本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物領(lǐng)域，涉及一種含千層紙素用于治療白血病的組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

千層紙素(Oroxylin A)是黃芩的活性組分之一，具有明顯的抗腫瘤作用，是一個(gè)具有廣闊應(yīng)用前景的天然抗腫瘤藥物。目前不少文獻(xiàn)對(duì)千層紙素的抗腫瘤作用及誘導(dǎo)凋亡和周期阻滯進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)千層紙素對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG2有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，且對(duì)ICR小鼠實(shí)驗(yàn)性移植瘤S₁₈₀也具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，抑制率最高可達(dá)40％以上，作用于低分化人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823導(dǎo)致其周期阻滯于G2/M期，提示千層紙素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且可以針對(duì)細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。但是目前沒(méi)有千層紙素對(duì)白血病影響的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種含千層紙素的抗白血病組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述組合物在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。

全反式維甲酸(ATRA)的治療對(duì)U937和HL-60等非急性早幼粒細(xì)胞白血病無(wú)效，TNFα可促進(jìn)U937和HL-60分化，但分化過(guò)程中有明顯的副作用抑制其分化效果，千層紙素聯(lián)用TNFα可增敏細(xì)胞對(duì)TNFα的反應(yīng)。

本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種藥物組合物，該藥物組合物的活性成分包含千層紙素和腫瘤壞死因子。

所述的藥物組合物的活性成分含有下列濃度比例的組分：

千層紙素10～50μM：腫瘤壞死因子10～20ng/mL。

所述的藥物組合物在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用。

所述的白血病為急性髓系白血病。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了千層紙素與TNFα聯(lián)用能夠增強(qiáng)TNFα抑制人白血病細(xì)胞株NB4、細(xì)胞株U937-MDR以及細(xì)胞株HL-60-resistant的活力，也能增強(qiáng)TNFα抑制人AML原代細(xì)胞的活力，延長(zhǎng)人AML原代細(xì)胞接種小鼠的生存期，可用于制備治療白血病的藥物，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1：千層紙素增強(qiáng)TNFα對(duì)AML細(xì)胞活力的抑制。

圖2：千層紙素增強(qiáng)TNFα對(duì)AML細(xì)胞活力的抑制。

圖3：TNFα聯(lián)用千層紙素延長(zhǎng)人AML原代細(xì)胞接種小鼠的生存期。

具體實(shí)施方式：

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。

實(shí)施例1

本研究主要是將黃酮類抗腫瘤化合物與抗腫瘤藥物腫瘤壞死因子TNFα聯(lián)合，用于治療急性髓系白血病(AML)。通過(guò)體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，千層紙素能夠與TNFα聯(lián)合增效。

1、實(shí)驗(yàn)材料

1.1試劑

(1)千層紙素(oroxylin A)購(gòu)自江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)藥科大學(xué))，使用前用二甲亞砜(DMSO)將藥物粉末配制為0.5M的濃度的母液，臨用前用細(xì)胞培養(yǎng)液配成所需濃度。全反式維甲酸(ATRA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，溶解于DMSO配制成濃度為20mM的母液。

(2)重組人腫瘤壞死因子α(TNFα)購(gòu)自Prospec-Tany TechnoGene股份有限公司。使用前先用無(wú)菌水將粉末配置成1.0mg/ml濃度的母液，再用0.1％BSA將其稀釋為1μg/ml的儲(chǔ)備液，-20℃分裝保存。臨用前用細(xì)胞培養(yǎng)液配成所需濃度。

(3)細(xì)胞培養(yǎng)試劑

①培養(yǎng)液：RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。取RPMI-1640粉末10.39g溶于1000ml滅菌三蒸水中，并加入2.0g NaHCO₃，用1M鹽酸調(diào)pH值至7.0，圓筒式過(guò)濾器過(guò)濾除菌、分裝，4℃冰箱保存。使用前加入100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素。

②胎牛血清：美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品。經(jīng)56℃水浴滅活30min，分裝并保存于-20℃低溫冰箱中。

③PBS緩沖液：稱取NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO4 2.0g，溶于1000ml三蒸水中，高壓滅菌，4℃冰箱保存。

(4)淋巴細(xì)胞分離液，南京晶美公司產(chǎn)品。

(5)MTT貯液(5mg/ml溶于PBS)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。取MTT粉末1.0g溶于20ml PBS溶液中，避光超聲溶解。

