)皿(NGM)上，在20℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至成蟲。
3.秀麗隱桿線蟲的同步化處理
用M9緩沖液將處于產(chǎn)卵階段的秀麗隱桿線蟲從培養(yǎng)皿上沖洗下來，轉(zhuǎn)至10mL離心管中，靜置約5min左右，待線蟲沉降后，吸出上清液，棄去。加入8mL秀麗隱桿線蟲裂解液(1moL/mLNaOH∶3.2％NaClO＝1:1，V/V，可根據(jù)實(shí)際情況加減)，漩渦震蕩4～5min，待線蟲完全死亡裂解后轉(zhuǎn)移至1.5mL小離心管中，3000r/min離心4min，棄去上清，沉淀加入1～1.5mLM9緩沖液離心清洗1次，重復(fù)上述操作，反復(fù)清洗2～3次后，加入1mLM9液，將離心管置于氣浴恒溫?fù)u床中20℃培養(yǎng)，5～6天后取出收集蟲體進(jìn)行中藥急性毒性實(shí)驗(yàn)及藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例5藥物急性毒性實(shí)驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)在96孔板上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)時(shí)每孔加入100μL實(shí)施例2中C組制備的鴉膽子油乳劑，80μLM9液，20μL的線蟲液。通常20μL的線蟲液中含線蟲70～80條，都是處于L1期的線蟲。藥液設(shè)計(jì)4個(gè)劑量，每組設(shè)3個(gè)平行樣，劑量設(shè)計(jì)為倍半稀釋，空白對(duì)照為無菌水，陰性對(duì)照為鴉膽子油溶劑，置于18℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，線蟲在該液中培養(yǎng)24h后即可讀數(shù)，將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察線蟲的鴉膽子油的急性毒性作用比率，并記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
鴉膽子油的急性毒性作用
結(jié)果表明，隨著藥物濃度不斷增大，秀麗隱桿線蟲突變株MT2124的死亡率也在不斷升高，當(dāng)濃度達(dá)到25μl/ml，死亡率僅為26％，本發(fā)明開發(fā)的鴉膽子油乳劑毒性較小。
實(shí)施例6鴉膽子油乳劑于線蟲的藥效實(shí)驗(yàn)
研究發(fā)現(xiàn)大約30％的人類腫瘤存在ras基因突變，且多種腫瘤均檢測到p21ras過表達(dá)，表明ras基因突變和p21ras過表達(dá)確實(shí)與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。由于ras信號(hào)通路從線蟲到人高度保守,在秀麗隱桿線蟲中l(wèi)et-60基因編碼保守的ras蛋白,它與人類的ras蛋白相比具有的同源性。如果ras突變,在秀麗隱桿線蟲中會(huì)引起線蟲產(chǎn)生多陰門，在人類中則是引起細(xì)胞的惡性增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此，模式生物秀麗隱桿線蟲ras信號(hào)通路過度激活型突變體被作為受試群體廣泛應(yīng)用于篩選抑制原癌基因ras通路過度激活的抗腫瘤藥物。因此，本發(fā)明采用了秀麗隱桿線蟲突變株作為評(píng)估抑制ras原癌基因通路過度激活藥物的模型。群體中野生型線蟲的比例越高,則藥物作用效果越顯著。
材料：秀麗隱桿線蟲
在96孔板上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)時(shí)每孔加入140μLS基礎(chǔ)液，20μL培養(yǎng)液，20μL藥液和20μL的線蟲液。通常20μL的線蟲液中含線蟲70～80條，都是處于L1期的線蟲。藥液為鴉膽子油、實(shí)施例二制備的鴉膽子油乳劑、吐溫-80、購買的鴉膽子油注射劑為陽性對(duì)照、無菌水為陰性對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，置于18℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，線蟲在該液中培養(yǎng)5天左右即生長至成蟲，用移液槍將每孔中的線蟲全部吸出，置于浮游生物計(jì)數(shù)板上，加入3～5滴(約10μL)NaN3溶液，待線蟲麻醉，身體擺動(dòng)較慢時(shí)置于倒置顯微鏡下觀察線蟲的野生型比率，并記錄。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吐溫-80和無菌水對(duì)ras基因無抑制作用，野生型比率較低，含有鴉膽子成分的藥液中，野生型比率升高，表明鴉膽子油對(duì)于ras基因具有明顯的抑制作用，其中，本發(fā)明中的鴉膽子油乳劑實(shí)驗(yàn)組中的野生型比率最高，為80％以上，鴉膽子油注射劑實(shí)驗(yàn)組的其次，鴉膽子油最低，表明鴉膽子油乳劑這一劑型的穩(wěn)定性強(qiáng)于單一的鴉膽子油，而且本發(fā)明中采用吐溫-80替代豆磷脂的這一新劑型，其藥效更好，優(yōu)于傳統(tǒng)油乳劑型。