本發(fā)明屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域，具體是一種防治脂肪肝的中藥多糖組合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

隨著我國(guó)民眾生活水平的不斷提高，其生活方式及飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致近年來(lái)脂肪肝的發(fā)病率逐年上升，成為第二類常見肝病，僅次于病毒性肝炎。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，發(fā)病年齡越趨低齡，嚴(yán)重影響我國(guó)民眾的健康及生活質(zhì)量。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于脂肪肝的治療尚未有特效藥物，而中醫(yī)藥以其多物質(zhì)、多靶點(diǎn)、多途徑的治療特色，在防治脂肪肝方面取得了顯著的療效。

算盤子Glochidion puberum（Linn.）Hutch.為大戟科植物，別名算盤木、野南瓜、算盤粒、金骨風(fēng)等，生長(zhǎng)于山坡灌叢中，主要分布于福建、廣東、廣西、貴州、四川、陜西、湖北、湖南等省區(qū)，廣西各地均有產(chǎn)。具有清熱解毒，消滯止痛，祛風(fēng)除濕，活血散瘀等功效，可用于治療感冒發(fā)熱、消化不良、腸炎、痢疾、黃疸、咽炎、皮炎濕疹等病癥。廣西民間常用其治療肝臟方面疾病，長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)用藥表明，其具有較高的藥用價(jià)值。

穿破石C.tricuspidata（Carr.）Bur.ex Lavallee為拓樹的根或根皮，別名辣椒刺、黃蜂刺、黃穿破石、黃龍退殼、山荔枝等，生長(zhǎng)于山坡、溪邊、灌叢中，主要分布于安徽、浙江、江西、福建、廣西、廣東、貴州、云南等省區(qū)，廣西各地有產(chǎn)。具有止咳化痰，祛風(fēng)利濕，散瘀止痛等功效，可用于肺結(jié)核，黃疸型肝炎，肝脾腫大，胃、十二指腸潰瘍，風(fēng)濕性腰腿痛等病癥。

經(jīng)檢索，未見算盤子多糖、穿破石多糖和二者多糖的組合物在防治脂肪肝方面的報(bào)道，因此，本發(fā)明分別以算盤子多糖、穿破石多糖和二者多糖的組合物干預(yù)脂肪肝大鼠，通過(guò)藥效指標(biāo)，評(píng)判在防治脂肪肝方面的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是以算盤子根為原料提取純化出算盤子多糖，以穿破石根為原料提取純化出穿破石多糖，并將其二者有效部位除雜后，共同作用于脂肪肝大鼠，為其在防治脂肪肝方面提供理論依據(jù)，這在國(guó)內(nèi)外尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是：

一種防治脂肪肝的中藥多糖組合物，包含算盤子多糖及穿破石多糖，二者的比例為1∶1。

所述算盤子多糖的提取及純化方法是：取算盤子根，粉碎成粗粉，按10∶1的料液比加入石油醚，回流脫脂提取2次，每次1 h，揮盡藥渣中的石油醚后，按照20∶1料液比加入蒸餾水，沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液并濃縮；濃縮液用氯仿-正丁醇按4∶1多次萃取，取上清液，加入95%乙醇，并將其置于4℃冰箱中醇沉12 h，抽濾，濾渣依次用乙醚、丙酮、無(wú)水乙醇洗滌，得算盤子粗多糖；將算盤子粗多糖溶于水中，加樣到經(jīng)pH=8的磷酸鹽緩沖液前處理的 DE52 型樹脂層析柱中，靜止過(guò)夜，用蒸餾水洗脫，流速為1.5 ml/min，合并洗脫液，冷凍干燥得到算盤子多糖。

采用DE52型樹脂層析柱進(jìn)行洗脫，先以蒸餾水進(jìn)行洗脫，然后用0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/ml NaCl溶液梯度洗脫，洗脫液用苯酚- 硫酸試劑顯色后，測(cè)其吸光度，測(cè)定算盤子多糖純度≥75.62%。

所述穿破石多糖的提取及純化方法是：取穿破石根，粉碎成粗粉，按照25∶1料液比加入蒸餾水，置于90℃的水浴中提取4 h，過(guò)濾后，取上清液，將上清濃縮至14%濃度，加入3倍體積95%乙醇，并置于4℃冰箱中醇沉12 h，4000 r/min離心20 min，烘干沉淀物，即為穿破石粗多糖；將穿破石粗多糖用去離子水復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH=3，并加入4%的硫酸鋅，4000 r/min離心20 min，烘干沉淀物，得到穿破石純化多糖。應(yīng)用“苯酚- 硫酸”法，測(cè)得其純度≥70.57%。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次公開了以算盤子根為原料提取純化出算盤子多糖的方法和以穿破石根為原料提取純化出穿破石多糖的方法，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，與其二者多糖單獨(dú)作用于脂肪肝大鼠的療效相比，其二者多糖共同作用的療效更佳。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)空白組的病理切片圖(HE染色，×200)；

