本發(fā)明涉及基因治療和抗體生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及TMC/京尼平/pDNA納米載體及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

隨著社會經(jīng)濟的繁榮與進步，健康問題越來越受到人們的重視。在致命的10大疾病中，排名前幾的心臟病、惡性腫瘤、腦血管病變、糖尿病嚴重影響人們的生活，而且這些疾病還呈增長趨勢，死亡率也越來越高，趨向于年輕化，這些疾病常常會引起很多并發(fā)癥?；蛑委熃o人們帶來了曙光，從1990年至今，實現(xiàn)了在生物醫(yī)藥領(lǐng)域和臨床上基因治療對人類疾病進行基因干預治療，在治療疾病的潛力得到了認可，比傳統(tǒng)治療疾病的方法有很多不可比擬的優(yōu)點?；蛑委熞呀?jīng)成為當代生命科學領(lǐng)域最具前景性的研究方向。2003年基因組計劃的成功，推動了基因治療的進步。基因治療旨在改變基因水平，有DNA和mRNA兩個水平。2009年美國就有354項關(guān)于基因治療的計劃在試行，遠遠超出了2008年的全球的116項。英國在2014年推出了“十萬基因組計劃”擬通過對基因組進行測序，有效確定引發(fā)癌癥及其他疾病的基因。

抗體也是生物科學領(lǐng)域的主力軍，最普遍的用法是通過Western blot去揭示細胞中特定蛋白的表達量的多少，抗體另一方面還被用于熒光染色和免疫組化。根據(jù)2015年Biocompare發(fā)表的一份報告，在科研上用于抗體的生產(chǎn)的市場規(guī)模很龐大，并且仍在增長，抗體的種類也越來越多，但是抗體的質(zhì)量得不到保證，在抗體的購買方面損失了很多的資金，只科研用于抗體市場規(guī)模就達到25億美金，每年因購買質(zhì)量差的抗體導致的損失達到8億美金。2015年9月Uhlén和美國實驗生物學學會聯(lián)合會分別舉辦了關(guān)于抗體迫在眉睫的問題的解決的會議，解決方案之一就是抗體的效果的評價。同一種抗體在幾次試驗下表現(xiàn)出的性質(zhì)不同，會產(chǎn)生不可預料的結(jié)果。斯坦福大學反向DNA疫苗開創(chuàng)一型糖尿病新療法，這種疫苗是以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的反向DNA疫苗，通過靶向抑制異常表達的T細胞保護胰島B細胞不受傷害，來治療糖尿病。2015年4月，科學家證明了納米涂層細菌能有效轉(zhuǎn)運口服DNA疫苗，這種疫苗可以刺激人體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用治療疾病，主要目的是有效增加口服疫苗生物利用度，尋找一個有效的載體物質(zhì)。一些常見的方法如基因槍法、電穿孔法、顯微注射等方法，但這些方法目前的缺點是無法確保基因進入體內(nèi)不被降解、無靶向性、會產(chǎn)生機體的免疫反應，目前陽離子聚合物載體作為非病毒型載體已經(jīng)受到了人們的重視，將潛在的病毒型載體的安全性隱患排除。這種陽離子載體既可應用于基因治療又可簡化疫苗的生產(chǎn)以及DNA疫苗的不成熟性，可保護DNA進入體內(nèi)不被DNA水解酶水解。常見的陽離子聚合物基因載體毒性低、轉(zhuǎn)染效率高、具有靶向性且在細胞內(nèi)無明顯免疫反應。因此合成以陽離子聚合物為基礎(chǔ)的DNA納米載體載體很有意義和應用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種TMC/京尼平/pDNA納米載體及其制備方法。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種TMC/京尼平/pDNA納米載體，包括包裹pDNA的TMC/京尼平納米球；所述的TMC/京尼平/pDNA納米載體粒徑在100nm-500nm。

