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      一種具有祛斑美白功效的中藥組合提取物及應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:11089656閱讀:779來源:國知局

      本發(fā)明屬于精細(xì)化工日用品技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及的是一種具有祛斑美白功效的中藥組合提取物及應(yīng)用。



      背景技術(shù):

      皮膚是人體的一道屏障,可以在一定程度上反應(yīng)人體的健康狀況。隨著自然環(huán)境和個人身體健康狀況的變化以及外界壓力的不斷加大等影響,機(jī)體自身抗氧化體系活力下降,體內(nèi)氧自由基增加,酪氨酸酶增多,就會引起黑色素沉積,產(chǎn)生色斑,導(dǎo)致肌膚暗淡。

      導(dǎo)致黑色素產(chǎn)生的原因有很多種,如紫外線廢氣、活性氧等環(huán)境問題和某些遺傳因素,其產(chǎn)生的原因相當(dāng)復(fù)雜,普遍研究結(jié)果表明黑色素合成的過程如下,以細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸作為基質(zhì),在酪氨酸酶的作用下生成多巴醌,從多巴醌變成多巴色素之后進(jìn)一步氧化成5,6-二羥基吲哚和5,6-二羥基-2-羥酸,這些生成物聚合最終生成聚體黑色素。在細(xì)胞代謝的層層推動下被轉(zhuǎn)移至肌膚表層,若不能及時被代謝排出體外,就會逐漸累積沉淀形成色斑,最終導(dǎo)致皮膚過黑。

      如今,大多數(shù)祛斑產(chǎn)品多用于黃褐斑。黃褐斑是一種獲得性面部色素代謝異常對稱性皮膚病,呈淺褐色或深褐色的色素斑點(diǎn),一般對稱地分布在眼周圍附近、額部、顴頰部、鼻旁和口唇周圍,邊界清楚,未凸出皮膚,無皮屑脫落,陽光照射會加深其色素,多數(shù)患者無任何自覺癥狀。黃褐斑好發(fā)于中青年女性,且膚色偏深的女性較易發(fā)生,而男性患者較少見?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)上認(rèn)為黃褐斑的發(fā)病機(jī)理極其復(fù)雜,發(fā)病前沒有局部炎癥和外傷史,組織學(xué)特點(diǎn)主要是表皮中黑素和黑素小體增加,黑素細(xì)胞活性增強(qiáng),但真正改變黑素細(xì)胞功能的原因尚不清楚。目前大多數(shù)專家認(rèn)為黃褐斑可能與下列因素有關(guān):紫外線照射、內(nèi)分泌失調(diào)、遺傳、氧自由基、藥物與化妝品、口服避藥、局部微生態(tài)、機(jī)體系統(tǒng)性病變、情緒波動等。

      目前研究中,皮膚美白劑通常都是以酪氨酸酶作為作用靶點(diǎn),通過抑制酪氨酸酶的活性或是阻斷酪氨酸氧化生成黑色素的反應(yīng)來減少皮膚黑色素的生成,從而達(dá)到皮膚美白的效果。大多數(shù)采用的是過氧化氫、氯化氨基汞和各種酚類衍生物作為皮膚美白劑,這些化合物可以迅速的瓦解黑色素組織達(dá)到快速美白的效果,但對皮膚具有腐蝕性、細(xì)胞毒性和過敏性等不良影響,安全性較差。而祛斑目前還停留在使用外用面膜產(chǎn)品或者食療等方法,效果不僅不理想,且對皮膚刺激性較大。

      本發(fā)明將五種天然植物提取物組合使用,既能達(dá)到美白祛斑的功效,還能減少對皮膚的刺激,大大提升了安全性。

      藏荊芥為唇形科植物藏荊芥Nepeta angustifolia C.Y.Wu的全草。其產(chǎn)于西藏(江孜、拉薩),是西藏特有的藏藥材。藏荊芥在臨床上主要用于神昏痙厥、中風(fēng)、癲癇、腦溢血、瘡傷及疼痛等癥的治療,具有良好的療效?!毒е楸静荨分赋觯罕酒贰爸伟d癇,腦溢血,瘡傷及疼痛等癥”,《藏藥志》、《藥名薈萃》也有藏荊芥治療中風(fēng)、邪病、胸膜炎及皮膚病的記載。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),藏荊芥能夠發(fā)揮消腫止痛、創(chuàng)傷愈合等作用。此外,藏荊芥揮發(fā)油的一些組分具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛的作用。