圖2為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的病理切片圖(HE染色，×200)；

圖3為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性組的病理切片圖(HE染色，×200)；

圖4為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)多糖聯(lián)合組的病理切片圖(HE染色，×200)；

圖5為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)算盤子多糖組的病理切片圖(HE染色，×200)；

圖6為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)穿破石多糖組的病理切片圖(HE染色，×200)；

圖7為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)空白組的病理切片圖(油紅染色，×200)；

圖8為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的病理切片圖(油紅染色，×200)；

圖9為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性組的病理切片圖(油紅染色，×200)；

圖10為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)多糖聯(lián)合組的病理切片圖(油紅染色，×200)；

圖11為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)算盤子多糖組的病理切片圖(油紅染色，×200)；

圖12為本發(fā)明中藥多糖組合物抗大鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)穿破石多糖組的病理切片圖(油紅染色，×200)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限定。

一、算盤子多糖的提取和純化：

取算盤子根，粉碎成粗粉，按10∶1的料液比加入石油醚，回流脫脂提取2次，每次1 h，揮盡藥渣中的石油醚后，按照20∶1料液比加入蒸餾水，沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液并濃縮；濃縮液用氯仿-正丁醇按4∶1多次萃取，取上清液，加入95%乙醇，并將其置于4℃冰箱中醇沉12 h，抽濾，濾渣依次用乙醚、丙酮、無(wú)水乙醇洗滌，得算盤子粗多糖；將算盤子粗多糖溶于水中，加樣到經(jīng)pH=8的磷酸鹽緩沖液前處理的 DE52 型樹脂層析柱中，靜止過(guò)夜，用蒸餾水洗脫，流速為1.5 ml/min，合并洗脫液，冷凍干燥得到算盤子多糖。

采用DE52型樹脂層析柱進(jìn)行洗脫，先以蒸餾水進(jìn)行洗脫，然后用0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/ml NaCl溶液梯度洗脫，洗脫液用苯酚- 硫酸試劑顯色后，測(cè)其吸光度，測(cè)定算盤子多糖純度≥75.62%。

二、穿破石多糖的提取和純化：

取穿破石根，粉碎成粗粉，，按照25∶1料液比加入蒸餾水，置于90℃的水浴中提取4 h，過(guò)濾后，取上清液，將上清濃縮至14%濃度，加入3倍體積95%乙醇，并置于4℃冰箱中醇沉12 h，4000 r/min離心20 min，烘干沉淀物，即為穿破石粗多糖；將穿破石粗多糖用去離子水復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH=3，并加入4%的硫酸鋅，4000 r/min離心20 min，烘干沉淀物，得到穿破石純化多糖。應(yīng)用“苯酚- 硫酸”法，測(cè)得其純度≥70.57%。

三、算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用的保肝實(shí)驗(yàn)的方法和結(jié)果：

1.1 儀器、藥物和動(dòng)物

TGL-16K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)廠； AU600全自動(dòng)生化檢測(cè)儀，奧林巴斯生產(chǎn)；01ymPus BX51顯微鏡，奧林巴斯生產(chǎn)；BS1105電子天平，德國(guó)sartorius公司。恒溫水浴鍋XMTD—6000，上海長(zhǎng)風(fēng)儀器廠；THZ-C-1 臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

算盤子為大戟科植物算盤子Glochidion puberum（Linn.）Hutch.的根或全株。穿破石為桑科植物拓樹C.tricuspidata（Carr.）Bur.ex Lavallee的根或根皮。ALT，AST，AKP，MDA，SOD， GSH購(gòu)于南京建成生物工程研究所；TG，TC，LDL-C，HDL-C購(gòu)于北京北華康泰臨床試劑有限公司；TNF-α，IL-6試劑盒購(gòu)于Elabscience公司，TGF-β1購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；水飛薊賓膠囊天津天士力制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20140224。

昆明種SPF級(jí)小鼠60只，體重19-22g，雌雄各半，由桂林醫(yī)學(xué)院SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK2007-0001)。

