本發(fā)明涉及茯苓新酸制備方法及其在制備利尿藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

茯苓皮為真菌茯苓菌核的外皮。茯苓主要分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)等地。茯苓始載于《神農(nóng)草本經(jīng)》，其后的其他醫(yī)學(xué)著作如《中國(guó)醫(yī)學(xué)大辭典》、《中華本草》、《醫(yī)學(xué)啟源》和《中國(guó)藥典》均有記載，2010版《中國(guó)藥典》開(kāi)始收載茯苓皮作為一種利水滲濕類中藥。《中國(guó)藥典》記錄茯苓皮甘、淡，平。歸肺、脾、腎經(jīng)，其功能利水消腫，主要用于水腫，小便不利。

茯苓皮是中藥制備茯苓過(guò)程中的下腳料或副產(chǎn)品。茯苓新酸、茯苓酸、去氫土莫酸、去氫齒孔酮酸等四環(huán)三萜酸類化合物是茯苓皮是主要化學(xué)成分。中醫(yī)記載茯苓素具有滲濕利尿之功效，茯苓素是由茯苓真菌中提取的多成分的四環(huán)三萜類混合物。茯苓餅對(duì)于水腫病人有顯著的療效。四環(huán)三萜類化學(xué)成分具有和醛固酮類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。體外實(shí)驗(yàn)表明茯苓素可以與大鼠腎胞漿膜醛固酮受體結(jié)合，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明茯苓素可以拮抗醛固酮活性，茯苓素可以促進(jìn)鈉離子的排泄，提高尿中Na⁺/K⁺比值，且具有劑量依賴關(guān)系，但茯苓素不影響大鼠血漿醛固酮和血管緊張素的水平。實(shí)驗(yàn)表明它可能是一種醛固酮受體拮抗劑。其它的研究顯示茯苓皮的乙醇提取物和乙酸乙酯提取物有顯著的利尿活性。中醫(yī)治療肝硬化是依靠促腹水轉(zhuǎn)化機(jī)制，茯苓皮對(duì)小鼠腹膜淋巴孔有一定的調(diào)控作用，使腹膜淋巴孔開(kāi)放數(shù)目增多和孔徑變大，具有一定的促腹水吸收作用。茯苓酸A具有一定的細(xì)胞毒活性和具有抗腫瘤的作用，3-表去氫土莫酸能夠被人體小腸的上皮細(xì)胞吸收且具有清除自由基的活性。

目前已報(bào)到的對(duì)茯苓皮研究主要集中于化學(xué)成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定(四環(huán)三萜類化合物和多糖)及提取物的活性評(píng)價(jià)(利尿、抗溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒等)。部分研究報(bào)道了茯苓皮或復(fù)方制劑的利水滲濕作用的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用，以水煎煮提取物為主，水提物大部分是極性大的化學(xué)成分，其利尿活性并不明顯，目前對(duì)于茯苓皮的研究沒(méi)有新的發(fā)現(xiàn)和突破。到目前為止，茯苓皮的利尿活性成分不清楚。為了明確茯苓皮的利尿活性成分，充分的利用和開(kāi)發(fā)茯苓皮，申請(qǐng)者對(duì)茯苓皮乙醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了分離與結(jié)構(gòu)鑒定并對(duì)部分化合物進(jìn)行了利尿研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茯苓皮的化學(xué)成分茯苓新酸具有顯著的利尿活性，這與中醫(yī)藥茯苓皮利水滲濕功效相吻合。目前的化藥利尿藥吲達(dá)帕胺和呋塞米存在易引起低血鉀和心律不齊的副作用；噻嗪類利尿劑氯噻嗪、氯噻酮和雙氫克尿塞存在降低體內(nèi)的鉀含量的缺點(diǎn)，此外，噻嗪類利尿劑可增加患者膽汁中膽固醇的飽和度，進(jìn)一步導(dǎo)致增加膽囊炎的發(fā)病率。因此有待于進(jìn)一步從天然資源中尋找新的利尿藥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

