本發(fā)明涉及一種熒光碳顆粒的制備方法，特別是涉及一種生物酶切制備方法。

背景技術(shù)：

目前科學(xué)家們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種制備碳顆粒(碳點(diǎn))的方法，如合成法、電化學(xué)法、激光消融法、強(qiáng)酸溶解法、水熱一步法等，但是這些制備方法價(jià)格昂貴，成本高，需要高溫高壓條件，需要氧化劑和鈍化劑，使用強(qiáng)酸或具有強(qiáng)腐蝕性液體，反應(yīng)劇烈且不符合環(huán)境友好的要求，不易控制產(chǎn)物成分，雜質(zhì)多，純化過(guò)程繁瑣困難，產(chǎn)量低等缺點(diǎn)。

然而一種重要的制備法——生物酶切法卻尚未應(yīng)用于碳點(diǎn)的制備，更重要的是：此法與蒙藥和中藥中的傳統(tǒng)炭藥在人體中的消化和吸收具有密切的相關(guān)性，甚至?xí)苯佑绊懫渌幚碜饔谩凑嬲l(fā)揮藥效的應(yīng)該是經(jīng)酶切消化后的“納米碳點(diǎn)”。經(jīng)我們做實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：通過(guò)該方法制備的碳點(diǎn)，其表面富含官能性有機(jī)基團(tuán)，使得其不僅具有良好的分散性和水溶性(傳統(tǒng)碳點(diǎn)難溶于水)，而且易于功能化修飾和生物偶聯(lián)標(biāo)記，同時(shí)還具有很好的生物相容性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種熒光碳顆粒的制備方法。本發(fā)明中的熒光碳顆粒的制備方法是模擬蒙藥炭藥黑冰片在人體胃腸道里的藥理作用：通過(guò)胃液消化和腸液消化把大的碳顆粒消化成納米級(jí)的碳顆粒，然后被腸道吸收進(jìn)入血液發(fā)揮藥理作用。

本發(fā)明的目的由如下技術(shù)方案實(shí)施：

第一步：模擬黑冰片碳顆粒在人體內(nèi)的消化過(guò)程并制備熒光碳顆粒。1.黑冰片的炮制；2.生物酶切法制備熒光顆粒；

1.黑冰片的炮制

選用馬弗爐對(duì)黑冰片進(jìn)行充分煅燒成生物炭。沒(méi)有選用傳統(tǒng)方法炮制是因?yàn)閭鹘y(tǒng)方法不能把黑冰片完全碳化。

2.生物酶切法制備熒光顆粒

利用模擬黑冰片在胃中和腸道中的消化吸收過(guò)程，制備出模擬胃液和腸液把黑冰片大的炭顆粒逐步在胃液中、腸液中消化成納米級(jí)的小顆粒，然后利用微波法和超聲法激發(fā)熒光制備熒光顆粒。

第二步：黑冰片熒光顆粒的動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量

1.熒光碳顆粒形貌表征

利用原子力顯微鏡(AFM)技術(shù)檢測(cè)獲得黑冰片熒光顆粒的粒度大小及三維圖像，根據(jù)圖像分析可以直接得到顆粒的三維尺寸。

2.光譜性質(zhì)的表征

紫外吸收光譜性質(zhì)的表征使用U-3010型紫外可見(jiàn)光譜儀測(cè)定。采用Zata電位儀測(cè)試碳點(diǎn)的表面電位。為了確定制備出的聚合物納米顆粒的結(jié)構(gòu)，使用美國(guó)Perkin Elmer公司的FT-IR Spectrometer(Spectrum one)傅立葉變換紅外光譜儀，采用KBr壓片法，在波數(shù)500～4000cm-1對(duì)黑冰片碳點(diǎn)樣品進(jìn)行紅外光譜測(cè)試分析。熒光光譜性質(zhì)用F-45000熒光光譜儀進(jìn)行表征。

附圖概要說(shuō)明

附圖1：黑冰片熒光顆粒的制備及細(xì)胞吞噬示意圖.

