本發(fā)明涉及細菌疫苗領(lǐng)域，具體地，涉及一種泛耐藥菌的納米疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
納米疫苗是當今生命科學研究的熱點之一,是基于納米技術(shù)研發(fā)的一種新型疫苗,具有安全、穩(wěn)定、高效、無需佐劑等特點,具有良好的發(fā)展前景。
納米疫苗血清穩(wěn)定性良好，且納米疫苗接種后，啟動完全模擬病原體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生針對此種病原體的高滴度的特異性抗體及記憶性B細胞。當病原體感染免疫過的動物時，動物不會出現(xiàn)感染性疾病。
但是，目前只有使用細菌外膜囊泡包被的納米顆粒。由于在不同的培養(yǎng)條件下，得到的外膜囊泡成分不一樣。而且細菌外膜囊泡上含有的抗原只是細胞膜上的部分抗原。所以使用外膜囊泡包被納米顆粒制備的疫苗存在不足。
此外，對于細菌外膜囊泡，僅G-菌和少部分G+可以分泌外膜囊泡，故而，使用外膜囊泡來制備細菌疫苗無法普遍的適用于所有細菌，故而，使該種制備疫苗的方法受到限制。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在克服上述缺陷，提供應(yīng)用前景廣闊的納米疫苗。
具體地，本發(fā)明提供的一種泛耐藥菌的納米疫苗，其特征在于：由細菌細胞膜和納米顆粒組成；
其中，上述細菌細胞膜包裹于納米顆粒的外表面。
該納米顆?？蛇x自任何可作為生物載體等功能的納米材料，優(yōu)選如：金屬納米顆粒、蛋白納米顆粒、高分子納米顆粒等。
另外，本發(fā)明還提供了上述一種泛耐藥菌的納米疫苗的制備方法，其特征在于：在機械力的作用下，采用擠入包裹的方式，將細菌細胞膜包被于納米顆粒的表層形成細菌疫苗。
進一步地，本發(fā)明提供的一種泛耐藥菌的納米疫苗的制備方法，還具有這樣的特點：即、上述細菌細胞膜的用量為納米顆粒的表面積與細菌細胞膜的表面積比值的1-1.5倍。即、根據(jù)不同納米顆粒的表面積/平均表面的大小，以及不同分離獲得的細菌細胞膜的表面積/平均表面的大小，通過計算機計算的方式計算出每個納米顆粒需要包裹的細菌細胞膜的數(shù)量后進行配比。
進一步地，本發(fā)明提供的一種泛耐藥菌的納米疫苗的制備方法，還具有這樣的特點：即、上述納米顆粒的粒徑為10-200nm優(yōu)選為30-100nm。
進一步地，本發(fā)明提供的一種泛耐藥菌的納米疫苗的制備方法，還具有這樣的特點：即、上述納米顆粒選自金屬納米顆粒、蛋白納米顆粒、高分子納米顆粒中的一種。
進一步地，本發(fā)明提供的一種泛耐藥菌的納米疫苗的制備方法，還具有這樣的特點：即、上述金屬納米顆粒選自納米金、納米銀、納米鐵；
上述蛋白納米顆粒來源于動物蛋白質(zhì)或植物蛋白質(zhì)；
上述高分子納米顆粒選自聚乳酸類高分子聚合物。
進一步地，本發(fā)明提供的一種泛耐藥菌的納米疫苗的制備方法，還具有這樣的特點：即、上述蛋白納米顆粒選自來源于酪蛋白、乳清蛋白膠原質(zhì)、雞卵清蛋白、牛血清蛋白、大豆蛋白、牛奶蛋白或小麥麥質(zhì)的蛋白納米材料中的一種。
進一步地，本發(fā)明提供的一種泛耐藥菌的納米疫苗的制備方法，還具有這樣的特點：即、上述高分子納米顆粒選自PGLC、PLGE、PLLA、PLGA中的一種。
進一步地，本發(fā)明提供的細菌疫苗的制備方法，還具有這樣的特點：即、具體制造方法如下所示：
步驟一、培養(yǎng)細菌；
步驟二、去除細胞壁；如：使用溶菌酶去除細胞壁等方案
步驟三、離心分離、收集細菌細胞膜。
步驟四、合成納米材料；該納米材料一般由熱聚法合成；也可以為使用現(xiàn)有的納米材料。
步驟五、將細菌細胞膜和納米顆?；旌?，在機械力的作用下，將細菌細胞膜包裹在納米顆粒表層。