      變?nèi)~海棠葉也稱俄色葉,為甘孜藏族自治州藏族民間的藥食兩用的藥材,來源于薔薇科植物變?nèi)~海棠Malus toringoides(Rehd.)Hughes的干燥葉。最早記載于《藏藥晶鏡本草》和《藏漢大辭典》,據(jù)這兩本醫(yī)書記載,該藥具有攻堅化積、除膩漆滯、保肝利膽等功效,它的神奇藥用功效被錄入了最具權(quán)威的藏醫(yī)學(xué)著作《四部醫(yī)典》。對于變?nèi)~海棠葉的使用,傳統(tǒng)的藏醫(yī)用法為與酥油同煮口服。主要用于治療消化不良及一些肝疾,其療效確切,用法獨(dú)特?,F(xiàn)代藥理研究表明,變?nèi)~海棠葉中含較高的總黃酮類化合物,其對DPPH自由基和羥基自由基有較好的清除活性,且變?nèi)~海棠葉中化學(xué)成分根皮苷、根皮素具有抗動脈粥樣硬化、抗炎等藥理作用。

      黑果枸杞葉為茄科枸杞屬植物黑果枸杞Lycium Ruthenicum Murr.的莖葉。目前,黑果枸杞的研究多集中于其果實所含色素和多糖的提取和生物活性方面,而對其葉片提取物對美容美白未見報道?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),黑果枸杞葉中總黃酮對清除小鼠血清羥基自由基的影響、對紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用以及抑制小鼠肝臟MDA產(chǎn)生方面都具有顯著功效,表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)黑枸杞葉提取物對酪氨酸酶有抑制作用,表現(xiàn)出一定的美白功效。

      三七葉為五加科人參屬植物三七PanaxNotoginseng(Burk.)F.H.Chen的莖葉。經(jīng)研究報道,三七葉中富含大量的黃酮苷類、多糖類及三七葉總皂苷,具有抗炎、抗氧化、解痙、抗癌、抗動脈粥樣硬化等作用。動物實驗表明,三七葉總皂苷能夠抑制血液和腦組織過氧化脂質(zhì)(LOP)生成和提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,對于增加皮膚活力和延緩衰老有較好的作用。此外,三七莖葉提取物能夠有效清除氧自由基,對皮膚有較好的抗氧化作用。

      獨(dú)一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo為唇形科植物獨(dú)一味屬,藏語稱“大巴”、“打布巴”。分布于青海、甘肅、四川西部及云南西北部。其根及根莖或全草入藥,藥材表面枯黃色或黃褐色,味苦、性平,具有活血祛瘀、消腫止痛之功效,是我國藏、蒙、納西等民族常用草藥之一?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),獨(dú)一味有較好的活血作用,應(yīng)用于本發(fā)明中能夠加速皮膚細(xì)胞代謝,有效減少色斑沉積。此外,獨(dú)一味提取物中的皂苷能夠起到一定的抗菌作用,應(yīng)用于本發(fā)明可以保證皮膚不受細(xì)菌的干擾,可以使效果更佳。



      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種具有祛斑美白、天然安全、協(xié)同增效的中藥組合提取物以及應(yīng)用。

      為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明的技術(shù)方案如下:

      一種具有祛斑美白功效的中藥組合提取物,該組合提取物由下述按重量份計的中藥原料制備而成:黑果枸杞葉10-40份、三七葉10-40份、藏荊芥10-30份、變?nèi)~海棠葉10-30份、獨(dú)一味10-30份。

      優(yōu)選地,該中藥復(fù)方提取物由下述按質(zhì)量份數(shù)計的中藥原料制備而成:黑果枸杞葉20-40份、三七葉20-40份、藏荊芥10-20份、變?nèi)~海棠葉10-20份、獨(dú)一味10-20份。

