本發(fā)明屬于基因的功能與應用領域，特別涉及一種炎癥抑制因子Numbl作為靶基因在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應用。
背景技術：
：糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，其是由胰島素分泌不足和（或）作用缺陷所引起。糖尿病主要分為Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病等。其中，Ⅱ型糖尿病最多見，約占總糖尿病患者的90%-95%。當前，全世界的糖尿病患病率、發(fā)病率以及糖尿病患者數(shù)量急劇上升。且隨著我國經濟的高速發(fā)展、生活方式西方化和人口老齡化，肥胖率上升，我國糖尿病患病率也呈快速增長趨勢：現(xiàn)成年人糖尿病患病率達9.7%，而糖尿病前期的比例更高達15.5%。更為嚴重的是我國約有60%的糖尿病患者未被診斷，且已接受治療的患者，糖尿病控制的狀況也不理想。因此，對糖尿病的防治是非常迫切的。非酒精性脂肪肝病是指除外酒精和其他明確肝損傷因素，以肝臟細胞發(fā)生脂肪變性和脂質積聚為主要病理特征的慢性肝臟疾病，其也是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)。非酒精性脂肪肝病是肝酶異常和慢性肝病最常見的原因。在我國，隨著生活水平得到改善，飲食結構發(fā)生改變，非酒精性脂肪肝病的發(fā)病率日益上升，且呈低齡化趨勢，其已成為僅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病。雖然有許多治療方法對非酒精性脂肪肝病患者有益，但是仍無確切的治療藥物。研究結果顯示，在糖尿病人群中，非酒精性脂肪肝患病率可高達80%[1]。在有些患者中，肝臟脂肪沉積可能是影響其Ⅱ型糖尿病發(fā)展的主要因素[2]。另一方面，如果Ⅱ型糖尿病控制不佳或充分發(fā)展，不僅促進脂肪肝生成，而且使肝損傷加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維變性、肝硬化及肝細胞癌[3]。這些均啟示著在臨床上不能將這兩個疾病孤立看待，Ⅱ型糖尿病與非酒精性脂肪肝是互為發(fā)生、相互作用的，可能存在潛在的共同機制。Numbl基因與Numb基因有高度的同源性，因此稱為Numb-like基因。Numbl基因和Numb基因在結構上都含有磷酸絡氨酸結合結構域（PTB），因此其都可通過減弱下游信號通路和減少Notch細胞內結構域的數(shù)量來拮抗Notch信號通路；他們都在神經發(fā)生和形成中發(fā)揮重要作用，如在胚胎神經發(fā)生中維持神經祖細胞的數(shù)量[4-6]；通過調節(jié)腦室區(qū)神經母細胞的存活和室管膜的完整性來影響腦室區(qū)的神經形成；在血管生成、心臟形成和心臟祖細胞分化中發(fā)揮重要作用[7、8]；在腫瘤形成和轉移中發(fā)揮重要作用[9、10]。Numb有富含脯氨酸結構域，而Numbl沒有；Numbl有多聚谷氨酰胺結構域，而Numb沒有。Numb分布在細胞膜上，而Numb分布在細胞漿中。因Numbl和Numb在結構上的差異和定位上的不同，也導致其發(fā)揮的作用也不盡相同[11、12]。目前發(fā)現(xiàn)Numbl還可與TAB2和Traf6直接結合，并通過促進Traf6以K48方式連接的多聚泛素化，而不影響Traf6總的泛素化水平及以K63方式連接的多聚泛素化[13、14]等。參考文獻（1）FanJG,FarrellGC.Epidemiologyofnon-alcoholicfattyliverdiseaseinchina.JHepatol.2009;50:204-210.（2）LoriaP,LonardoA,AnaniaF.Liveranddiabetes.Aviciouscircle.HepatolRes.2013;43:51-64.（3）CusiK.Treatmentofpatientswithtype2diabetesandnon-alcoholicfattyliverdisease:Currentapproachesandfuturedirections.Diabetologia.2016;59:1112-1120.（4）PetersenPH,ZouK,HwangJK,JanYN,ZhongW.Progenitorcellmaintenancerequiresnumbandnumblikeduringmouseneurogenesis.Nature.2002Oct31;419(6910):929-34.（5）PetersenPH,ZouK,KraussS,ZhongW.ContinuingroleformouseNumbandNumblinmaintainingprogenitorcellsduringcorticalneurogenesis.Natureneuroscience.2004Aug;7(8):803-11.（6）KuoCT,MirzadehZ,Soriano-NavarroM,RasinM,WangD,ShenJ,SestanN,Garcia-VerdugoJ,Alvarez-BuyllaA,JanLY,JanYN.PostnataldeletionofNumb/Numblikerevealsrepairandremodelingcapacityinthesubventricularneurogenicniche.Cell.2006Dec15;127(6):1253-64.