附圖2：用原子力顯微鏡觀察黑冰片熒光顆里的尺寸大小。

附圖3：熒光光譜掃描圖。

具體實(shí)施方式

第一步：模擬黑冰片碳顆粒在人體內(nèi)的消化過(guò)程并制備熒光碳顆粒。1.黑冰片的炮制；2.生物酶切法制備熒光顆粒。其中，

1.黑冰片的炮制實(shí)驗(yàn)：稱(chēng)取1公斤凈制的野豬成型干燥糞，置瓷碗中加蓋，中間縫隙用鹽水泥密封(水鹽比5∶1)，晾干后置于馬弗爐內(nèi)，于500℃煅燒2小時(shí)，取出放涼，利用研磨器研磨后過(guò)200目的篩子，稱(chēng)重保存干燥處備用。

2.生物酶切法制備熒光顆粒：

(1)模擬人胃、腸液的配制：A胃液的配制：0.2g NaCl，0.32g胃蛋白酶，0.7ml濃鹽酸，雙蒸餾水定容于100ml。pH約為1.2。(胃蛋白酶購(gòu)自于Sigma公司。胃蛋白酶的活力為2330U/mg pro)。B、模擬腸液的配制：將0.68g KH2PO4溶于25ml雙蒸水，振蕩，完全溶解后加19ml 0.2mo l/LNaOH和40ml的雙蒸水。加胰蛋白酶1.0g，混勻，用0.2mol/L NaOH調(diào)pH到7.5±0.1，雙蒸水定容于100ml。(胰蛋白酶購(gòu)自于Sigma公司。胰蛋白酶的活力為10010U/mg prot。)

(2)黑冰片熒光顆粒的制備實(shí)驗(yàn)

本次熒光顆粒的制備通過(guò)三步進(jìn)行：首先，將1g黑冰片碳粉投入到在預(yù)先加入模擬人胃液的圓底燒瓶中，置于油浴鍋中37℃、磁力攪拌回流12h。反應(yīng)完后，離心分離除去未反應(yīng)物，取上面黃色上清液，轉(zhuǎn)入到透析袋(MWC01000)在超純水中透析2～3天(期間不斷換水)，直到pH值接近中性。透析處理后的黃色液體再逐級(jí)離心分離提純，最后以16000轉(zhuǎn)/秒離心30min后提取上清液4℃保存。其次，將胃液消化離心沉淀的黑冰片碳顆?；厥眨⒌谷脒m量超純水輕輕混勻然后16000轉(zhuǎn)/秒離心10min。以上方法重復(fù)兩次，最后把沉淀物溶于腸液置于油浴鍋中37℃、磁力攪拌回流12h。反應(yīng)完后，離心分離除去未反應(yīng)物，取上面黃色上清液，轉(zhuǎn)入到透析袋(MWC01000)在超純水中透析2～3天(期間不斷換水)，直到pH值接近中性。最后以16000轉(zhuǎn)/秒離心30min后提取上清液4℃保存。然后，兩次提取的黃色上清液混合后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至25mL左右。接著把濃縮的液體放入微波爐以50Hz微波5min后放入冷凍干燥機(jī)干燥，然后加入適量(例如1ml)超純水到干燥碳顆粒里，超聲1min后回收，得到碳顆粒溶液，可直接在熒光檢測(cè)儀下檢測(cè)發(fā)熒光等情況后4℃保存，或通過(guò)冷凍干燥獲得熒光碳顆粒。

第二步：黑冰片熒光顆粒的動(dòng)態(tài)光散射

1.碳點(diǎn)形貌表征

利用原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy，AFM)技術(shù)可以直接獲得樣品的三維圖像，根據(jù)圖像分析可以直接得到顆粒的三維尺寸。取0.1μg/ml碳點(diǎn)溶液滴于新解離的白云母片上，待溶液完全展開(kāi)，放置在真空干燥箱內(nèi)，80℃干燥保持2h后，取出測(cè)試。

附圖1顯示了模擬炭藥在人體里消化吸收及激發(fā)熒光過(guò)程。

2.黑冰片熒光顆粒表型分析

附圖2顯示了用原子力顯微鏡觀察黑冰片熒光顆里的尺寸大小。說(shuō)明所制備的碳顆粒大小均勻。碳顆粒大小尺寸在15nm以下。

3.光譜性質(zhì)的表征

紫外吸收光譜性質(zhì)的表征使用U-3010型紫外可見(jiàn)光譜儀測(cè)定。采用Zata電位儀測(cè)試碳點(diǎn)的表面電位。為了確定制備出的聚合物納米顆粒的結(jié)構(gòu)，我們使用美國(guó)Perkin Elmer公司的FT-IR Spectrometer(Spectrum one)傅立葉變換紅外光譜儀，采用KBr壓片法，在波數(shù)500～4000cm-1對(duì)黑冰片碳點(diǎn)樣品進(jìn)行紅外光譜測(cè)試分析。熒光光譜性質(zhì)用F-45000熒光光譜儀進(jìn)行表征。

附圖3顯示了當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)從280到440nm時(shí)熒光強(qiáng)度逐漸增加。說(shuō)明樣品碳顆粒本身發(fā)出熒光。