      所述具有祛斑美白功效的中藥組合提取物的制備方法,包括以下步驟:

      取干燥的黑果枸杞葉、三七葉、藏荊芥、變?nèi)~海棠葉、獨(dú)一味藥材,粉碎,過20目篩,按照體積質(zhì)量比加入5-8倍量(V/m)50%-80%乙醇,回流提取1-3次,每次提取1-3小時,濾過,濾液合并,在55-75℃條件下減壓回收乙醇至無醇味,再上D101型或AB-8型大孔樹脂柱純化,收集40%-70%乙醇洗脫部分,60℃條件下減壓回收乙醇,得浸膏,50-70℃條件下真空干燥,粉碎,即為本發(fā)明具有祛斑美白功效的中藥組合提取物。

      上述的一種具有祛斑美白功效的中藥組合提取物在制備護(hù)膚品中的應(yīng)用。

      所述具有祛斑美白功效的中藥組合提取物在祛斑美白護(hù)膚品中的質(zhì)量百分含量為0.1-10%,優(yōu)選質(zhì)量百分含量為1-8%,其余為化妝品外用劑型的常用基質(zhì)以及去離子水或純化水或蒸餾水。通過常規(guī)工藝,可制成祛斑美白洗面奶、祛斑美白洗面乳、祛斑美白洗面霜、祛斑美白膏、祛斑美白霜、祛斑美白乳液、祛斑美白水、祛斑美白面膜、祛斑美白凝膠或祛斑美白皂等化妝品外用劑型。

      本發(fā)明的解決方案是基于相關(guān)的醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)理論,結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究技術(shù)與手段,通過大量實驗優(yōu)選與驗證,發(fā)現(xiàn)了黑果枸杞葉、三七葉、藏荊芥、變?nèi)~海棠葉、獨(dú)一味等五味藥材配合使用,可起到明顯的祛斑美白護(hù)膚作用。本發(fā)明所優(yōu)選配方,通過國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索,未發(fā)現(xiàn)相關(guān)應(yīng)用,加之通過大量實驗篩選,所得配方比例為最佳配方比例,配方科學(xué),且安全性高,可用于日常皮膚護(hù)理。

      本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):

      (1)發(fā)現(xiàn)了黑果枸杞葉、三七葉、藏荊芥、變?nèi)~海棠葉、獨(dú)一味配合使用的祛斑美白作用,擴(kuò)大了上述原料的應(yīng)用范圍,特別是在皮膚護(hù)理中的應(yīng)用;

      (2)通過大量的實驗篩選,確定了原料的最佳比例范圍,確保本發(fā)明產(chǎn)品使用的效果;

      (3)本發(fā)明配方效果明確且穩(wěn)定,有效克服了天然產(chǎn)物護(hù)膚品效果不穩(wěn)定,也克服了單純化學(xué)成分安全系數(shù)較低等缺點(diǎn)。

      具體實施方式

      下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)解決方案,這些實施例不能理解為是對技術(shù)方案的限制。

      實施例1

      黑果枸杞葉40份、三七葉30份、藏荊芥10份、變?nèi)~海棠葉10份、獨(dú)一味10份

      取干燥的黑果枸杞葉、三七葉、藏荊芥、變?nèi)~海棠葉、獨(dú)一味藥材,粉碎,過20目篩,按照體積質(zhì)量比加入8倍量(V/m)70%乙醇,回流提取2次,每次提取2小時,濾過,濾液合并,在65℃條件下減壓回收乙醇至無醇味,再上AB-8型大孔樹脂柱純化,收集60%乙醇洗脫部分,60℃條件下減壓回收乙醇,得浸膏,70℃條件下真空干燥,粉碎,即為本發(fā)明具有祛斑美白功效的中藥組合提取物。