本發(fā)明還提供一種制備上述的TMC/京尼平/pDNA納米載體的方法，通過單體殼聚糖合成三甲基殼聚糖，通過交聯(lián)劑京尼平，先形成納米球，再將DNA載入納米球中。

步驟如下：

（一）制備碘化三甲基殼聚糖

（1）分別稱取研碎的脫乙酰度DD=80%-95%的殼聚糖、2.3倍殼聚糖摩爾量的NaI、 2.3倍殼聚糖摩爾量的質(zhì)量分數(shù)為15%NaOH溶液、10倍殼聚糖摩爾量的CH₃I溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮中，得到混合溶液；將混合溶液在40-60℃條件下水浴1h，然后將混合溶液離心進行分離，通過乙醚對沉淀洗滌2次、過濾除去乙醚后再將沉淀溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中后在40-60℃條件下水浴1h；

（2）再次稱取與上步等量的NaI、NaOH溶液、CH₃I依次加入上步1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，在40-60℃條件下水浴0.5h后再加入與NaI等摩爾量的CH₃I和0.5倍NaI摩爾量的NaOH繼續(xù)攪拌1h，得到碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品；

（二）制備去碘化的三甲基殼聚糖

將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中，進行脫碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，對沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品；

（三）TMC/京尼平納米球的制備

稱取上述制備的三甲基殼聚糖溶解在體積分數(shù)為1%的乙酸溶液中，室溫下逐滴加入與三甲基殼聚糖摩爾比1:1的質(zhì)量分數(shù)為0.5%的京尼平溶液，邊滴邊攪拌，反應中顏色變化后再持續(xù)攪拌進行6h，即制得TMC/京尼平納米球；

（四）TMC/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

（1）將上步所得TMC/京尼平納米球通過0.22μm濾膜進行滅菌操作，放入無菌操作臺備用。

（2）將（1）中的TMC/京尼平溶液取1mL加入離心管1中，另取藥用量的pDNA加入離心管2中，加入無菌水稀釋至2μg/mL；向離心管1中分批加入稀釋后的pDNA后渦旋30s,再將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得到TMC/京尼平/pDNA納米載體納米球。

作為優(yōu)選項：所述步驟（二）中水浴過程中通過使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH₃I，離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

本發(fā)明中TMC/京尼平納米球作為陽離子聚合物納米粒，可以通過靜電作用與pDNA結(jié)合，起到保護pDNA的作用，可以與不同濃度的pDNA結(jié)合，形成的納米球粒徑和電位均有所不同；粒徑和帶電荷的不同使納米粒子進入細胞體內(nèi)進行基因治療和對抗體生產(chǎn)的影響不同；陽離子聚合物載體的分散性好，尺寸可控，穩(wěn)定性好，與pDNA凝集很穩(wěn)定，整體帶正電荷，第三種電荷反轉(zhuǎn)復合物可以在不同pH條件下進行電荷反轉(zhuǎn)，更加有利于載體進入細胞。

本發(fā)明還提供TMC/京尼平/pDNA納米載體在基因治療和抗體生產(chǎn)領(lǐng)域的應用。

本發(fā)明的DNA納米載體，可以與不同濃度的可以表達綠色熒光蛋白的pDNA進行結(jié)合，從而可以對各個環(huán)節(jié)進行綜合評價，更好的用于生物檢測。

殼聚糖衍生物分別是天然的非病毒型載體和合成型的非病毒型載體，主要表現(xiàn)在其安全性可降解性、生物相容性、釋藥可控性、轉(zhuǎn)染效率高。在一定程度上保證DNA納米載體整體帶正電荷，采用復凝集法制備陽離子聚合物的DNA納米載體。在特定pH條件下，在水中分散性很好，粒徑分布均勻。

TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體分別以天然陽離子聚合物和合成陽離子聚合物對于DNA的結(jié)合程度，毒性大小以及粒徑分布產(chǎn)生影響。

綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為：

1、本發(fā)明制備方法工藝簡單，成本低；

2、本發(fā)明制備的納米顆粒穩(wěn)定性好，并且在水中分散性好，粒徑可控；

3、本發(fā)明制備的pDNA納米載體比在PBS和油相中尺寸和帶電荷量影響更??；

4、本發(fā)明制備的納米顆粒比兩單體的物質(zhì)穩(wěn)定性更好，更能改變整個物質(zhì)的電荷分布，更加適合基因治療和抗體生產(chǎn)的應用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中三甲基殼聚糖的制備過程示意圖；

圖2為本發(fā)明制備的載體進入細胞示意圖。

具體實施方式

制備TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體，包括如下實驗步驟：

（1）制備TMC(三甲基殼聚糖)

①稱取一定量研碎的殼聚糖（DD=80%-95%），NaI固體, NaOH溶液、CH3I溶液加入含有1-甲基-2-吡咯烷酮的燒瓶中40-60℃水浴1h.通過乙醇溶液將反應產(chǎn)物進行沉淀，通過離心進行分離。上述所得產(chǎn)品通過乙醚洗滌2次過濾除去乙醇。

②將①中的產(chǎn)物溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中40-60℃水浴，量取一定量的NaI固體, NaOH溶液、CH3I加入含有1-甲基-2-吡咯烷酮溶液的燒瓶中，40-60℃水浴0.5h.再加入CH3I和NaOH固體繼續(xù)攪拌1h.

③碘化三甲基殼聚糖去碘化 將上述制備的產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中，代替鹽酸，進行脫碘化。用乙醇沉淀此聚合物，用乙醚與乙醇交替洗滌并離心，通過真空干燥得到白色粉末。

（2）制備TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球

稱取一定量上述制備的三甲基殼聚糖溶解在體積分數(shù)為1%的乙酸溶液中，室溫下按照一定配比混合逐滴加入質(zhì)量分數(shù)為0.5%的京尼平溶液，邊滴邊攪拌，反應進行15min后顏色變化，反應持續(xù)進行6h.制得TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球。

(3）制備TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體

將制得的TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球使用0.45μm的濾膜進行處理，pDNA(0.1mg/mL)分批加入到殼聚糖納米球溶液中，分別渦旋30s后，將離心管放入孵育器中37℃進行培養(yǎng)1h.既可制得TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體。

以下實施例描述了本發(fā)明的特殊實施例子，以便對本發(fā)明作進一步的說明，這些實施例只是說明而不表示本發(fā)明所有的可能性，本發(fā)明并不僅僅局限于這些實施例中提到的材料、反應條件或參數(shù)，任何在相關(guān)領(lǐng)域具備經(jīng)驗的人，都可以按照本專利的原理，利用其他類似材料或反應條件實現(xiàn)本發(fā)明所描述的DNA納米載體的制備，這些不脫離本發(fā)明描述的基本概念。因此，這些修改或不同的應都在本發(fā)明的覆蓋范圍內(nèi)。

實施例1

1、制備碘化三甲基殼聚糖

稱取2g研碎的殼聚糖（DD=80%-95%），4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、11.5mlCH3I溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮中60℃水浴1h.反應過程中需要冷凝CH3I通過乙醇溶液將進行沉淀，通過離心進行分離。上述所得產(chǎn)品通過乙醚洗滌2次過濾除去乙醇。

2、將1中的產(chǎn)品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中60℃水浴，移除吸附在碘化三甲基殼聚糖多余的乙醚。量取4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、7mlCH3I依次加入80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，60℃水浴0.5h.再加入2mlCH3I和0.6gNaOH繼續(xù)攪拌1h.