(6)細(xì)胞分化檢測(cè)相關(guān)試劑

人抗鼠CD11b-PE，anti-CD14-FITC抗體購(gòu)自Miltenyi公司。

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)購(gòu)自瑞士Roche公司。

(7)全反式維甲酸(ATRA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，溶解于DMSO配制成濃度為20mM的母液。

(8)千層紙素(oroxylin A)購(gòu)自江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)藥科大學(xué))，做成靜脈注射劑。

(9)重組人腫瘤壞死因子α(TNFα)(500,000IU/ml)購(gòu)自上海維科生物醫(yī)藥有限公司。小鼠靜脈注射(3,000IU/kg)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

(1)YJ-875型醫(yī)用凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠生產(chǎn)。

(2)3111型水套式CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo electron公司產(chǎn)品。

(3)電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。

(4)ELX800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)Bio-tek公司產(chǎn)品。

(5)QIUJING血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：中國(guó)上海求精生化試劑儀器有限公司產(chǎn)品。

(5)Olympus相機(jī)：日本Olympus公司產(chǎn)品。

(6)LD4-2普通離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品。

(7)5417R型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

(8)THZ-312型臺(tái)式恒溫振蕩器：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3細(xì)胞株

人白血病細(xì)胞株NB4購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所，細(xì)胞株U937-MDR和HL-60-resistant由阿爾伯特.愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院的Robert E.Gallagher教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，通過(guò)廣州吉妮歐生物科技有限公司購(gòu)買。人AML原代細(xì)胞購(gòu)買于江蘇省人民醫(yī)院血液科。所有細(xì)胞均用含100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。

NB4為急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)細(xì)胞株，U937-MDR為U937多藥耐藥株，HL-60-resisitant為HL-60的全反式維甲酸ATRA耐藥株。分化誘導(dǎo)劑全反式維甲酸(ATRA)對(duì)NB4有效，作為陽(yáng)性對(duì)照；U937和HL-60都是非急性早幼粒細(xì)胞白血病的急性髓系白血病(AML)，都無(wú)法響應(yīng)全反式維甲酸(ATRA)的治療。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

品系：NOD/SCID小鼠；

周齡：6-8周；

體重：18-22g；

飼養(yǎng)條件：顆粒飼料；SPF空調(diào)房間，溫度18-24℃，相對(duì)濕度70％。

購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1淋巴細(xì)胞分離液分離人白血病細(xì)胞

人外周血中各種細(xì)胞的密度不同，人紅細(xì)胞密度為1.093，粒細(xì)胞為1.092，淋巴細(xì)胞為1.074±0.001。密度梯度離心法的原理主要根據(jù)各類血細(xì)胞比重的差異，利用比重介于某兩類細(xì)胞之間的細(xì)胞分離液對(duì)血液離心，使一定比重的血細(xì)胞按相應(yīng)的密度梯度分布于不同的獨(dú)立帶，從而達(dá)到分離的目的。將無(wú)菌的10ml離心管中加入2ml淋巴細(xì)胞分離液。將2ml肝素抗凝管(或枸櫞酸鈉)中的靜脈血與等量無(wú)血清培養(yǎng)基充分混勻后，用移液器沿管壁緩慢滴加于分層液面上，注意保持清楚的界面。2000rpm離心20min。離心后管內(nèi)分為三層在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧狹窄帶。單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。用毛細(xì)管或吸頭插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。然后置于另一離心管中。加入5倍體積的無(wú)血清培養(yǎng)基液洗滌，上下顛倒數(shù)次混勻，1500rpm離心15min。棄上清，再重復(fù)洗滌細(xì)胞1次。末次離心后，棄上清，盡可能將上清吸凈。加入1ml含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞。細(xì)胞分離好后立即使用。離心示意圖如下：

2.2MTT實(shí)驗(yàn)

活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能將MTT還原為藍(lán)紫色的結(jié)晶甲臜，其溶解液顏色的深淺與細(xì)胞的活力大小呈正比。將實(shí)驗(yàn)所需處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按一定的濃度接種于96孔酶標(biāo)板內(nèi)。細(xì)胞接種濃度一般在0.5～2×10⁴個(gè)/孔，每孔內(nèi)體積為50μl。并加入50μl終濃度20μM的千層紙素預(yù)處理24h。接著加入100μl不同終濃度(10，20ng/mL)的TNFα繼續(xù)置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)至96h后，每孔加入20μl MTT溶液。繼續(xù)孵育4h后將每孔的上清液吸凈。每孔加入100μl DMSO，放于微型振蕩器上振動(dòng)5min使結(jié)晶溶解。待結(jié)晶完全溶解后將其放于酶標(biāo)儀上檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm。將檢測(cè)后的吸光值整理后按下面的公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