2010版《中國(guó)藥典》收載茯苓皮的功能主治利水消腫，用于治療水腫和小便不利等癥。以生理鹽水負(fù)荷的正常大鼠水潴溜模型對(duì)茯苓皮的四環(huán)三萜類化學(xué)成分進(jìn)行利尿活性評(píng)價(jià)。收集6小時(shí)的大鼠尿液，記錄每小時(shí)的尿量、測(cè)量尿液pH值、測(cè)定尿液鈉、鉀、氯離子的含量、計(jì)算鈉/鉀比值，本發(fā)明研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)茯苓皮的化學(xué)成分茯苓新酸有顯著的利尿作用。增加尿量的同時(shí)亦能增加大鼠體內(nèi)鈉離子排出和鉀離子的保留，起到保鉀排鈉的作用。

本發(fā)明提供了茯苓新酸用于制備利尿藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明用茯苓新酸制備利尿藥物以常規(guī)藥用制劑的形式來(lái)使用；所述的常規(guī)藥物用制劑含作為活性組分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體，如適宜于腸胃內(nèi)和腸胃外給藥的有機(jī)或無(wú)機(jī)的固體或液體賦形劑混合，該藥用制劑可以是固體形式如片劑、膠囊劑、散劑、丸劑、顆粒劑等。

本發(fā)明的藥物制劑中可含有輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和其它常用的添加劑，如硬脂酸、乳糖、檸檬酸、硬脂酸鎂、石膏粉、玉米淀粉、明膠、瓊脂、橄欖油、乙二醇、抗壞血酸等。

本發(fā)明的藥物制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)茯苓新酸對(duì)生理鹽水負(fù)荷的水潴溜大鼠有較好的利尿作用，茯苓新酸有促進(jìn)鈉離子排出的同時(shí)有減少鉀離子排出的效應(yīng)，說(shuō)明茯苓新酸有保鉀排鈉的作用。其利尿作用雖然不及呋塞米快，但是卻比呋塞米作用時(shí)間長(zhǎng)，具有長(zhǎng)效溫和的效果，可為臨床提供一種新的利尿藥物候選藥物。

附圖說(shuō)明

圖1為不同時(shí)間段茯苓新酸灌胃給藥對(duì)大鼠尿量的影響圖。

具體實(shí)施方式

為了驗(yàn)證茯苓新酸利尿的效果，申請(qǐng)人以生理鹽水負(fù)荷的水潴溜大鼠模型進(jìn)行了藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)藥物、動(dòng)物、儀器、方法及結(jié)果如下：

1.實(shí)驗(yàn)藥物

螺內(nèi)酯片：杭州民生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)T15L035，生產(chǎn)日期151225；呋塞米片：上海朝暉藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)1602N14，生產(chǎn)日期20160225；茯苓新酸是從茯苓皮中提取分離并通過(guò)各種波譜與光譜技術(shù)(¹H NMR,¹³C NMR,2D NMR,MS,UV和IR)進(jìn)行鑒定結(jié)構(gòu)。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重180-220g的雄性Sprague-Dawley大鼠購(gòu)買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。

3.實(shí)驗(yàn)儀器

ZH-B6型大鼠代謝籠(安徽淮北正華生物儀器有限公司)，TD型電子天平(余姚市金諾天平儀器有限公司)，美特列-托利多十萬(wàn)分子一分析天平。

4.實(shí)驗(yàn)方法

1)茯苓新酸的利尿?qū)嶒?yàn)

