本發(fā)明涉及的是生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種用于治療皮膚附屬器及瘙癢性皮膚病的外用藥物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

尋常痤瘡是一種非常常見(jiàn)的皮膚病，在全世界有6億5千萬(wàn)患者。它是由于毛囊、皮脂腺阻塞，導(dǎo)致皮膚中存在的痤瘡桿菌大量繁殖而引發(fā)的炎癥。多發(fā)于皮脂腺較多的臉部、頸部及前胸后背等部位，常出現(xiàn)黑頭粉刺、白頭粉刺、紅丘疹、膿皰、囊腫等，并可能造成皮膚色素沉淀或者產(chǎn)生疤痕。痤瘡影響美觀，情況嚴(yán)重的患者往往會(huì)承受巨大的心理壓力。確切的病因尚未清楚，可能涉及雄性激素、皮脂生成和痤瘡桿菌感染等因素，遺傳也是個(gè)重要方面。嚴(yán)重的痤瘡患者血中雄性激素前體明顯增加，輕癥患者只是組織雄性激素水平升高。皮脂腺功能亢進(jìn)，生成過(guò)多皮脂，也是痤瘡發(fā)生的一個(gè)重要因素。痤瘡桿菌感染引起的免疫反應(yīng)與炎癥性皮損的發(fā)生有關(guān)。

痤瘡的治療一般采用外用藥和內(nèi)用藥：抗生素、糖皮質(zhì)激素、維A酸等，但此類(lèi)藥物治療靶向作用單一，需要配合其他感染和抗菌藥聯(lián)合使用，并且長(zhǎng)期使用存在毒副作用。

脂溢性皮炎又稱(chēng)脂溢性濕疹，是發(fā)生在皮脂腺豐富部位的一種慢性丘疹鱗屑性炎癥性皮膚病。本病多見(jiàn)于成人和新生兒，好發(fā)于頭面、軀干等皮脂腺豐富區(qū)。

瘙癢是許多皮膚病共有的一種自覺(jué)癥狀，該病原因復(fù)雜，皮膚存在癢感的感受器，并通過(guò)神經(jīng)末梢傳向大腦?；疾拷M織胺的釋放能促進(jìn)癢感。抓癢因壓痛有止癢作用，但又促進(jìn)釋放更多的組織胺，加重癢感，形成癢—抓的惡性循環(huán)，導(dǎo)致更為嚴(yán)重的皮膚損傷和炎癥。

結(jié)節(jié)性癢疹多見(jiàn)于成年女性，好發(fā)于四肢身側(cè)及手足背部。初起為數(shù)目不定的淡紅色丘疹，逐漸擴(kuò)大到黃豆至蠶豆大小紅褐色或灰褐色半球形結(jié)節(jié)。表面粗糙呈疣狀，陣發(fā)性劇癢，因搔抓而有色素沉著及苔蘚樣變。慢性病程。病因尚未明確，患者多為過(guò)敏體質(zhì)與蚊白蛉等昆蟲(chóng)叮咬有關(guān)，新陳代謝異常，胃腸功能失調(diào)，內(nèi)分泌功能紊亂，也就是可能與本病有關(guān)。

一般治療皮膚附屬器及瘙癢性皮膚病多采用外用和內(nèi)服藥綜合使用，外用藥主要是一些糖皮質(zhì)激素、抗菌藥、硫化硒洗劑、巰氧吡啶鋅洗劑、抗真菌制劑、硫磺和(或)水楊酸洗劑等，內(nèi)服藥采用糖皮質(zhì)激素、雷公藤多苷、抗生素、B族維生素這幾類(lèi)藥物，與治療此類(lèi)藥物同樣存在治療單一，療程較長(zhǎng)，長(zhǎng)久使用存在毒副作用，因此研發(fā)一個(gè)綜合性的藥物使其療效快速，無(wú)毒副作用是迫切需要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種用于治療皮膚附屬器及瘙癢性皮膚病的外用藥物及其制備方法，以解決傳統(tǒng)藥物治療單一，療程較長(zhǎng)，長(zhǎng)久使用存在毒副作用等技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種用于治療皮膚附屬器及瘙癢性皮膚病的外用藥物，所述外用藥物包括質(zhì)量百分比為20％-100％的NK細(xì)胞原液。

