本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及牛至揮發(fā)油單體之一桉樹腦在制備抗產(chǎn)ESBLs大腸桿菌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)菌的多重耐藥現(xiàn)象已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅和世界關(guān)注的臨床難題，造成了病死率的增高，醫(yī)療資源的浪費(fèi)。在實(shí)際的臨床治療中，產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的感染率較高，由于產(chǎn)生了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended Spectrum β-lactamases，ESBLs)，其耐藥范圍較廣，意味著現(xiàn)有的抗感染藥物的選擇范圍是有限的。我們除了選擇現(xiàn)有的抗感染藥物，并沒有其他的辦法來從根本上阻斷或解決耐藥問題。這就需要人們不斷地去發(fā)展新型抗生素，但研發(fā)新型抗生素的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的速度。

中藥在感染性疾病防治中發(fā)揮著重要的作用，一直被用作尋求抗生素替代藥物的重要資源庫。如“對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌有抑制作用的中草藥初步篩選”，劉芬等（福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009年，第19卷第2期）研究了大青葉、五倍子、黃連等36種中藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑菌作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，部分中藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌具有不同程度的抑菌作用，其中以五倍子的抑菌效果最為明顯，MIC（瓊脂稀釋法）為3.125mg/mL。

牛至在國(guó)內(nèi)外廣泛的用于抗感染以及預(yù)防治療中，作為藥食兩用的中藥材，具有可觀的藥用價(jià)值和使用價(jià)值。“牛至油和小檗堿聯(lián)用對(duì)產(chǎn)ESBLs雞大腸埃希菌的體外抗菌試驗(yàn)”（湯法銀等，中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012年，第48卷第6期）的研究表明，牛至油對(duì)產(chǎn)ESBLs雞大腸桿菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，但未深入研究何種牛至油單體導(dǎo)致其產(chǎn)生上述抗菌活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)ESBLs大腸桿菌藥物的研究現(xiàn)狀，深入研究發(fā)現(xiàn)在牛至揮發(fā)油中具有抑制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的活性單體為桉樹腦，牛至揮發(fā)油單體之一桉樹腦能夠影響產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥靶點(diǎn)--生物被膜的形成，這為緩解或解決產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的感染，提高臨床治療有效率，降低病死率，節(jié)約醫(yī)療資源奠定了有意義的研究基礎(chǔ)，為耐藥菌的防治提出了新的研究思路，具有重要的研究意義。

附圖說明

附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1 是安徽產(chǎn)地的牛至揮發(fā)油的GC-MS色譜圖；

圖2 是硫酸慶大霉素對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌生物被膜形成的抑制率；

圖3 是桉樹腦對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌生物被膜形成的抑制率。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

利用索氏提取器，按《中國(guó)藥典》2005版(一部)附錄XD：水蒸氣蒸餾法提取牛至全株(花、莖、葉)的揮發(fā)油，每次提取藥材100 g，提取時(shí)間6 h，重復(fù)5次。收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，冷藏24 h，使水、油兩相分層，再用分液濾斗進(jìn)行分離，濾得牛至的揮發(fā)油提取物：顏色-淡黃色透明，氣味-具有濃郁芳香氣味，置于長(zhǎng)頸玻璃瓶中，4℃保存。試驗(yàn)選擇安徽產(chǎn)地的牛至藥材，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院李永和主任藥師鑒定，為唇形科植物牛至Origanum vulgare L.的干燥地上部分。

牛至揮發(fā)油化學(xué)成分的測(cè)定

通過GC-FID (gas chromatography equipped with a flame ionization detector, 氣相色譜分析-火焰離子化檢測(cè)器)和GC-MS聯(lián)用技術(shù)，與標(biāo)準(zhǔn)譜庫匹配，結(jié)合保留指數(shù)法并用峰面積歸一化法測(cè)定各含量的相對(duì)百分含量，鑒定牛至揮發(fā)油提取物的化合物結(jié)構(gòu)。

GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)條件：

(1)氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃, 柱溫40 ℃; 以5 ℃/min升到250 ℃保持10 min；流速：恒壓模式1.0 ml/min，載氣：氦氣，分流比為100:1；接口溫度：250 ℃；

(2)質(zhì)譜條件：EI源，電子能量70 eV，離子源溫度：200 ℃；溶劑切除時(shí)間：4min；檢測(cè)器電壓：1.08 KV;

(3)檢索譜庫：NIST 05、NIST 05s；

(4)進(jìn)樣量：0.2 μl。

安徽產(chǎn)地的牛至揮發(fā)油GC-MS色譜圖如圖1所示，與標(biāo)準(zhǔn)譜庫匹配分析，化學(xué)成分分析結(jié)果見表1。

為保證成分的純度，以購(gòu)買的桉樹腦標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行的耐藥抑制研究。