2.3流式表面抗原檢測(cè)

隨著細(xì)胞發(fā)生分化，細(xì)胞膜表面蛋白抗原也相應(yīng)發(fā)生改變，這些與分化有關(guān)的蛋白稱為分化抗原?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原來(lái)較為精確地判斷細(xì)胞是否發(fā)生分化。其中，CD11b是髓系分化成熟的標(biāo)志抗原。TNFα聯(lián)用千層紙素或ATRA作用于人細(xì)胞系及人AML原代細(xì)胞孵育96h后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將各組細(xì)胞調(diào)至同一密度(5×10⁵個(gè)/ml)，用含0.5％BSA的PBS緩沖液封閉細(xì)胞表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，離心后重懸，加入抗體，使PE標(biāo)記的CD11b及FITC標(biāo)記的CD14抗體與待測(cè)細(xì)胞表面的CD抗原結(jié)合，再用免疫熒光流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FCM)計(jì)數(shù)熒光標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞，與未加抗體的經(jīng)同樣處理方式處理的細(xì)胞作對(duì)照，并作同型對(duì)照。

2.3人AML原代細(xì)胞NOD/SCID小鼠模型建立方法

(1)取AML病人新鮮血液樣本，用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基RPMI 1640重懸待用。

(2)動(dòng)物輻照。將NOD/SCID小鼠進(jìn)行X射線輻照，輻照量為2.4Gy。

(3)輻照后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行接種，將原代細(xì)胞離心后重懸為最終密度為1×10⁷個(gè)/ml，用空針抽吸，每次抽吸前將細(xì)胞混勻，以0.1ml(1×10⁶個(gè))接種于NOD/SCID小鼠尾靜脈。

(4)試驗(yàn)設(shè)空白組，陰性對(duì)照組，單藥組和聯(lián)用組。空白組，陰性對(duì)照組給生理鹽水，單藥組給予80mg/kg的千層紙素或3,000IU/kg的TNFα(按人臨床使用劑量與小鼠進(jìn)行換算)，千層紙素腹腔注射隔天給藥，TNFα尾靜脈注射給藥，每周周三到周六給藥，給共給藥30天。

(5)給藥期間，觀察各組小鼠的生存狀態(tài)。記錄小鼠死亡情況。

(6)整理結(jié)果，出具報(bào)告。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)TNFα聯(lián)用千層紙素對(duì)AML細(xì)胞株細(xì)胞活力的影響

通過(guò)MTT測(cè)定不同濃度的TNFα(10，20ng/mL)和20μM千層紙素各自單用或兩者聯(lián)用4天后，NB4，U937-MDR和HL-60-resistant細(xì)胞活力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1A)，與單獨(dú)用藥組相比，TNFα聯(lián)用千層紙素顯著地抑制三種細(xì)胞的活力。同樣，在人AML原代細(xì)胞中，TNFα聯(lián)用千層紙素也能夠顯著抑制細(xì)胞活力(圖1B)。

(2)TNFα聯(lián)用千層紙素對(duì)AML細(xì)胞株分化相關(guān)表面抗原的影響

如圖2所示，與單獨(dú)用藥組相比，TNFα聯(lián)用千層紙素給藥后，NB4，U937-MDR和HL-60-resistant細(xì)胞表面CD11b和CD14兩種表面抗原均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明，TNFα聯(lián)用千層紙素能夠誘導(dǎo)這三種白血病細(xì)胞向成熟的方向變化，且具有單核系分化特征。同時(shí)，TNFα聯(lián)用千層紙素給藥后，人原代AML細(xì)胞表面CD11b和CD14兩種表面抗原也發(fā)生明顯增加，分化能力顯著提高。

(3)TNFα聯(lián)用千層紙素在體內(nèi)對(duì)人AML細(xì)胞接種NOD/SCID小鼠模型的影響

如圖3所示，與陰性對(duì)照組相比，TNFα聯(lián)用千層紙素能夠顯著延長(zhǎng)接種人AML原代細(xì)胞的NOD/SCID小鼠的生存期。