進(jìn)一步地，所述外用藥物為一種液體制劑，命名為SNK液，所述SNK液的組分及其質(zhì)量百分比包括：NK細(xì)胞原液70.0-80.0％、甘油2.0-5.0％、對(duì)羥基苯甲酸乙酯0.01-0.03％、硼砂0.03-0.08％、薄荷油0.5-1.5％，溶劑為水。

進(jìn)一步地，所述外用藥物為一種膏狀制劑，命名為SNK膏，所述SNK膏的組分及其質(zhì)量百分比包括：NK細(xì)胞原液60.0-70.0％、卡波姆941為0.1-0.5％、甘油2.0-5.0％、蘆薈粉0.2-0.5％、對(duì)羥基苯甲酸乙酯0.1-0.5％、透明質(zhì)酸0.1-0.3％、薄荷油0.5-1.5％，余量為水。

本發(fā)明還提供了上述治療皮膚附屬器及瘙癢性皮膚病的外用藥物的制備方法，包括以下步驟：

(1)取NK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得NK細(xì)胞原液；

(2)將NK細(xì)胞原液與外用藥物輔料混合，制備獲得所述外用藥物。

進(jìn)一步地，若所述藥物為液體制劑時(shí)，所述NK細(xì)胞原液的質(zhì)量百分比為70.0-80.0％，所述輔料及其質(zhì)量百分比包括：甘油2.0-5.0％、對(duì)羥基苯甲酸乙酯0.01-0.03％、硼砂0.03-0.08％、薄荷油0.5-1.5％，溶劑為水；若所述藥物為膏狀制劑時(shí)，所述NK細(xì)胞原液的質(zhì)量百分比為60.0-70.0％，所述輔料及其質(zhì)量百分比包括：卡波姆941為0.1-0.5％、甘油2.0-5.0％、蘆薈粉0.2-0.5％、對(duì)羥基苯甲酸乙酯0.1-0.5％、透明質(zhì)酸0.1-0.3％、薄荷油0.5-1.5％，余量為水。

進(jìn)一步地，所述NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：

步驟一：取新鮮血液，提取血液中的外周血單核細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱(chēng)PBMC)；

步驟二：在RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的慶大霉素和10％重量百分比的胎牛血清，獲得NK細(xì)胞培養(yǎng)液；

步驟三：取3.0×10⁷-4.0×10⁷個(gè)PBMC于一細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入20-30ml的NK細(xì)胞培養(yǎng)液和2ml的濃度為1.0×10⁷個(gè)/ml的NK擴(kuò)增試劑，獲得起始培養(yǎng)液；

步驟四：將NK細(xì)胞接種于起始培養(yǎng)液中培養(yǎng)1-2天，培養(yǎng)期間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)添加NK細(xì)胞培養(yǎng)液；當(dāng)培養(yǎng)至第3天時(shí)，將培養(yǎng)液離心，獲得的細(xì)胞沉淀中加入NK細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟五：當(dāng)NK細(xì)胞數(shù)量達(dá)1.5×10⁸個(gè)/瓶以上時(shí)，加入2支NK擴(kuò)增試劑和NK細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)增加NK細(xì)胞培養(yǎng)液并進(jìn)行分袋培養(yǎng)，使細(xì)胞濃度在1.0×10⁶個(gè)/ml，當(dāng)培養(yǎng)至第12天時(shí)，控制加液量，使細(xì)胞濃度為2.0×10⁶個(gè)/ml；

步驟六：繼續(xù)培養(yǎng)至第14天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，獲得NK細(xì)胞原液。