表 1 安徽產(chǎn)地的牛至揮發(fā)油的化學(xué)成分

1、牛至揮發(fā)油對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的耐藥抑制作用

采用肉湯稀釋法：即用無菌肉湯將純培養(yǎng)的菌液(產(chǎn)ESBLs大腸桿菌)稀釋校正至0.5濃度的麥?zhǔn)媳葷峁?，按?:100 (v/v)的比例加入到不同濃度梯度的藥液、對(duì)照品溶液中，輕輕混勻，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，孵育24 h后，從每個(gè)試管中取出10 ml均勻的涂布到MH瓊脂培養(yǎng)基上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，孵育24 h后，計(jì)數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)平行三次，應(yīng)用平板菌落計(jì)數(shù)法，計(jì)算菌落數(shù)的平均值，分析牛至揮發(fā)油對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制作用，測(cè)定MIC值與MBC值。與對(duì)照品比較，發(fā)現(xiàn)牛至揮發(fā)油提取物能明顯的抑制耐藥大腸桿菌的生長(zhǎng)，結(jié)果表2。

表2 牛至揮發(fā)油對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制作用

a 抑菌活性單位: mg/ml；

表2中，牛至揮發(fā)油對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌具有一定的抑制作用。

2、桉樹腦的耐藥抑制作用

基于牛至揮發(fā)油對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制作用，利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，檢測(cè)桉樹腦為牛至揮發(fā)油的單體成分之一（見圖1及表1）。因此，采用標(biāo)準(zhǔn)品桉樹腦進(jìn)行耐藥性抑制作用的研究，實(shí)驗(yàn)操作同上。

桉樹腦單體對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制作用：

MIC: 206 μg/ml

MBC: 412 μg/ml

桉樹腦對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制作用較好。

3、桉樹腦產(chǎn)ESBLs大腸桿菌生物被膜形成的影響

利用96微孔板技術(shù)篩選法，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)桉樹腦對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的OD值，計(jì)算不同濃度藥液對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，以抑制率為指標(biāo)，分析桉樹腦單品成分對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌生物被膜形成的影響。

（1）對(duì)無菌操作臺(tái)進(jìn)行紫外燈照射滅菌；

（2）在96微孔板上, 除最邊緣微孔，分別加90 μl稀釋的菌液于每一微孔中；

（3）加90 μl的藥液和10 μl的新鮮稀釋的菌液在第一排微孔中；

（4）用移液槍進(jìn)行梯度稀釋，共稀釋三個(gè)濃度，見表3。胡薄荷酮、桉樹腦、香茅醇的濃度設(shè)置參考對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌抑菌作用的濃度而設(shè)置的梯度。在37 ℃，5 % CO₂條件下培養(yǎng)24 h；

（5）陽性對(duì)照孔加入含10 μl菌液的營(yíng)養(yǎng)肉湯，陰性對(duì)照孔加100 μl不含藥物的營(yíng)養(yǎng)肉湯，試驗(yàn)中將硫酸慶大霉素作為藥液的對(duì)照組。

（6）在600 nm下測(cè)定吸收度 (OD₆₀₀值)；

（7） 倒去培養(yǎng)液。用蒸餾水沖洗3-10次微孔板，用吸水紙輕輕除去微孔板中的殘余水分；將0.1 %結(jié)晶紫溶液加于每個(gè)微孔中，室溫下保持15 min；

（8）用蒸餾水沖洗微孔板5次，加2 %去氧膽酸鈉(SD)100 μl溶液到每個(gè)微孔；

（9）在λ max=600 nm下，測(cè)定吸收度 (OD值)。

對(duì)生物被膜形成的影響，以抑制率為指標(biāo)，分析不同濃度桉樹腦藥液對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌生物被膜形成的抑制率，桉樹腦的藥液濃度見表3，結(jié)果見表4，圖2-圖3。

抑制率(%)=(B-S)/(G-S)

B (Biofilm): 生物被膜檢測(cè)OD值；

S (Standard):陰性對(duì)照的OD值；

G (Grow):細(xì)菌生長(zhǎng)的OD值。

表 3 桉樹腦的藥液濃度

表 4 桉樹腦對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌生物膜形成的抑制率

通過多重比較(LSD法)，得硫酸慶大霉素的C₁和C₃的抑制率的差異具有顯著性意義，P=0.026；桉樹腦C₁和C₃的抑制率的差異具有顯著性意義，P=0.043。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。