（7）vanLessenM,NakayamaM,KatoK,KimJM,KaibuchiK,AdamsRH.Regulationofvascularendothelialgrowthfactorreceptorfunctioninangiogenesisbynumbandnumb-like.Arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology.2015Aug;35(8):1815-25.（8）ZhaoC,GuoH,LiJ,MyintT,PittmanW,YangL,ZhongW,SchwartzRJ,SchwarzJJ,SingerHA,TallquistMD,WuM.Numbfamilyproteinsareessentialforcardiacmorphogenesisandprogenitordifferentiation.Development.2014Jan;141(2):281-95.（9）TaoT,ChengC,JiY,XuG,ZhangJ,ZhangL,ShenA.NumblinhibitsgliomacellmigrationandinvasionbysuppressingTRAF5-mediatedNF-kappaBactivation.Molecularbiologyofthecell.2012Jul;23(14):2635-44.（10）YingjieL,JianT,ChanghaiY,JingboL.Numblikeregulatesproliferation,apoptosis,andinvasionoflungcancercell.Tumourbiology:thejournaloftheInternationalSocietyforOncodevelopmentalBiologyandMedicine.2013Oct;34(5):2773-80.（11）ZhongW,JiangMM,WeinmasterG,JanLY,JanYN.DifferentialexpressionofmammalianNumb,NumblikeandNotch1suggestsdistinctrolesduringmousecorticalneurogenesis.Development.1997May;124(10):1887-97.rogenitorcellmaintenancerequiresnumbandnumblikeduringmouseneurogenesis（12）LiuL,LannerF,LendahlU,DasD.NumblikeandNumbdifferentiallyaffectp53andSonicHedgehogsignaling.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications.2011Sep30;413(3):426-31.（13）MaQ,ZhouL,ShiH,HuoK.NUMBLinteractswithTAB2andinhibitsTNFalphaandIL-1beta-inducedNF-kappaBactivation.Cellularsignalling.2008Jun;20(6):1044-51.（14）ZhouL,MaQ,ShiH,HuoK.NUMBLinteractswithTRAF6andpromotesthedegradationofTRAF6.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications.2010Feb12;392(3):409-14。技術實現(xiàn)要素：為解決上述現(xiàn)有技術的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種炎癥抑制因子Numbl基因的表達與脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之間的相互關系，提供一個用于治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因Numbl的新用途，進而把Numbl基因應用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治療。本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)：本發(fā)明以野生型C57小鼠與肝臟細胞特異性Numbl基因敲除小鼠（簡稱Numbl-LKO）為實驗對象，通過高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型（dietinducedobesity，DIO）研究Numbl基因的功能，結果發(fā)現(xiàn)與野生型WT小鼠對比，肝臟細胞特異性Numbl基因敲除小鼠表現(xiàn)出肥胖，其體重、空腹血糖水平及胰島素水平明顯高于同種飼料飼養(yǎng)的WT小鼠。進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗發(fā)現(xiàn)肝臟細胞特異性Numbl基因敲除小鼠對葡萄糖的耐受能力明顯減弱。小鼠肝臟重量和肝臟/體重比以及脂質成分含量測定的結果等均說明HFD組（Highfatdiet，高脂飲食）的Numbl-LKO小鼠脂肪肝病變明顯嚴重，脂質蓄積顯著增加。這表明肝臟細胞特異性Numbl基因敲除會加劇脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，肝臟細胞特異性Numbl基因能夠抑制脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。本發(fā)明人的研究證明了：在高脂誘導的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，Numbl具有抑制肥胖，降低血糖，減少肝臟脂質蓄積，特別是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。