本發(fā)明還提供了上述外用藥物在作為皮膚附屬性疾病治療藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，將NK細(xì)胞原液與不同的外用藥物輔料混合，制備獲得外用液體制劑和外用膏狀制劑，在使用上述外用藥物制劑治療皮膚附屬器及瘙癢性皮膚病時(shí)，先用外用液體制劑，再用外用膏狀制劑進(jìn)行混合治療，以保持藥效能夠很好地讓皮膚吸收，混合使用數(shù)天后，癥狀即可減輕或消失。

本發(fā)明的原理為：NK細(xì)胞(natural killer cell，自然殺傷細(xì)胞)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。NK細(xì)胞在體外可殺傷某些細(xì)菌、真菌等，這與NK細(xì)胞釋放某些殺傷介質(zhì)有關(guān)。NK釋放的介質(zhì)主要有穿孔素、NK細(xì)胞毒因子和TNF等。而在NK細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，可合成并分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，這些細(xì)胞因子包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、單核細(xì)胞趨化蛋白、白介素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素以及穿孔素等。本生物制劑采用NK細(xì)胞原液治療皮膚附屬器及瘙癢性皮膚病，正是利用NK細(xì)胞原液中NK細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子可直接滲透皮膚作用于靶細(xì)胞的特點(diǎn)，同時(shí)，NK細(xì)胞原液中含有豐富的炎癥因子，該炎癥因子被皮膚吸收后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)，提高了皮膚自身的抵抗能力，并同時(shí)加快修復(fù)受損的組織和細(xì)胞，達(dá)到治療的效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種用于治療皮膚附屬器及瘙癢性皮膚病的外用藥物及其制備方法和應(yīng)用，該外用藥物利用NK細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子易被皮膚吸收，并能夠直接作用于靶細(xì)胞的特點(diǎn)，可直接用于痤瘡、脂溢性皮炎、瘙癢癥和結(jié)節(jié)性癢疹等皮膚附屬器及瘙癢性等皮膚附屬性疾病的治療，療效快速，同時(shí)能夠改善皮膚的免疫系統(tǒng)，修復(fù)受損的皮膚。NK細(xì)胞原液中的分泌因子還可殺傷真菌和細(xì)菌，達(dá)到綜合治療痤瘡、皮炎和瘙癢的目的，治療范圍廣泛，可防止病情的反復(fù)加重。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、材料：

本實(shí)施例所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法，所用的試劑等材料，如無(wú)特別說(shuō)明，均為市售購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品。

2、方法

2.1制備N(xiāo)K細(xì)胞原液

步驟一：PBMC提取：

將新鮮血液于740g離心10分鐘，獲得上層淡黃色血漿和下層血細(xì)胞，將下層血細(xì)胞與生理鹽水按照體積比1：1混合，取50ml離心管，將稀釋的血細(xì)胞懸液鋪在15ml淋巴細(xì)胞分離液上，400g離心30分鐘。收集中間白色膜狀細(xì)胞層，加入生理鹽水洗滌，400g離心10分鐘，棄上清液，重復(fù)洗滌一次。最后用適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，即獲得PBMC。

步驟二：NK細(xì)胞培養(yǎng)液的制備：

在Gibco RPMI Medium 1640basic培養(yǎng)液(購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)GIBCO公司)中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的慶大霉素和10％重量百分比的Gibco FBS(購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)GIBCO公司)，獲得NK細(xì)胞培養(yǎng)液。

步驟三：NK細(xì)胞起始培養(yǎng)液的制備：

取3.0×10⁷-4.0×10⁷個(gè)PBMC于一T75培養(yǎng)瓶中，加入20-30ml的NK細(xì)胞培養(yǎng)液和1支NK擴(kuò)增試劑，其中，所述NK擴(kuò)增試劑為一種CD8α-白介素21-CD137復(fù)合物(參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN102154207A)，可直接通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的方式獲得，本發(fā)明使用的NK擴(kuò)增試劑的產(chǎn)品規(guī)格為2ml/支，濃度為1×10⁷個(gè)/ml。

