本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)，特別涉及一種以芫花酯甲為活性成分的干粉吸入制劑，該制劑可以提高藥效，濃集藥物濃度，減少對(duì)非靶部位的毒副作用。

背景技術(shù)：

肺癌是目前最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率和死亡率都呈上升態(tài)勢(shì)，這種趨勢(shì)在中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家尤為顯著。在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率和死亡率已居所有惡性腫瘤之首，其中男性發(fā)病率和死亡率均居第一位，女性發(fā)病率居第二位(僅低于乳腺癌)，死亡率則居第一位。工業(yè)化迅速發(fā)展導(dǎo)致的環(huán)境污染和居高不下的吸煙率使得肺癌對(duì)我國(guó)居民的危害在逐漸增大，為了控制肺癌發(fā)病率和死亡率的增長(zhǎng)，我國(guó)衛(wèi)生部已將肺癌列為今后癌癥防治的重點(diǎn)

目前，肺癌的治療手段主要包括：手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療、介入治療等，雖然根治性手術(shù)至今仍是唯一有可能治愈肺癌患者的方式，但是中醫(yī)藥在穩(wěn)定瘤灶、延長(zhǎng)帶瘤生存時(shí)間、減輕放化療毒副作用等方面表現(xiàn)出了一定的療效和優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為肺癌治療的重要組成部分，我們的研究就主要集中在中草藥中某些成分治療肺癌的可行性。

芫花為瑞香科植物，主要有效成分為植物中罕見(jiàn)的瑞香烷型二砧原酸酯類(lèi)化合物，包括芫花酯甲(yuanhuacine)、芫花酯乙(yuanhuadine)、芫花酯丙(yuanhuafine)、芫花酯丁(yuanhuatine)、芫花酯戊(yuanhuapine)，主要成分為芫花酯甲，早期主要用于中期妊娠引產(chǎn)和利尿等作用。前期研究表明，芫花酯甲對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，其結(jié)構(gòu)與喜樹(shù)堿類(lèi)完全不同,屬于新結(jié)構(gòu)類(lèi)型的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑。Zha-Jun Zhan等報(bào)道了芫花酯甲對(duì)P-388淋巴白血病細(xì)胞(IC50 30.0μM),人肺癌A-549(IC50 0.15μM)和人血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC(IC50 14.0μM)的體外抑制活性，結(jié)果顯示其對(duì)肺癌抑制活性最為顯著。韓國(guó)癌癥研究所Bo-Young Park等研究了芫花酯甲對(duì)HL-60人早幼骨髓性白血病細(xì)胞(IC50 10.8μM)和SNU-1胃癌細(xì)胞的體外抑制活性(IC50 13.7μM)，結(jié)果顯示其抗癌活性顯著，證明其能夠激活細(xì)胞凋亡過(guò)程，包括DNA斷裂，染色質(zhì)凝聚，使細(xì)胞周期停止在G1期。

如上所述，芫花酯甲是一種罕見(jiàn)的全新天然結(jié)構(gòu)骨架的抗腫瘤活性成分，體外抗癌活性強(qiáng)于與其它臨床常用的天然抗癌藥物。芫花酯甲治療癌癥的作用雖令人鼓舞，但在使用的同時(shí)依然存在嚴(yán)重的毒副作用，對(duì)皮膚及粘膜有一定的刺激性，有一定的細(xì)胞毒性，同時(shí)給藥后對(duì)肝臟和腎臟等器官均有較大的毒性甚至還存在一定的生殖毒性，對(duì)人體的傷害較大，這就為應(yīng)用芫花酯甲治療肺癌帶來(lái)了不便。