針對Numbl的上述功能，提供Numbl作為藥物靶標在篩選保護肝臟及糖代謝的藥物中的應用。針對Numbl的上述功能，提供Numbl作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應用。以上藥物是指能夠促進Numbl基因表達的藥物。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：（1）本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Numbl基因的新功能，即Numbl基因具有能夠保護脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。（2）基于Numbl在保護脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。附圖說明圖1是肝臟特異性Numbl基因敲除小鼠構建策略圖。圖2是WT和Numbl-LKO小鼠的體重、空腹血糖和空腹胰島素結果圖；A為小鼠體重結果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計圖，C為空腹胰島素水平統(tǒng)計圖（*：p＜0.05vsWTNC組，**：p＜0.01vsWTNC組，#：p＜0.05vsWTHFD組，##：p＜0.01vsWTHFD組）。圖3是WT和Numbl-LKO小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結果圖；A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時間點小鼠血糖水平統(tǒng)計圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積（areaunderthecurve，AUC）比較圖（**：p＜0.01vsWTNC組，##：p＜0.01vsWTHFD組）。圖4是Numbl-LKO和WT小鼠的肝臟重量和肝臟脂質含量；A為肝臟重量、肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計柱狀圖，B為肝臟甘油三酯、肝臟膽固醇和肝臟游離脂肪酸統(tǒng)計柱狀圖（##：p＜0.01vsWTHFD組）。具體實施方式通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內容。實驗用動物及飼養(yǎng)：實驗動物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6小鼠（WT）和Numbl肝臟特異性基因敲除（Numbl-LKO）小鼠，雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，Numbl肝臟特異性基因敲除小鼠（Numbl-LKO）由Numbl-floxed小鼠與受蛋白啟動子控制、肝細胞特異性表達的Cre轉基因小鼠Albumin-Cre（購自TheJacksonLaboratory，貨號003574）雜交得到，構建策略見圖1。肝臟特異性Numbl基因敲除小鼠的構建：根據(jù)基因信息，利用CRISPRDesign（網(wǎng)址：http://crispr.mit.edu/）分別在內含子2和3中各設計一個CRISPR的打靶位點。靶序列分別為：Numbl-sgRNA1:TTTAGAGTTTTAGACGTCCAGGGNumbl-sgRNA2:AGCACATTGCCTGCACACGCTGG此外還設計了一個用于同源修復的供體質粒（DonorVector），它包括兩側同源臂、中間的外顯子3以及兩個同向的loxp序列。①打靶載體的構建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經過限制性內切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個T7啟動子，可以用于后續(xù)的體外轉錄實驗。②條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII（NEB，R0104L）和EcoRV（NEB，R0195L）雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測序正確的載體用BamHI（NEB，R0136L）和SpeI（NEB，R0133L）雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。供體載體（DonorVector）的構建：根據(jù)引物設計原則，設計如下引物（表1）用于擴增供體載體的左右同源臂（LA和RA）以及中間的外顯子部分（M）。擴增得到的產物經表1中所示限制性內切酶酶切后得到3個片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到DonorVector。引物名稱引物序列酶切位點NumblLA-FCCGCTCGAGCCAAAGAATGACCTGGGAAAXhoINumblLA-RCCCAAGCTTCCAGGGTTTGAATGGGAAGAHindIIINumblM-FTCTACCGGTACGTCTAAAACTCTAAAGCCCATGAgeINumblM-RACGCTTAAGCGCTGGGCCTCACACTCAflIINumblRA-FCGACGCGTTGTGCAGGCAATGTGCTTACMluINumblRA-RATAAGAATGCGGCCGCGAGGAAACGGGAGACACAGANotI表1構建供體載體所需引物序列及對應酶切位點打靶載體的轉錄：對CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個部分（負責切割作用的Cas9蛋白和引導Cas9蛋白定位到靶位點的gRNA）分別進行轉錄。