步驟四：NK細(xì)胞起始培養(yǎng)：

將NK細(xì)胞接種于上述T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，其中：

第1、2天注意觀察細(xì)胞狀態(tài)。如果細(xì)胞狀態(tài)良好可不處理。若培養(yǎng)液細(xì)胞密度明顯加大，可加NK細(xì)胞培養(yǎng)液10ml。

第3天將培養(yǎng)液離心，獲得的細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至新的T75培養(yǎng)瓶中，并加入30ml的NK細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

第4天觀察細(xì)胞，若細(xì)胞狀態(tài)良好，可不做處理，如果細(xì)胞密度過(guò)大，可酌情加NK細(xì)胞培養(yǎng)液。

第5天，若第4天未處理，且細(xì)胞狀態(tài)良好，若細(xì)胞密度大，則加入NK細(xì)胞培養(yǎng)液20ml。

第6天觀察細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞密度添加培養(yǎng)液30-50ml。

步驟五：NK細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)：

第7天計(jì)數(shù)，若細(xì)胞數(shù)量大于1.5×10⁸個(gè)/瓶，則加入2支NK擴(kuò)增試劑，若細(xì)胞數(shù)量在30-60百萬(wàn)，則長(zhǎng)至第8天再添加NK擴(kuò)增試劑。然后添加NK細(xì)胞培養(yǎng)液，使總細(xì)胞濃度在1.0×10⁶個(gè)/ml。隨培養(yǎng)體積逐步增大，可轉(zhuǎn)入T175培養(yǎng)方瓶擴(kuò)大體積培養(yǎng)，培養(yǎng)液體積大于120ml或細(xì)胞數(shù)量大于2.0×10⁸個(gè)/瓶時(shí)，則可以轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋培養(yǎng)。

第8-11天每天觀察細(xì)胞，使得細(xì)胞濃度在1.0×10⁶個(gè)/ml左右，通過(guò)計(jì)數(shù)添加培養(yǎng)液，使得細(xì)胞濃度在1.0×10⁶個(gè)/ml。

第12-14天每天觀察，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量大于3.0×10⁹個(gè)/袋，并且體積大于1200ml時(shí)，將細(xì)胞分為2袋。

步驟六：收集NK細(xì)胞原液：

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至所需數(shù)量時(shí)即可進(jìn)行收集使用或凍存。一般情況下，14或15天收集細(xì)胞，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，狀態(tài)最好，越往后細(xì)胞狀態(tài)會(huì)緩慢下滑，此時(shí)細(xì)胞可到3×10⁹個(gè)以上，NK細(xì)胞(CD3-CD56+)純度可達(dá)到80％以上。

2.2制備SNK液：

按重量計(jì)，取NK細(xì)胞原液80％、甘油2.0％、對(duì)羥基苯甲酸乙酯0.01％、硼砂0.03％、薄荷油0.5％,充分溶于無(wú)菌水中，混合后滅菌分裝，獲得所述SNK液。

2.3制備SNK膏：

按重量計(jì)，取NK細(xì)胞原液70％、卡波姆941為0.1％、甘油2.0％、蘆薈粉0.2％、對(duì)羥基苯甲酸乙酯0.1％、透明質(zhì)酸0.1％、薄荷油0.5％，余量為無(wú)菌水，混勻后滅菌分裝，獲得所述SNK膏。

3、臨床驗(yàn)證

將臨床實(shí)驗(yàn)分成3組進(jìn)行，具體為：

實(shí)驗(yàn)組1：選8例患有尋常痤瘡的病人、6例患有脂溢性皮炎的病人、瘙癢癥5例病人和結(jié)節(jié)性癢疹病人4例，用SNK液進(jìn)行涂抹或噴液治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計(jì)臨床治療結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)組2：選8例患有尋常痤瘡的病人、6例患有脂溢性皮炎的病人、瘙癢癥5例病人和結(jié)節(jié)性癢疹病人4例，用SNK膏進(jìn)行涂抹治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計(jì)臨床治療結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)組3：選8例患有尋常痤瘡的病人、6例患有脂溢性皮炎的病人、瘙癢癥5例病人和結(jié)節(jié)性癢疹病人4例，用SNK液及膏涂抹或噴液治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計(jì)臨床治療結(jié)果。