      實施例2

      黑果枸杞葉30份、三七葉30份、藏荊芥10份、變?nèi)~海棠葉10份、獨(dú)一味20份

      取干燥的黑果枸杞葉、三七葉、藏荊芥、變?nèi)~海棠葉、獨(dú)一味藥材,粉碎,過20目篩,按照體積質(zhì)量比加入5倍量(V/m)60%乙醇,回流提取3次,每次提取1小時,濾過,濾液合并,在55℃條件下減壓回收乙醇至無醇味,再上D101型大孔樹脂柱純化,收集50%乙醇洗脫部分,60℃條件下減壓回收乙醇,得浸膏,60℃條件下真空干燥,粉碎,即為本發(fā)明具有祛斑美白功效的中藥組合提取物。

      實施例3

      黑果枸杞葉20份、三七葉40份、藏荊芥20份、變?nèi)~海棠葉10份、獨(dú)一味10份

      取干燥的黑果枸杞葉、三七葉、藏荊芥、變?nèi)~海棠葉、獨(dú)一味藥材,粉碎,過20目篩,按照體積質(zhì)量比加入6倍量(V/m)80%乙醇,回流提取1次,每次提取3小時,濾過,濾液合并,在75℃條件下減壓回收乙醇至無醇味,再上AB-8型大孔樹脂柱純化,收集70%乙醇洗脫部分,60℃條件下減壓回收乙醇,得浸膏,55℃條件下真空干燥,粉碎,即為本發(fā)明具有祛斑美白功效的中藥組合提取物。

      實施例4

      黑果枸杞葉20份、三七葉20份、藏荊芥20份、變?nèi)~海棠葉20份、獨(dú)一味20份

      取干燥的黑果枸杞葉、三七葉、藏荊芥、變?nèi)~海棠葉、獨(dú)一味藥材,粉碎,過20目篩,按照體積質(zhì)量比加入7倍量(V/m)50%乙醇,回流提取3次,每次提取1.5小時,濾過,濾液合并,在70℃條件下減壓回收乙醇至無醇味,再上D101型大孔樹脂柱純化,收集40%乙醇洗脫部分,60℃條件下減壓回收乙醇,得浸膏,65℃條件下真空干燥,粉碎,即為本發(fā)明具有祛斑美白功效的中藥組合提取物。

      實施例5

      黑果枸杞葉20份、三七葉35份、藏荊芥15份、變?nèi)~海棠葉15份、獨(dú)一味15份

      取干燥的黑果枸杞葉、三七葉、藏荊芥、變?nèi)~海棠葉、獨(dú)一味藥材,粉碎,過20目篩,按照體積質(zhì)量比加入8倍量(V/m)60%乙醇,回流提取2次,每次提取2小時,濾過,濾液合并,在60℃條件下減壓回收乙醇至無醇味,再上AB-8型大孔樹脂柱純化,收集60%乙醇洗脫部分,60℃條件下減壓回收乙醇,得浸膏,70℃條件下真空干燥,粉碎,即為本發(fā)明具有祛斑美白功效的中藥組合提取物。

      實施例6

      實施例1提取物、實施例2提取物、實施例3提取物對L-酪氨酸酶活性抑制實驗

      1材料與方法:

      1.1樣品

      實施例1提取物、實施例2提取物、實施例3提取物、熊果苷(陽性對照)。

      1.2實驗方法

      (1)磷酸緩沖液的配制:精密稱取Na2HPO4·12H2O 26.797g,NaH2PO4·2H2O 13.803g,分別用去離子水溶解后,定容至500mL容量瓶中。取磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉溶液各100mL至500mL容量瓶中,去離子水定容,搖勻,即為pH=6.8的磷酸緩沖液。

      (2)樣品溶液的配制:將上述四種樣品用DMSO分別配制成濃度0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL待測樣品溶液。