對于Cas9蛋白，將其表達載體（pST1374-Cas9）用PmeI進行酶切，以純化后回收線性化質粒為轉錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒（AM1345，Ambion）進行體外轉錄，獲得加帽的mRNA產物。并用Poly(A)Tailing試劑盒（Ambion）對上述產物加尾，獲得成熟的mRNA產物；對于sgRNA，使用MEGAshortscript?Kit（AM1354，Ambion公司）進行體外轉錄。將轉錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit（Qiagen，217084）進行純化。Numbl-floxed條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產物與供體質粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內進行培育。得到的小鼠進行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機挑選一只作為F0代進行后續(xù)的繁殖，最終獲得Numbl-floxed純合小鼠。肝臟特異性Numbl基因敲除小鼠的制作將上述Numbl-floxed小鼠與肝臟特異性Albumin-Cre轉基因小鼠交配，篩選得到Numblfloxed/floxed/ALB-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導Cre酶的表達，Cre酶特異性的識別兩個同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個loxp，最后得到肝臟細胞特異性Numbl基因敲除小鼠。實驗動物飼料配方：高脂飼料（HFD）（購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12942）：熱量百分比：蛋白質:20%；碳水化合物:20%；脂肪:60%，總的熱量質量比:5.24kcal/g。低脂飼料（NC）（購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B）：熱量百分比：蛋白質:20%；碳水化合物:70%；脂肪:10%，總的熱量質量比:3.85kcal/g。飼養(yǎng)環(huán)境及條件：SPF級實驗動物中心，室溫在22-24℃之間，濕度在40-70%之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食?！緦嵤├?】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型（dietinducedobesity，DIO）獲得（1）實驗動物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和Numbl-LKO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料（Highfatdiet，HFD）和D12450B低脂飼料（Normalchow，NC）飼養(yǎng)，即WTNC組，LKONC組，WTHFD組，LKOHFD組共4個組別。（2）模型通過高脂飼料誘導操作流程：采用WT和LKO小鼠，建立DIO模型，進行表型相關分析，明確Numbl基因對脂肪肝、Ⅱ型糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和Numbl-LKO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料（Highfatdiet，HFD）和D12450B低脂飼料（Normalchow，NC）飼養(yǎng)，即WTNC組，LKONC組，WTHFD組，LKOHFD組共4個組別。每周均詳細記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔1周檢測1次。實驗第10周，進行腹腔注射葡萄糖實驗（IPGTT），以評價小鼠機體對葡萄糖耐受能力，第12周終末取材?！緦嵤├?】小鼠體重、血糖水平測定（1）小鼠空腹體重檢測1）體重檢測。①禁食：上午8:00將待實驗小鼠禁食（不禁水），下午2:00開始實驗操作。②稱重：分別在第0周、2周、4周、6周、8周、10周和12周稱重，將一塑料小桶放在動態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測量體重記錄數(shù)據(jù)。（2）空腹血糖水平檢測實驗將所有待實驗的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食（不禁水），即禁食6小時后開始實驗操作。①血糖儀準備：檢查血糖儀（美國強生公司，ONETOUCH）電池，按右側開關，將試紙正確放入左側插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進入待測狀態(tài)。②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對折，用拇指和食指捏住毛巾對折處，將鼠頭部和身體包入手掌內的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。④血糖檢測：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計時5秒顯示讀數(shù)。