本發(fā)明涉及一種可用于中樞神經(jīng)修復(fù)的絲素三維支架，主要用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中脊髓缺損的修復(fù)，屬生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴重損傷，它的修復(fù)目前仍是臨床難題之一。這主要是因為脊髓損傷后自我修復(fù)能力有限，損傷的神經(jīng)細胞難以再生，同時，體內(nèi)的髓鞘相關(guān)抑制因子會抑制和功能恢復(fù)密切相關(guān)的軸突的再生，最后導(dǎo)致瘢痕障礙的形成。
隨著新科技、新技術(shù)的不斷進步和廣泛應(yīng)用，有關(guān)脊髓損傷修復(fù)的研究取得了一定的進展，但還達不到臨床的廣泛應(yīng)用的要求。目前，自體神經(jīng)移植仍是臨床上治療脊髓損傷的最有效方法。盡管自體神經(jīng)移植材料具有很好的組織相容性和修復(fù)效果,但移植過程不可避免的會引起供區(qū)瘢痕、神經(jīng)瘤形成和神經(jīng)纖維誤向支配等問題，難以滿足臨床需求。對于較嚴重的脊髓損傷患者，往往存在病灶區(qū)域尺寸太大，神經(jīng)移植物結(jié)構(gòu)差異較大，造成神經(jīng)疼痛等問題，且容易造成二次創(chuàng)傷，增加了病人的痛苦和治療成本。
組織工程是將體外培養(yǎng)擴增的正常組織細胞吸附于一種具有優(yōu)良細胞相容性并可以被機體降解吸收的生物材料上面形成復(fù)合物，然后將細胞-生物材料復(fù)合物植入人體組織、器官的病損部位，在作為細胞生長支架的生物材料逐漸被機體降解吸收的同時，細胞不斷增殖、分化，形成在形態(tài)、功能方面與相應(yīng)組織、器官一致的組織，從而達到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。組織工程修復(fù)脊髓損傷著重于三個方面：種子細胞、組織工程支架及材料、細胞因子，其中組織工程支架是組織工程的根本,生物材料在組織工程中起到了連接種子細胞與再生組織橋梁的作用。隨著組織工程的發(fā)展和人們對于組織工程的機理研究深入，傳統(tǒng)的“生物惰性”以及“不可降解”的生物材料已無法滿足組織工程支架的要求。
組織工程支架的主要作用有：(1)為細胞提供生長的三維空間和物理支撐；(2)能夠粘附可促進組織功能恢復(fù)的重要分子，創(chuàng)造適宜的微生物環(huán)境，促進細胞增殖和新陳代謝；(3)可提供特殊的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)細胞構(gòu)建特定功能的組織或器官；(4)能夠傳遞化學(xué)或者力學(xué)信號，調(diào)控細胞的表型。
在此之前人們用殼聚糖作為修復(fù)脊髓的支架，該支架雖制備方便、機械和降解性能可控、利于相關(guān)分子的粘附和細胞生長，但存在強度差，同種子細胞不易相容的缺點。人們還嘗試用膠原、纖維蛋白凝膠、藻酸鹽凝膠、聚乳酸、聚己內(nèi)酯等作為組織工程支架，但在生物相容性和力學(xué)性能方面存在一些問題。因此，迫切需要在具備促脊髓修復(fù)活性同時，也具備良好的生物相容性和可生物降解性、優(yōu)良理化性能、可調(diào)控生物學(xué)性能的新型脊髓修復(fù)支架。目前，國內(nèi)外的研究已初步證明絲素蛋白用于神經(jīng)組織缺損具有一定的優(yōu)勢。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種可用于中樞神經(jīng)修復(fù)的絲素三維支架。
一種可用于中樞神經(jīng)修復(fù)的絲素三維支架，其特征在于，包括如下步驟：
(1)通過某種方法獲得脫膠完全的蠶絲絲素纖維；
(2)將蠶絲絲素進行脫膠，溶解，透析獲得一定濃度的絲素蛋白溶液；
(3)將絲素纖維通過進賦予其表面溝槽結(jié)構(gòu)；
(4)將步驟(2)制備的絲素蛋白溶液與透明質(zhì)酸以一定的質(zhì)量比混合，添加交聯(lián)劑，獲得絲素蛋白復(fù)合凝膠前溶液；
(5)將步驟(2)制備的絲素溶液，在乙醇的處理下，反復(fù)烘干制成導(dǎo)管膜；
(6)將具有溝槽結(jié)構(gòu)纖維，復(fù)合凝膠溶液，導(dǎo)管膜組合成絲素三維支架。
優(yōu)選的,所述的用于溝槽結(jié)構(gòu)處理的絲素纖維是經(jīng)過蠶絲完全脫膠或絲素溶液進行高壓靜電紡等方法制備的。
優(yōu)選的,所述的絲素蛋白纖維溝槽是通過離子剝離技術(shù)或通過原位吸附聚吡咯形成的。
優(yōu)選的,所述的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠中，絲素蛋白和透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為100:0，90:10，80:20，60:40，50:50，40:60，20:80，10:90，0:100中的一種或幾種。