肺部給藥治療呼吸系統(tǒng)局部疾病在臨床上的應(yīng)用由來(lái)已久，局部給藥能直接將藥物運(yùn)送至肺部發(fā)揮藥效，一方面可減少治療肺部疾病的藥物用量，另一方面也可以減小藥物的全身毒副作用，是治療呼吸系統(tǒng)疾病理想的給藥途徑，廣泛的應(yīng)用于治療肺炎、肺癌、哮喘、急性肺損傷等肺部局部疾病。近些年來(lái)，干粉吸入劑(dry powder inhalation,DPI)已逐漸成為肺部給藥研究的關(guān)注點(diǎn)，干粉吸入劑是指微粉化藥物或與載體以膠囊、泡囊或多劑量貯庫(kù)形式，采用特制的干粉吸入裝置，由患者主動(dòng)吸入霧化藥物至肺部的制劑，可發(fā)揮局部或全身作用。

在干粉吸入劑中由于微粉化后的藥物粒徑小，易團(tuán)聚而難以分散，流動(dòng)性不佳，穩(wěn)定性無(wú)法保證，因此，性能優(yōu)良的載體是提高藥物粉末霧化效果和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。常用的材料主要分為四類(lèi)：碳水化合物、氨基酸類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)?，F(xiàn)有的研究表明DPI中粗糙乳糖和細(xì)粉乳糖的比例對(duì)其肺部沉積量有著顯著的影響，研究發(fā)現(xiàn)，重結(jié)晶乳糖表面細(xì)粉顆粒濃度增加使得表面更為粗糙，有效改善藥物在肺部的沉積，但是載體乳糖的粒徑過(guò)小無(wú)法改善藥物的分散性，粒徑過(guò)大，則由于慣性碰撞會(huì)沉積在呼吸道的上部，影響對(duì)藥物的輸送能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決芫花酯甲在治療肺癌時(shí)所帶來(lái)的許多毒性等問(wèn)題，克服在應(yīng)用上的障礙，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，創(chuàng)新性的將芫花酯甲用于肺部給藥，選用乳糖作為芫花酯甲干粉吸入劑DPI的載體材料。并且本發(fā)明在體外通過(guò)新一代的藥用撞擊器，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選肺部給藥干粉吸入劑處方，模擬活體的肺部給藥方式，篩選最佳的處方工藝，使得藥物最大可能的沉積于肺泡，用于藥物的肺部給藥。

技術(shù)方案：為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

一種具有抗肺癌活性的干粉吸入劑，它包括芫花酯甲和乳糖載體，所述的乳糖載體由直徑大于110μm的粗糙乳糖和直徑為4-11μm的細(xì)粉乳糖混合制成。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗肺癌活性的干粉吸入劑，芫花酯甲的重量份數(shù)為1，乳糖載體的重量份數(shù)為1-10。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗肺癌活性的干粉吸入劑，直徑大于110μm的粗糙乳糖和直徑為4-11μm的細(xì)粉乳糖的重量比為5-50:1。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗肺癌活性的干粉吸入劑，干粉吸入劑通過(guò)干粉吸入裝置給藥。

有益效果：本發(fā)明提供的以芫花酯甲為活性成分的抗肺癌活性的干粉吸入劑與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明創(chuàng)新的將芫花酯甲制成肺部局部給藥，能直接將芫花酯甲運(yùn)送至肺部發(fā)揮藥效，可減少治療肺部疾病的藥物用量，提高在靶部位的濃度，減小藥物的全身毒副作用，安全性更高，不良反應(yīng)更低。

2、本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，選用乳糖作為芫花酯甲干粉吸入劑DPI的載體材料，并且本發(fā)明在體外通過(guò)新一代的藥用撞擊器，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選肺部給藥干粉吸入劑處方用量，模擬活體的肺部給藥方式，篩選最佳的處方工藝。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中芫花酯甲的結(jié)構(gòu)示意圖圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中不同處方芫花酯甲干粉吸入劑DPI的FPF值；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中芫花酯甲兩種不同給藥方式的組織分布圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中芫花酯甲兩種不同給藥方式的相對(duì)攝取效率圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中芫花酯甲兩種不同給藥方式在靶組織的峰濃度比。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：芫花酯甲的液相條件及標(biāo)曲的建立