（3）空腹血清胰島素水平檢測①試劑及耗材準備：樣品（冰凍血清），去離子水一瓶（1000mL），小鼠胰島素ELISA試劑盒（Millipore，貨號EZRMI-13K）含胰島素ELISA酶標板（1塊，儲存于2-8℃）、酶標板封口膜（1片）、10×HRP洗脫緩沖液（2瓶，每瓶50mL,使用前使用去離子水稀釋10倍）、胰島素標準品（濃度為：0.2，0.5，1，2，5，10ng/mL，每種量為0.25mL）、胰島素質量對照buffer（0.25mL）、基質溶液（0.5mL）、分析緩沖液（20mL）、胰島素檢測抗體（10mL）、酶溶液（12mL）、底物（12mL）、終止溶液（12mL）。②實驗步驟：A.確認溫箱開啟，熟悉酶標儀操作，將待檢測的血清標本從-80℃冰箱中找出；B.將待檢測的血清在室溫下復融至液態(tài)，準備檢測；C.稀釋10×HRP洗脫緩沖液，每瓶用450mL去離子水稀釋；D.將取下來的酶標板條安裝到一個空的酶標板架上300μLTBS洗脫緩沖液洗滌3次。洗滌完畢將酶標板倒扣在吸水紙上，輕輕拍幾次，將殘液吸凈（注意：在進行下一步之前避免酶標板干燥，將未使用的酶標板條密封在裝酶標板的袋子里，2-8℃保存）；E.將10μL分析緩沖液加入非特異性孔(NSB)和所有的樣品孔；F.在NSB孔，標準孔和對照孔加入10μL基質溶液；G.在預設的標準孔里加入10μL胰島素標準品；H.在預設的質量對照孔里加入胰島素質量對照buffer1和2各10μL；I.在每個樣品孔里加入10μL樣品；J.每孔中加入80μL胰島素檢測抗體（以上所有加樣步驟在1個小時之內完成，室溫孵育2小時，在此期間將酶標板至于酶標板振蕩器上，調整轉速為400-500rpm震蕩）；K.取下封口膜，棄去液體，在吸水紙上輕輕拍打，吸凈殘液；L.使用洗脫緩沖液洗板3次，每次300μL，每次洗板完畢都用吸水紙吸去殘液；M.每孔加入酶溶液100μL，封口膜封口后，室溫下酶標板振蕩器震蕩30分鐘，取下封口膜，棄去溶液，拍打吸干；N.使用洗脫緩沖液洗板6次，每次300μL，每次洗板完畢都用吸水紙吸去殘液加入100μL底物溶液，酶標板震蕩器上震蕩15分鐘左右。此時可以看到標準孔出現(xiàn)深淺漸變的藍色。（注意：在這一步，藍色的出現(xiàn)和進展可能明顯快于15分鐘，也可能明顯慢于15分鐘，取決于室溫溫度。請通過視覺來判斷孵育的時間。或者使用酶標儀370nm波長檢測，讀數(shù)在1.2到1.8之間，則為合適的孵育時間）O.加入100μL終止溶液，震蕩酶標板確保充分的混勻，此時藍色變?yōu)辄S色。5分鐘內在450nm和590nm處分別讀取吸光值。根據(jù)測定的標準曲線，通過吸光值換算出濃度。Ⅱ型糖尿病損傷嚴重程度的評估指標主要包括體重、血糖和胰島素等水平，體重、血糖、胰島素水平變化結果如圖2所示，WT小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始體重明顯高于其NC飼料組，給與Numbl-LKO小鼠12周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第6周開始HFD組的Numbl-LKO小鼠體重明顯高于HFD組的WT小鼠體重，一直持續(xù)到第12周（見圖2A）；經空腹血糖檢測發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第2周、4周、6周、8周、10周和12周的空腹血糖水平明顯較相應NC對照組升高，HFD組的Numbl-LKO小鼠空腹血糖水平也明顯高于WT組（見圖2B）；經空腹胰島素檢測發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠在第12周的空腹血糖水平明顯較相應NC對照組升高，HFD組的Numbl-LKO小鼠空腹胰島素水平也明顯高于WT組小鼠（見圖2C）。以上結果表明肝臟細胞特異性Numbl基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，即Numbl基因能顯著提高小鼠的糖代謝能力。因此，Numbl基因在高脂誘導引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用?！緦嵤├?】葡萄糖耐量實驗（intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT）實驗第10周，進行腹腔注射葡萄糖實驗（IPGTT），以評價小鼠機體對糖耐受能力。（1）在測血糖之前，先測量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計算葡萄糖的注射體積。（2）先檢測葡糖糖注射前即0分鐘時空腹血糖，在檢測完畢后迅速經腹腔注射葡萄糖液。（3）腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進針定位及注射：從腹部一側進針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進針，回抽，注射時針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側進入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉針頭，防止漏液。（4）分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時間點剪尾測小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測時間。