SD大鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、茯苓新酸小劑量組(5mg/kg)、茯苓新酸中劑量組(10mg/kg)、茯苓新酸大劑量組(20mg/kg)、螺內(nèi)酯組(40mg/kg)、呋塞米組(20mg/kg)，每組8-12只大鼠，禁食不禁水12h后各組均按5ml/100g體重灌胃給予生理鹽水，并用手輕壓腹部使其排盡余尿，給藥各組均按1ml/100g體重灌胃，正常對(duì)照組給自來(lái)水1ml/100g。給藥后立即將大鼠分別放入方形不銹鋼的代謝籠，每籠1只。給藥后在代謝籠下面放置帶刻度的試管，每小時(shí)記錄1次尿量，連續(xù)收集6小時(shí)尿量，記錄每小時(shí)每只動(dòng)物的尿量，計(jì)算每組動(dòng)物每小時(shí)的尿量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，計(jì)算6h每組動(dòng)物總尿量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，測(cè)定尿液pH值，測(cè)定尿樣中電解質(zhì)鈉(Na⁺)、鉀(K⁺)及氯(Cl^-)的含量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2)藥效計(jì)算

結(jié)果均以平均值±SE表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)算t，P值，將治療組與空白組進(jìn)行組間差異性比較，t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異；P<0.01為有非常顯著性差異，判斷茯苓新酸對(duì)生理鹽水負(fù)荷的水潴溜大鼠模型的利尿效果。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)茯苓新酸的提取及結(jié)構(gòu)鑒定

茯苓新酸的提取制備工藝：經(jīng)過(guò)干燥的茯苓皮藥材粉碎后用3-5倍體積的95％乙醇浸泡48小時(shí)，開(kāi)始滲漉，濃縮提取物，回收乙醇，得棕色膏狀物。膏狀物用蒸餾水溶解后乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取物溶于甲醇，用MCI填料拌樣，上MCI色譜柱，采用10:90-60:40甲醇-水梯度洗脫；洗脫成分濃縮再上200-300目的硅膠柱，二氯甲烷-甲醇洗脫，收集餾分，合并濃縮，最后得茯苓新酸，茯苓新酸用于利尿?qū)嶒?yàn)。

白色粉末，C₃₀H₄₆O₃，MW：454，EI-MS m/z:453[M-H]^－；¹H NMR(pyridine-d₅,800MHz)δ:0.98(3H,s,H₃-18),1.03(3H,s,H₃-30),1.11(3H,s,H₃-19),1.14(3H,s,H₃-29),1.20(3H,s,H₃-28),1.60(3H,s,H₃-27),1.64(3H,s,H₃-26),2.64(1H,td,J＝11.45,3.29Hz,H-20),3.43(1H,t,J＝7.55,H-3),5.32(1-H,tt,J＝7.11,H-24),5.34(IH,brd,J＝5.56,H-11),5.59(1H,brd,J＝4.38,H-7)；¹³C NMR(200MHz,Pyridine-d5)給出30個(gè)碳信號(hào)，根據(jù)DEPT譜推斷分別為7個(gè)甲基，8個(gè)亞甲基，7個(gè)次甲基(包括3個(gè)雙鍵碳δ121.21,116.65,124.92),7個(gè)季碳(含3個(gè)雙鍵碳δ142.81,146.53,131.64和一個(gè)羧基碳δ178.72)。¹³C NMR(pyridine-d₅,200MHz)δ:36.32(C-1),28.80(C-2),77.97(C-3),39.31(C-4),49.70(C-5),23.51(C-6),121.21(C-7),142.81(C-8),146.53(C-9),37.80(C-10),116.65(C-11),35.98(C-12),44.23(C-13),50.44(C-14),31.58(C-15),27.27(C-16),48.14(C-17),16.24(C-18),22.95(C-19),49.70(C-20),178.72(C-21),33.32(C-22),26.76(C-23),124.92(C-24),131.64(C-25),25.76(C-26),17.70(C-27),28.65(C-28),16.60(C-29),25.84(C-30)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照，鑒定該化合物為：茯苓新酸，英文名稱：3β-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid；中文名稱：3β-羥基羊毛甾烷-7,9(11),24-三烯-21-酸。茯苓新酸(3β-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：