結(jié)果如下表1所示：

表1：SNK液和SNK膏臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

結(jié)果表明，本發(fā)明的NK細(xì)胞原液、SNK液和SNK膏對(duì)痤瘡、脂溢性皮炎、瘙癢癥和結(jié)節(jié)性癢疹均有一定的治療效果，尤其對(duì)尋常痤瘡的治療效果顯著，可徹底治愈痤瘡，減輕脂溢性皮炎的癥狀，且不需要長(zhǎng)期用藥和服用內(nèi)用藥，大大降低了毒副作用。其中：第一組和第二組分別為SNK液和SNK膏，SNK液和SNK膏中由于NK細(xì)胞原液的含量不同，療效稍微有差別，SNK液比膏效果好。當(dāng)SNK液和SNK膏一起使用時(shí)(先涂SNK液，再涂SNK膏)，既可保證NK液中的活性因子高效和持久被皮膚所吸收，又可提高療效，兩者聯(lián)合使用效果最佳。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種SNK液，按重量計(jì)，所述SNK液由NK細(xì)胞原液70.0％、甘油5.0％、對(duì)羥基苯甲酸乙酯0.03％、硼砂0.08％、薄荷油1.5％和適量無(wú)菌水組成，其中，所述NK細(xì)胞原液的制備方法同實(shí)施例1。

選患有尋常痤瘡患者3例，瘙癢癥患者2例，用上述SNK液直接噴灑于患處進(jìn)行治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計(jì)臨床治療結(jié)果。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述SNK液對(duì)尋常痤瘡的治療效果顯著，重度患者7天癥狀明顯減輕，連續(xù)使用2周后可痊愈；對(duì)瘙癢癥具有一定治療效果，輕度患者2周內(nèi)可痊愈，重度患者2周后癥狀明顯好轉(zhuǎn)。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種SNK膏，按重量計(jì)，所述SNK膏由NK細(xì)胞原液60.0％、卡波姆941為0.5％、甘油5.0％、蘆薈粉0.5％、對(duì)羥基苯甲酸乙酯0.5％、透明質(zhì)酸0.3％、薄荷油1.5％和適量水組成。

選患有溢脂性皮炎患者2例，利用上述SNK膏進(jìn)行涂抹治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計(jì)臨床治療結(jié)果。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用2周后，2例脂溢性皮炎患者的癥狀均有明顯好轉(zhuǎn)，說(shuō)明該SNK膏對(duì)溢脂性皮炎具有一定治療效果。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供了一種SNK液，按重量計(jì)，所述SNK液由NK細(xì)胞原液20％，甘油5％和適量無(wú)菌水組成，利用所述SNK液治療尋常痤瘡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該SNK液對(duì)尋常痤瘡具有一定治療效果，患者連續(xù)使用10天后癥狀均有一定好轉(zhuǎn)。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供了一種SNK液，按重量計(jì)，所述SNK液由NK細(xì)胞原液50％，甘油5％和適量無(wú)菌水組成，利用所述SNK液治療結(jié)節(jié)性癢疹病人30天后，癥狀基本消失。

實(shí)施例6

本實(shí)施例提供了一種SNK液，所述SNK液為100％的NK細(xì)胞原液，利用所述SNK液治療結(jié)節(jié)性癢疹25天后可痊愈。

理論上，藥物中的NK細(xì)胞原液的含量越高，活性因子含量越高，效果越好，但考慮到使用方便性和增加皮膚滲透性和保護(hù)性的情況下，需要在NK細(xì)胞原液基礎(chǔ)上添加了一些輔助成分，實(shí)施例6中采用100％的NK細(xì)胞原液進(jìn)行治療，其臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1的SNK液及膏相比，在治療效果上并無(wú)很大差別。

以上為本發(fā)明一種詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述的實(shí)施例。