試驗(yàn)采用芫花酯甲原料藥，結(jié)構(gòu)式如圖1，建立液相分析條件，色譜柱：Merck C18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流動(dòng)相：甲醇—水(82:18)，柱溫為40℃，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)233nm，進(jìn)樣量20μL。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A＝19910C-12788(r²＝1，準(zhǔn)確度、精密度和回收率良好，符合分析方法要求)，線性范圍2.5-80μg/mL。

實(shí)施例2：芫花酯甲干粉吸入劑的制備

處方中所使用的乳糖為粗糙乳糖(d＞110μm)和細(xì)粉乳糖(d:4-11μm)，通過(guò)改變兩者的比例后制成干粉吸入劑(DPI)，以考察乳糖粒徑對(duì)芫花酯甲DPI肺部給藥性能的影響，五種處方見(jiàn)下表，稱(chēng)取處方量的粗糙乳糖和細(xì)粉乳糖，各處方均并按芫花酯甲與總?cè)樘堑闹亓糠輸?shù)為1：5稱(chēng)取芫花酯甲，混合均勻。

表1不同比例的粗糙乳糖與細(xì)粉乳糖的芫花酯甲DPI處方

實(shí)施例3：藥用撞擊器對(duì)芫花酯甲干粉吸入制劑處方篩選實(shí)驗(yàn)方法

將實(shí)施例2中的各處方分別制成20粒含藥膠囊，每粒膠囊中含有粉末50mg。用NGI裝置在60L/min的流速模擬人體肺部給藥，用50％的甲醇水沖洗各個(gè)收集盤(pán)和適配器等部件，12000r/min離心5min后取上清液置于液相小瓶中，用于芫花酯甲DPI體外肺部沉積量的測(cè)定。進(jìn)樣后計(jì)算NGI裝置各級(jí)的藥物沉積量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2：不同處方的芫花酯甲DPI在NGI裝置中的各級(jí)沉積量

體外沉積率FPF的計(jì)算結(jié)果

體外沉積率(FPF)是考察DPI空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布的最直觀的指標(biāo)，能夠用以表征DPI在肺部的有效沉積量。FPF是指60L/min標(biāo)準(zhǔn)流速條件下，能沉積到肺部的有效微細(xì)粒子劑量，在數(shù)據(jù)計(jì)算中則表現(xiàn)為二到七級(jí)的藥物沉積量之和，將二到七級(jí)的藥物沉積量加和得到各個(gè)處方DPI的FPF值，根據(jù)規(guī)定FPF值在大于12％時(shí)可以有效的沉積于肺部，見(jiàn)圖2，由圖2可知，隨著細(xì)粉乳糖比例的增加，該DPI的FPF值一開(kāi)始呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)細(xì)粉乳糖的量達(dá)到9.1％(即粗糙乳糖量：細(xì)粉乳糖量＝10:1)的時(shí)候，F(xiàn)PF值又開(kāi)始下降，據(jù)此趨勢(shì)可知，在5-50：1范圍內(nèi)，F(xiàn)PF均符合要求，且當(dāng)細(xì)粉乳糖的量達(dá)到9.1％時(shí)，該DPI有最高的FPF值，能夠沉積在肺部的藥物量最高，表明能夠到達(dá)肺部發(fā)揮療效的芫花酯甲量最多。

實(shí)施例4：芫花酯甲DPI肺部吸入及靜脈注射后組織分布研究

實(shí)驗(yàn)藥物配置：選取實(shí)施例3中的處方三(粗糙乳糖量：細(xì)粉乳糖量＝10:1)制備DPI，芫花酯甲與總?cè)樘堑闹亓勘葹?:5。另精密稱(chēng)取芫花酯甲2mg，用一定量的DMSO溶解，再用生理鹽水稀釋至75μg/mL用于靜脈注射芫花酯甲。