1.2 方法

將60只大鼠完全隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組，模型組，水飛薊賓組（100 mg·kg^-1），多糖聯(lián)合組（各50 mg·kg^-1），算盤子多糖組（100 mg·kg^-1）及穿破石多糖組（100 mg·kg^-1），正常組喂以普通飼料，其余各組以高糖高脂飼料（基礎(chǔ)飼料68.8%、10%蔗糖、10%蛋黃、10%豬油、膽固醇1%、膽鹽0.2%）喂養(yǎng)，于第7周造成大鼠脂肪肝模型，并受試藥物干預(yù)5周后，禁食不禁水18 h后，眼球取血和收集肝組織。參照試劑盒的說(shuō)明，生物化學(xué)法檢測(cè)血清中ALT，AST，AKP和TG，TC，LDL-C，HDL-C生化指標(biāo)；測(cè)定肝組織中MDA，SOD，GSH水平或活性； ELISA法檢測(cè)肝組織中TNF-α，IL-6和TGF-β1含量；取大鼠肝左葉，固定于4 %多聚甲醛溶液中，石蠟包埋、切片、應(yīng)用油紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示。

1.3 結(jié)果

1.3.1 算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用對(duì)脂肪肝大鼠血清中ALT，AST和AKP水平的影響

表1 算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用對(duì)脂肪肝大鼠血清中ALT，AST和AKP水平的影響(±s,n=10)

與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

由表1結(jié)果可見，模型組與正常組相比較，ALT，AST和AKP差異有極顯著性(P<0.01)；與模型組比較，算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用均能顯著的抑制ALT，AST和AKP活性 ( P<0.01，P<0.05)，且二者多糖聯(lián)合使用效果最佳，因此可判斷算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用對(duì)受損的肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。

1.3.2 算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用對(duì)脂肪肝大鼠血清中LDL-C，HDL-C，TG和TC的影響

模型對(duì)照組TG，TC和LDL-C含量升高以及HDL-C水平降低(P<0.05或0.01)，算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用能明顯提高模型鼠HDL-C含量,降低TG，TC，LDL-C 含量(P<0.05或0.01)，可判斷算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用對(duì)脂肪肝大鼠的血清血脂具有顯著的調(diào)節(jié)作用，見表2。

表2算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用對(duì)脂肪肝大鼠血清中LDL-C，HDL-C，TG和TC的影響( ± s, n = 10)

與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

1.3.3 算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用對(duì)脂肪肝大鼠肝組織中MDA，GSH和SOD的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝中MDA含量明顯升高，SOD活性降低及GSH 含量減少(P<0.01); 算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用能顯著降低脂肪肝大鼠肝組織中MDA含量，SOD活性提高及GSH含量增加(P<0.05或0.01)，表明算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用具有良好的抗氧化能力。見表3。

表3 算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用對(duì)脂肪肝大鼠肝組織中MDA，GSH和SOD的影響( ± s, n = 10)

與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

1.3.4 算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用對(duì)脂肪肝大鼠TNF-α，IL-6和TGF-β₁水平的影響，見表4。

表4算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用對(duì)脂肪肝大鼠TNF-α，IL-6和TGF-β₁水平的影響

與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

由表4中 ELISA結(jié)果表明，與正常組比較，模型組肝組織中TNF-α，IL-6和 TGF-β1水平明顯增加（P<0.01）。經(jīng)受試藥物治療后，各組肝組織中TNF-α，IL-6和 TGF-β1的水平逐漸減少，與模型組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖聯(lián)合使用可通過(guò)抑制肝組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒性來(lái)實(shí)現(xiàn)保肝作用。

1.3.5 肝組織病理變化

經(jīng)HE染色，在光鏡下觀察，正常大鼠肝細(xì)胞均勻整齊，胞漿豐富，未見脂肪病變，匯管區(qū)未發(fā)現(xiàn)炎癥浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索和肝竇均清晰可辨。模型組肝組織肝細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)明顯脂肪變性，出現(xiàn)不同程度的水腫，中央靜脈出現(xiàn)明顯點(diǎn)灶狀壞死和淤血現(xiàn)象。而經(jīng)受試藥物干預(yù)后，較模型組比較，呈現(xiàn)為炎癥反應(yīng)明顯減輕，細(xì)胞索狀排列較整齊，肝內(nèi)淤血和點(diǎn)灶狀壞死明顯減少，肝細(xì)胞數(shù)量增加，脂肪變性細(xì)胞減少，但聯(lián)合藥物用藥物改善最明顯，見圖1-6。從油紅染色結(jié)果來(lái)看，正常對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)很少量橘紅色脂滴聚集，模型組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿大量大小不等的橘紅色脂滴，細(xì)胞發(fā)生明顯的腫脹。藥物干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴明顯少于模型組，但聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴少于其余用藥組，如圖7-12所示。

以上本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，算盤子多糖，穿破石多糖及二者多糖組合物能夠較好地改善脂肪肝大鼠肝功能，但二者聯(lián)合使用療效更佳。