該機械力攪拌的過程一般為0.5-72小時不等。
該過程一般通過多次過膜(如：7-10次左右)的方式來實現(xiàn)，其后采用透析過濾/超濾等類似的材料來實現(xiàn)，排除未成型的雜質(zhì)，獲得目標粒徑疫苗的結(jié)果。
進一步地，本發(fā)明提供的一種泛耐藥菌的納米疫苗的制備方法，還具有這樣的特點：即、在步驟一中，當細菌為含有莢膜的細菌時，通過調(diào)整培養(yǎng)條件(如：改變培養(yǎng)基成分，pH值，CO2濃度等條件)，使細菌不產(chǎn)生莢膜。
本發(fā)明的作用和效果：
本發(fā)明提供了一種全新的，采用細菌細胞膜制備的納米細菌疫苗。
所有的細菌都有細胞膜，而細菌細胞膜上含有病原體相關(guān)分子模式(PAMP)等，故而，使用完整的細菌細胞膜包被納米顆粒制備成納米疫苗，既減輕了病原體的毒性，又保留了完整的免疫相關(guān)的抗原表位。
而且納米顆粒結(jié)構(gòu)、形狀、大小便于控制。所以使用細菌細胞膜包被的納米疫苗有廣闊的應(yīng)用前景。
此外，常見多糖疫苗，使用提純的莢膜多糖，對于2歲以下的小孩和老年人，幾乎沒有免疫保護效果；多糖結(jié)合疫苗，對2歲以下小孩和老年人，有免疫保護作用，但是同時存在“載體蛋白誘導(dǎo)的表位抑制”。而針對“載體蛋白誘導(dǎo)的表位抑制”，常用的方法有增加免疫次數(shù)、加大免疫劑量，但是，其效果并不理想。
然，本發(fā)明提供的方法制造的納米疫苗有望緩解多糖結(jié)合疫苗常見的“載體蛋白誘導(dǎo)的表位抑制”這個問題。
此外，采用本發(fā)明的方法，可制備不同形狀和大小的細菌疫苗，例如，根據(jù)細菌的形態(tài)或大小來制造相似造型的納米顆粒后進行細胞膜的包裹。
具體實施方式
實施例一、基于肺炎克雷伯菌的細菌疫苗
1、細胞膜的收集
將-80℃凍存的肺炎克雷伯菌菌株接種于LB瓊脂平板，37℃孵箱孵育24h，挑取單個菌落于無菌LB液體培養(yǎng)基37℃搖床培養(yǎng)16h；轉(zhuǎn)移至1L無菌LB液繼續(xù)培養(yǎng)至D600nm為1.0。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液以1000×g，離心10min,收集沉淀。用新鮮的培養(yǎng)基輕微吹勻沉淀，轉(zhuǎn)移至新的容器中。使用溶菌酶去除細胞壁。以1000×g，離心10min,收集上清。
將Optiprep梯度離心液用50mmol/LHepes-150mmol/LNaCl稀釋至以下濃度：60％、40％、35％、30％、25％和20％。將收集的上清轉(zhuǎn)移至無菌超濾離心管中，50000×g，離心1h，將沉淀重懸于1ml 50mmol/LHepes(pH6.8)后與4.5ml60％Optiprep充分混勻后加入到35ml容量的無菌超濾離心管底部，在此之上從下至上小心加入以下密度的Optiprep梯度離心液：6mL40％、6mL35％、9mL30％、6mL25％和3mL20％Optiprep/10mmoL/Hepes-0.85％NaCl,100000×g,離心16h(4℃)，離心完畢后，吸取第二層和第三層交界面液體0.5mL保存于10mmol/L HEPES(pH6.8)中。低溫保存。
2、納米材料的合成
(1)、樣品瓶、轉(zhuǎn)子，二次水清洗后，超聲清洗。吹風機吹干，備用。透析缸清洗干凈，備用。
(2)、調(diào)整磁力加熱攪拌器，設(shè)定溫度為72℃，轉(zhuǎn)速為750r/min。
(3)、稱量5mg的OVA，使用二次水溶解至終濃度1mg/ml。
(4)、5ml的樣品瓶，加入小轉(zhuǎn)子，2.5ml的OVA，然后加入配制好的pH＝6.0的MES，至滿瓶。
(5)、樣品攪拌均勻后，預(yù)熱3次，每次約3s.