3、 制備去碘化的三甲基殼聚糖

將2中制備的將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中，進行脫碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，對沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品；

所述乙醇沉淀的具體操作為使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH3I，離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

4 、TMC/京尼平納米球的制備

稱取10mg上述制備的三甲基殼聚糖溶解在10ml體積分數(shù)為1%的乙酸溶液中，室溫下逐滴加入2ml質(zhì)量分數(shù)為0.5%的京尼平溶液，邊滴邊攪拌，反應進行15min后顏色變化，反應持續(xù)進行6h.制得TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球。

5、 TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

（1）、將4中的TMC/京尼平納米球通過0.22μm濾膜進行滅菌操作，放入無菌操作臺備用。

（2）、將（1）中的TMC/京尼平溶液取1ml加入離心管1中，取10μlpDNA(3kb)加入2ml離心管2中，加入無菌水稀釋至100μl，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得。

實施例2

1、制備碘化三甲基殼聚糖

稱取2g研碎的殼聚糖（DD=80%-95%），4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、11.5mlCH3I溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮中40℃水浴1h.反應過程中需要冷凝CH3I通過乙醇溶液將進行沉淀，通過離心進行分離。上述所得產(chǎn)品通過乙醚洗滌2次過濾除去乙醇。

2、將1中的產(chǎn)品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中40℃水浴，移除吸附在碘化三甲基殼聚糖多余的乙醚。量取4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、7mlCH3I依次加入80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，40℃水浴0.5h.再加入2mlCH3I和0.6gNaOH繼續(xù)攪拌1h。

3 、制備去碘化的三甲基殼聚糖

將2中制備的將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中，進行脫碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，對沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品；

所述乙醇沉淀的具體操作為使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH3I，離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

4、 TMC/京尼平納米球的制備

稱取10mg上述制備的三甲基殼聚糖溶解在10ml體積分數(shù)為1%的乙酸溶液中，室溫下逐滴加入2ml質(zhì)量分數(shù)為0.5%的京尼平溶液，邊滴邊攪拌，反應進行15min后顏色變化，反應持續(xù)進行1h，制得TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球。

5、TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

（1）、 將4中的TMC/京尼平納米球通過0.22μm濾膜進行滅菌操作，放入無菌操作臺備用；

（2）、 將（1）中的TMC/京尼平溶液取1ml加入離心管1中，取10μlpDNA(5kb)加入2ml離心管2中，加入無菌水稀釋至2ug/ml，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得。

實施例3

1、制備碘化三甲基殼聚糖

稱取1g研碎的殼聚糖（DD=80%-95%），2.4gNaI,5.5ml15%NaOH溶液、5.75mlCH3I溶解在40ml1-甲基-2-吡咯烷酮中60℃水浴1h.反應過程中需要冷凝CH3I通過乙醇溶液將進行沉淀，通過離心進行分離。上述所得產(chǎn)品通過乙醚洗滌2次過濾除去乙醇。

2、將1中的產(chǎn)品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中60℃水浴，移除吸附在碘化三甲基殼聚糖多余的乙醚。量取2.4gNaI,5.5ml15%NaOH溶液、3.5mlCH3I依次加入40ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，60℃水浴0.5h.再加入1mlCH3I和0.3gNaOH繼續(xù)攪拌1h;

3、 制備去碘化的三甲基殼聚糖

將2中制備的將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中，進行脫碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，對沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品；

所述乙醇沉淀的具體操作為使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH₃I，離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

4 、TMC/京尼平納米球的制備

稱取5mg上述制備的三甲基殼聚糖溶解在5ml體積分數(shù)為1%的乙酸溶液中，室溫下逐滴加入1ml質(zhì)量分數(shù)為0.5%的京尼平溶液，邊滴邊攪拌，反應進行15min后顏色變化，反應持續(xù)進行6h，制得TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球。

5、 TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

（1）、 將4中的TMC/京尼平納米球通過0.22μm濾膜過濾后進行滅菌操作，放入無菌操作臺備用。

（2）、將（1）中的TMC/京尼平溶液取1ml加入離心管1中，取8μlpDNA(3kb)加入2ml離心管2中，加入無菌水稀釋至100μl，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得。