(2)不同劑量的茯苓新酸對(duì)大鼠尿量的影響

圖1和表1顯示茯苓新酸小、中、大3個(gè)劑量組對(duì)尿量均有增加的趨勢(shì)，與正常對(duì)照組相比，小、中、大3個(gè)劑量組均存在不同時(shí)間的不同程度的利尿效果。以正常對(duì)照組為參照，則茯苓新酸三組尿量分別增加了20.6％、25.8％、11.5％。增加率均超過(guò)10％，特別是茯苓新酸中劑量組利尿效果最顯著，與陽(yáng)性對(duì)照藥螺內(nèi)酯的尿量接近，提示茯苓新酸有較好的利尿效果。但茯苓新酸三個(gè)不同的劑量組大鼠6h尿量低于螺內(nèi)酯和呋塞米組，結(jié)果表明茯苓新酸的利尿程度弱于螺內(nèi)酯和呋塞米，與螺內(nèi)酯和呋塞米組比較，茯苓新酸的利尿作用呈現(xiàn)溫和而持久的效果。

表1不同劑量的茯苓新酸灌胃給藥大鼠的尿量的影響

注：給藥組與水對(duì)照組組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比^*P<0.05，^**P<0.01

(3)不同劑量的茯苓新酸對(duì)大鼠尿液pH值的影響

與正常對(duì)照組大鼠相比，茯苓新酸三個(gè)劑量組增加尿液pH值并存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。螺內(nèi)酯也增加尿液的pH值并存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。呋塞米對(duì)尿液的pH值沒(méi)有影響。

(4)不同劑量的茯苓新酸對(duì)大鼠尿液電解質(zhì)鈉、鉀及氯離子排出量的影響

表2顯示茯苓新酸對(duì)大鼠尿液電解質(zhì)鈉、鉀及氯離子的影響，與正常對(duì)照組大鼠相比，茯苓新酸有增加電解質(zhì)鈉離子的排出的趨勢(shì)，茯苓新酸小、中、大三個(gè)劑量組對(duì)鈉離子的排出量分別增加了11.1％、11.0％、11.0％，且三個(gè)劑量組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。與正常對(duì)照組大鼠相比，茯苓新酸小劑量組增加電解質(zhì)鉀離子的排出，而中和大劑量組減少電解質(zhì)鉀離子的排出，且中和大劑量組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。與正常對(duì)照組大鼠相比，茯苓新酸小、中、大三個(gè)劑量組雖然對(duì)氯離子的排出量有一定影響，但是沒(méi)有存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。茯苓新酸小、中、大三個(gè)劑量組均增加鈉/鉀離子的比值，中和大劑量組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。螺內(nèi)酯和呋塞米能增加鈉離子排出，同時(shí)增加鈉/鉀離子的比值，但對(duì)鉀離子排出沒(méi)有顯著的影響。

發(fā)明人的研究結(jié)果證明了茯苓新酸在促進(jìn)鈉排泄的同時(shí)具有保鉀的作用。抑制腎小管對(duì)電解質(zhì)鈉離子和水的重吸收可能是茯苓新酸的利尿的作用機(jī)制，茯苓新酸是四環(huán)三萜類化學(xué)結(jié)構(gòu)，四環(huán)三萜類化學(xué)結(jié)構(gòu)與醛固酮及醛固酮的拮抗劑(如螺內(nèi)酯)結(jié)構(gòu)相似，所以茯苓新酸的利尿作用是拮抗醛固酮使鈉/鉀離子平衡發(fā)生改變。

表2不同劑量茯苓新酸對(duì)大鼠排尿電解質(zhì)鈉、鉀及氯離子含量的影響

注：給藥組與水對(duì)照組組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比^*P<0.05，^**P<0.01

茯苓新酸對(duì)生理鹽水負(fù)荷的水潴溜大鼠有較好的利尿作用，茯苓新酸有促進(jìn)鈉離子排出的同時(shí)有減少鉀離子排出的效應(yīng)，說(shuō)明茯苓新酸有保鉀排鈉的作用，可為臨床提供一種新的利尿藥物候選藥物。