(6)、加熱約2min15s。待顏色達到估計約50nm時，取出樣品瓶，轉(zhuǎn)移至冰水混合物中終止反應(yīng)。
(6)動態(tài)光散射粒度儀測量粒徑。
(7)使用30k透析袋透析。
按細菌膜的表面面積進行計算機計算，將細菌細胞膜和1:1的50nm粒徑的OVA納米顆粒混合，在機械力的作用下，攪拌15分鐘，將細菌細胞膜包裹在納米顆粒表層，過膜7次。
實施例二、基于耐甲氧西林金葡菌的細菌疫苗
將-80℃凍存的耐甲氧西林金葡菌菌株接種于LB瓊脂平板，37℃孵箱孵育24h，挑取單個菌落于無菌LB液體培養(yǎng)基37℃搖床培養(yǎng)16h；轉(zhuǎn)移至1L無菌LB液繼續(xù)培養(yǎng)至D600nm為1.0.
將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液以1000×g，離心10min,收集沉淀，轉(zhuǎn)移至新的容器中。使用溶菌酶去除細胞壁。以1000×g，離心10min,收集上清。
將Optiprep梯度離心液用50mmol/LHepes-150mmol/LNaCl稀釋至以下濃度：60％、40％、35％、30％、25％和20％。將收集的上清轉(zhuǎn)移至無菌超濾離心管中，50000×g，離心1h，將沉淀重懸于1ml50mmol/LHepes(pH6.8)后與4.5ml60％Optiprep充分混勻后加入到35ml容量的無菌超濾離心管底部，在此之上從下至上小心加入以下密度的Optiprep梯度離心液：6mL40％、6mL35％、9mL30％、6mL25％和3mL20％Optiprep/10mmoL/Hepes-0.85％NaCl,100000×g,離心16h(4℃)，離心完畢后，吸取第二層和第三層交界面液體0.5mL保存于10mmol/L HEPES(pH6.8)中。低溫保存。
合成納米材料
(1)、樣品瓶、轉(zhuǎn)子，二次水清洗后，超聲清洗。吹風機吹干，備用。透析缸清洗干凈，備用。
(2)、調(diào)整磁力加熱攪拌器，設(shè)定溫度為72℃，轉(zhuǎn)速為750r/min。
(3)、稱量5mg的OVA，使用二次水溶解至終濃度1mg/ml。
(4)、5ml的樣品瓶，加入小轉(zhuǎn)子，2.5ml的OVA，然后加入配制好的pH＝6.0的MES，至滿瓶。
(5)、樣品攪拌均勻后，預(yù)熱3次，每次約3s.
(6)、加熱約2min40s。待顏色達到估計約100nm時，取出樣品瓶，轉(zhuǎn)移至冰水混合物中終止反應(yīng)。
(6)動態(tài)光散射粒度儀測量粒徑。
(7)使用30k透析袋透析。
按細菌膜的表面面積進行計算機計算，將細菌細胞膜和1:1.5的100nm粒徑的OVA納米顆?；旌?，在機械力的作用下，攪拌25分鐘，將細菌細胞膜包裹在納米顆粒表層，過膜10次。
在上述實施例中，還可將OVA納米顆粒替換粒徑為10-200nm不等的納米金或納米PLGE等納米材料。