優(yōu)選的,所述的在絲素導(dǎo)管膜制備過程中，絲素蛋白溶液的濃度為1-10％w/v，乙醇溶液的濃度為30-90％。
本發(fā)明具有以下明顯優(yōu)點：
1、同其他天然纖維及合成纖維相比，絲素蛋白具有獨特的力學(xué)性能，可為神經(jīng)組織再生提供足夠的物理支撐。
2、絲素蛋白具有優(yōu)越的生物相容性，減少了移植后機體的免疫反應(yīng)。
3、應(yīng)用于脊髓修復(fù)時，軸突可以沿著絲素蛋白表面的凹凸溝槽結(jié)構(gòu)定向生長至斷裂處。
4、利用聚吡咯制備的表面具有溝槽的絲素蛋白，可制備更有利于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)的導(dǎo)電材料。
5、絲素蛋白和透明質(zhì)酸復(fù)合制備的凝膠可同時具有兩者的優(yōu)點，復(fù)合凝膠具有更好的力學(xué)性能和保水性，更有利于臨床應(yīng)用。
具體實施方式
實施例一
(1)將桑蠶絲生絲置于質(zhì)量分數(shù)為0.6‰的碳酸鈉沸水溶液中脫膠3次，前兩次每次處理30min，第三次處理45min，得到的絲素纖維用去離子水洗干凈，并在55℃烘箱中烘干，獲得絲素纖維。
(2)將步驟(1)得到的絲素纖維置于9.3M溴化鋰溶液中，在60℃條件下溶解處理4h，得到的混合溶液裝入透析袋(分子量8000-14000)于去離子水中透析4d，期間每兩小時換水一次，最后得到的絲素溶液濃度為5w/v％。
(3)將步驟(1)中制備的絲素纖維采用離子剝離技術(shù)處理，使其表面形成溝槽結(jié)構(gòu)。
(4)將步驟(2)制備的絲素蛋白溶液與透明質(zhì)酸以質(zhì)量比50：50混合制備復(fù)合絲素/透明質(zhì)酸凝膠，具體做法是，絲素蛋白溶液與透明質(zhì)酸溶液以質(zhì)量比50：50混合制備總濃度為1.5％的混合溶液，然后加入交聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，分別占絲素/透明質(zhì)酸總量的10％和20％，攪拌15min，得到絲素/透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠前溶液。
(5)用聚四氟乙烯棒沾取5％w/v的絲素蛋白溶液，烘干；然后再沾取一定60％的乙醇溶液，烘干；重復(fù)上述步驟即可得到絲素膜導(dǎo)管。
(6)將若干根處理好的絲素蛋白纖維放置于絲素膜導(dǎo)管中，然后向絲素膜中注入絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠前的混合液體，使之填充于絲素蛋白之間，靜置24h，獲得三維絲素支架。
實施例二
(1)將桑蠶絲生絲置于質(zhì)量分數(shù)為0.6‰的碳酸鈉沸水溶液中脫膠3次，前兩次每次處理30min，第三次處理45min，得到的絲素纖維用去離子水洗干凈，并在55℃烘箱中烘干，獲得絲素纖維。
(2)將步驟(1)得到的絲素纖維置于9.3M溴化鋰溶液中，在60℃條件下溶解處理4h，得到的混合溶液裝入透析袋(分子量8000-14000)于去離子水中透析4d，期間每兩小時換水一次，最后得到的絲素溶液濃度為5w/v％。
(3)將步驟(1)中制備的絲素纖維利用原位吸附聚合法制備成絲素/聚吡咯復(fù)合導(dǎo)電纖維，使聚吡咯均勻的分布在絲素的表面，形成一層凹凸不平的溝槽結(jié)構(gòu)。具體試驗方法是：在常溫常壓下，取若干束絲素置于0.2mol/L的吡咯水溶液中預(yù)浸泡50min，然后邊攪拌邊緩慢滴加等體積的濃度為0.3％的三氯化鐵水溶液，反應(yīng)6h后取出樣品，恒溫干燥即可。
(4)將步驟(2)制備的絲素蛋白溶液與透明質(zhì)酸以質(zhì)量比50：50混合制備復(fù)合絲素/透明質(zhì)酸凝膠，具體做法是，絲素蛋白溶液與透明質(zhì)酸溶液以質(zhì)量比50：50混合制備總濃度為1.5％的混合溶液，然后加入交聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，分別占絲素/透明質(zhì)酸總量的10％和20％，攪拌15min，得到絲素/透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠前溶液。
(5)用聚四氟乙烯棒沾取5％w/v的絲素蛋白溶液，烘干；然后再沾取一定60％的乙醇溶液，烘干；重復(fù)上述步驟即可得到絲素膜導(dǎo)管。
(6)將若干根處理好的絲素蛋白纖維放置于絲素膜中，然后向絲素膜中注入絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合凝膠前的混合液體，使之填充于絲素蛋白之間，靜置24h，獲得三維絲素支架。
以上列舉的僅是本發(fā)明的部分具體實施例，顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。