D大鼠雌雄各半，分為2組，每組72只，一組尾靜脈注射芫花酯甲，另外一組肺部吸入芫花酯甲，劑量為100μg/kg,于給藥后1、2、3、4、6、9h將大鼠處死。處死大鼠后取心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸(子宮，卵巢)，用生理鹽水洗凈，隨后用濾紙吸干殘留生理鹽水。

取大鼠各組織樣品(心、肝、脾、肺、腎、腦、子宮、卵巢、睪丸)，稱(chēng)重，按組織重量與生理鹽水體積比為1:3加入生理鹽水制成勻漿液，吸取各組織勻漿液100μL于2mL的尖底離心管中，加入內(nèi)標(biāo)液10μL，400μL的Na2CO3溶液(0.02M)搖振，再加入1mL的萃取試劑(乙醚：二氯甲烷＝8:1)，渦旋混合5min，離心(12000r/min)5min，上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，37℃旋轉(zhuǎn)濃縮至干，殘?jiān)?00μL甲醇復(fù)溶，離心(12000r/min)5min，取上清液用于UHPLC-MS/MS分析。

組織分布圖，見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芫花酯甲在脾，肺，腎以及雌性生殖系統(tǒng)中均有分布，在心，肝，腦和睪丸中幾乎檢測(cè)不到，同時(shí)由圖3可以看出芫花酯甲肺部吸入后在肺部的濃度顯著高于靜脈注射，同時(shí)可大大降低在脾，腎和生殖系統(tǒng)的濃度。

靶向評(píng)價(jià)參數(shù)可以更直觀地評(píng)價(jià)給藥系統(tǒng)的靶向性，本實(shí)驗(yàn)采用了相對(duì)攝取率、峰濃度比、靶向效率以及相對(duì)靶向效率四個(gè)指標(biāo)對(duì)制劑的肺靶向性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如下：

1.相對(duì)攝取率(relative ratio,Re)考察的是兩種給藥方式在肺組織中AUC的比值，即Re＝(AUCTT)p/(AUCTT)i,其中，TT表示靶組織(targeting tissue)，p表示肺部給藥組(pulmonary administration)，i表示靜脈給藥組(intravenous administration)。Re大于1表示肺部給藥組相對(duì)于靜脈給藥組對(duì)肺組織有靶向性，Re越大靶向性越強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。RE＝6.1，肺部給藥組在肺組織中的相對(duì)攝取率大于1，表明肺部給藥組相對(duì)于靜脈給藥組，具有一定的肺靶向性。

2.峰濃度比(concentration ratio，Ce)考察的是兩種給藥方式在靶組織中Cmax的比值,即Ce＝(CmaxTT)p/(CmaxTT)i，其中，TT表示靶組織(targeting tissue)，p表示肺部給藥組(pulmonary administration)，i表示靜脈給藥組(intravenous administration)。峰濃度比Ce值表明制劑改變藥物分布的效果，Ce值越大，表明改變藥物分布的效果越明顯。肺部給藥組相對(duì)于靜脈給藥組的峰濃度比如圖5所示，Ce＝5.07。相對(duì)于靜脈給藥組，肺部給藥組能改善芫花酯甲在肺組織的分布。

3.靶向效率(targeting efficiency,Te)是同一種給藥方式在靶組織中的AUC與非靶組織的AUC的比值，即Te＝AUC_TT/AUCN_TT，其中TT表示靶組織(targeting tissue)，NTT表示非靶組織(non-targeting tissue)。Te值越大，則表明相對(duì)于被比較的非靶組織，該給藥方式對(duì)靶組織的選擇性越強(qiáng)。靜脈給藥組和肺部給藥組的靶向效率如表3所示。

表3芫花酯甲不同給藥方式在大鼠各組織中的靶向效率

以肺為靶組織，其它組織為非靶組織計(jì)算得到靶向效率Te，如以上表3所示，它反映了靜脈給藥和肺部給藥對(duì)于肺組織的選擇性，可見(jiàn)藥物顯著濃集于肺部，且在腎及生殖系統(tǒng)中的濃度較小，從而毒性較小。