進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗（intraperitonealglucosetolerancetests，IPGTT）來評估各組小鼠對葡萄糖的處理能力，在實驗第10周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和Numbl-LKO小鼠血糖水平在15分鐘時間點劇增達到峰值，隨著時間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平（0分鐘時血糖），在2小時時恢復至空腹血糖水平；且在HFD組，Numbl-LKO小鼠血糖水平一直高于WT小鼠的血糖水平（圖3A）。比較各組小鼠血糖曲線下面積（areaunderthecurve，AUC），發(fā)現(xiàn)WT小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，Numbl-LKOHFD組的AUC顯著大于WTHFD組的AUC（圖3B），表明Numbl對維持糖代謝穩(wěn)態(tài)具有強大的調控能力?！緦嵤├?】肝臟質量及肝臟組織脂質成分測定（1）終末肝臟組織取材1）小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤濕。2）用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。3）迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速稱重。（2）肝臟脂質成分測定①從-80℃冰箱取出肝臟組織樣品，稱量50mg組織，使用研磨器將肝臟組織研磨成粉末狀，溶于1mLPBS中，混勻后再與1mL氯仿/甲醇（2:1）共孵育過夜。②以12000g高速離心15min后，收集管底脂質層物質，風干，以去除水分。③將分離出的脂質層物質溶于200μL含1%TritonX-100的PBS溶液中，仔細吹吸混勻。④開啟電腦labman軟件，打印機，再開啟生化分析儀；⑤選擇并清洗檢測探針、比色杯等，保證探針通暢、比色杯無雜質附著，吸光值在設定的參考范圍；⑥在labman軟件上檢查所需檢測指標試劑是否足夠，設定檢測指標和檢測順序等。⑦將制得的混勻液上機檢測，分析。在HFD組的Numbl-LKO小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的WT小鼠高（如圖4A）。對肝臟中的甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸進行檢測，發(fā)現(xiàn)在HFD組的Numbl-LKO小鼠肝臟中的甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸均較HFD組的WT小鼠高（如圖4B）。這些結果說明肝臟細胞特異性Numbl基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化。上述結果顯示Numbl-LKO小鼠在HFD的誘導下發(fā)生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變顯著加重。這些結果表明Numbl基因對改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有顯著的作用。本發(fā)明結果說明Numbl基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的保護作用。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>武漢大學<120>炎癥抑制因子Numbl在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應用<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>Numbl-sgRNA1<400>1tttagagttttagacgtccaggg23<210>2<211>23<212>DNA<213>Numbl-sgRNA2<400>2agcacattgcctgcacacgctgg23<210>3<211>54<212>DNA<213>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>loxp2-<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>loxp2-F<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>loxp2-R<400>6ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>7<211>29<212>DNA<213>NumblLA-F<400>7ccgctcgagccaaagaatgacctgggaaa29<210>8<211>29<212>DNA<213>NumblLA-R<400>8cccaagcttccagggtttgaatgggaaga29<210>9<211>33<212>DNA<213>NumblM-F<400>9tctaccggtacgtctaaaactctaaagcccatg33<210>10<211>26<212>DNA<213>NumblM-R<400>10acgcttaagcgctgggcctcacactc26<210>11<211>28<212>DNA<213>NumblRA-F<400>11cgacgcgttgtgcaggcaatgtgcttac28<210>12<211>36<212>DNA<213>NumblRA-R<400>12ataagaatgcggccgcgaggaaacgggagacacaga36當前第1頁1 2 3