      (3)底物L(fēng)-酪氨酸溶液的配制:底物L(fēng)-酪氨酸用磷酸緩沖液配制成質(zhì)量濃度為0.05%的L-酪氨酸溶液。

      (4)酪氨酸酶溶液的配制:酪氨酸酶用磷酸緩沖溶液配制成100U/mL的溶液。

      (5)酪氨酸酶抑制率的測定:按表1準(zhǔn)確吸取除酪氨酸酶溶液的C1、C2、T1、T2四組反應(yīng)樣液,在37℃水浴恒溫10分鐘后,再加入酪氨酸酶溶液,反應(yīng)10分鐘,以C2為C1的參比,測出體系在475nm處吸光度A1,以T2為T1的參比,測出體系吸光度A2。為平行樣品帶來的系統(tǒng)誤差,在C1和C2中分別加入了ImL的DMSO。為消除樣品在475nm處吸光度誤差,在T2中也加入了lmL樣品溶液。按下列公式計算酪氨酸酶的抑制率,結(jié)果見表2。

      其中A1為未加樣品的反應(yīng)液的吸光度值的改變,A2為加入樣品后反應(yīng)液的吸光度值的改變。

      表1酪氨酸酶活性抑制實驗試劑用量表

      2實驗結(jié)果

      表2本發(fā)明提取物對酪氨酸酶活性抑制率的影響(%)

      結(jié)果表明,本發(fā)明三種實施例提取物對酪氨酸酶活性均有較好的抑制作用,其中,實施例2提取物的抑制效果最好,濃度在0.2mg/mL時,其抑制率達(dá)到53.91%,實施例1提取物的濃度在0.3mg/mL時,其抑制率為52.01%,實施例3提取物的濃度在0.3mg/mL時,其抑制率為56.23%,三種實施例配方隨著濃度的增加,酪氨酸酶的抑制率也相應(yīng)增加,其中,實施例2的酪氨酸酶抑制率總體高于實施例1和實施例3。結(jié)果說明三種實施例提取物對酪氨酸酶的抑制效果明顯,三種實施例提取物均具有良好的美白效果,其中,尤以實施例2提取物的效果最佳,當(dāng)濃度為0.8mg/mL時,對酪氨酸酶活性的抑制率與熊果苷相當(dāng)。

      實施例7

      實施例1提取物、實施例2提取物、實施例3提取物抗氧化實驗

      1實施例1提取物、實施例2提取物、實施例3提取物清除DPPH自由基實驗

      1.1材料與方法

      1.1.1樣品

      實施例1提取物、實施例2提取物、實施例3提取物、維生素C(陽性對照)。

      1.1.2實驗方法

      將上述四種樣品用無水乙醇分別配制成濃度0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL待測樣品溶液。取2.5mL樣品溶液,加入2.5mL濃度為50mg/L的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液,立即混勻,在室溫下放入暗室反應(yīng)30min,同時,取2.5mL樣品溶液,加入95%的乙醇溶液2.5ml混合均勻,在517nm處測定吸光度。按下列公式計算DPPH自由基清除率,結(jié)果見表3。

      As:2.5mlLDPPH溶液與2.5mL不同濃度的樣品溶液組成的混合液的吸光度;

      A:為2.5mL不同濃度的測試液與2.5mL無水乙醇組成的混合液的吸光度;

      A0:為2.5mL DPPH溶液與2.5mL無水乙醇組成的混合溶液的吸光度。

      1.2實驗結(jié)果

      表3本發(fā)明提取物對DPPH自由基清除率的影響(%)

      2實施例1提取物、實施例2提取物、實施例3提取物清除ABTS自由基實驗

      2.1材料與方法

      2.1.1樣品

      實施例1提取物、實施例2提取物、實施例3提取物、維生素C(陽性對照)。

      2.1.2實驗方法

      將上述四種樣品用95%乙醇分別配制成濃度0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL待測樣品溶液。精密量取7mmol/L的ABTS溶液(由蒸餾水配制)0.20ml,與0.20ml的2.6mmol/L的過硫酸鉀溶液混合,稀釋40-50倍,使溶液754nm處的吸光度值保持在0.7±0.02,既得ABTS自由基工作液,室溫下避光保存。分別吸取4mlABTS與1ml茶葉樣品充分混合均勻,靜置6min,以95%乙醇作為空白照,754nm處測定吸光度值。按照下列公式計算清除率:

      其中,A0為ABTS自由基本身的吸光度值,A為樣品對ABTS自由基作用后的吸光度值。結(jié)果見表4。

      2.2實驗結(jié)果

      表4本發(fā)明提取物對ABTS自由基清除率的影響(%)

      上述抗氧化實驗結(jié)果表明,本發(fā)明三種實施例提取物均有良好的抗氧化作用,其中,實施例2提取物的抗氧化作用優(yōu)于實施例1和實施例3提取物?,F(xiàn)代研究表明,黑色素形成與氧自由基有關(guān),故通過清除氧自由基,可有效減少黑色素的生成,起到美白作用。上述抗氧化實驗表明,實施例2提取物的抗氧化活性強(qiáng)于其他實施例,結(jié)果與L-酪氨酸酶活性抑制實驗一致。

      實施例8

      實施例1提取物、實施例2提取物、實施例3提取物對B16黑色素瘤細(xì)胞增殖率、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性以及黑色素生成的影響

      1樣品

      實施例1提取物、實施例2提取物、實施例3提取物、熊果苷(陽性對照)。

      2實驗方法

      2.1B16黑色素瘤細(xì)胞的培養(yǎng):B16黑色素瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于恒溫培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中進(jìn)行培養(yǎng),使細(xì)胞生長處于數(shù)分裂期,育至呈單層貼壁細(xì)胞。取孵育好的細(xì)胞,用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度,按照100μL/孔加到96孔中,使每個孔中的細(xì)胞濃度為1×104/mL,在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后吸棄培養(yǎng)液。將96孔板劃分為:空白組、實施例1提取物組、實施例2提取物組、實施例3提取物組、陽性對照組,每組設(shè)6個復(fù)孔。待樣品作用后,每孔加入10μLMTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)后,棄上清液,每孔加入100μLDMSO,震蕩均勻,在酶標(biāo)儀490nm處測定吸光度,計算細(xì)胞增值率。細(xì)胞增殖率以藥物處理組

      A490/空白對照組A490×100%表示,結(jié)果見表5。

      2.2B16黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的測定:細(xì)胞培養(yǎng)方法同2.1,待所有細(xì)胞貼壁后,棄上清液,加待測樣品處理。空白對照組不加待測樣品,加同量的培養(yǎng)液。待樣品作用72h后,棄上清液,用PBS溶液沖洗兩次后,每孔加入90μLPBS溶液,利用反復(fù)凍融裂解細(xì)胞后,每孔加入10μLL-多巴溶液,37℃下培養(yǎng)后,以酶標(biāo)儀來測定每孔的吸光度值。計算細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性抑制率。酪氨酸酶活性以(藥物處理組A475值/細(xì)胞數(shù))/(空白對照組A475值/細(xì)胞數(shù))×100%來表示,結(jié)果見表6。

      2.3B16黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的測定:細(xì)胞培養(yǎng)方法同2.1,待所有細(xì)胞貼壁后,棄上清液,加待測樣品處理。空白對照組不加待測樣品,加同量的培養(yǎng)液。待樣品作用72h后,棄上清液,用PBS溶液沖洗兩次后,每孔加入胰蛋白酶,細(xì)胞消化后,加培養(yǎng)液停止消化。進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。將細(xì)胞懸浮液離心,棄上清液,往沉淀中加入NaOH溶液,80℃下加熱半小時后,用分光光度計測定吸光度(波長475nm)。計算黑色素合成抑制率。黑素量以(藥物處理組A475值/細(xì)胞數(shù))/(空白對照組A475值/細(xì)胞數(shù))×100%來表示,結(jié)果見表7。

      3實驗結(jié)果

      表5本發(fā)明提取物對黑色素瘤細(xì)胞增殖率的影響(%,n=6)

      注:與熊果苷比較,*P<0.05,**P<0.01。

      表5結(jié)果表明,本發(fā)明三個實施例提取物濃度在50-500μg/ml的范圍內(nèi),對黑色素瘤細(xì)胞的增殖率均無明顯影響,說明本發(fā)明三個實施例提取物對細(xì)胞的活力無明顯影響;而熊果苷對在此濃度范圍內(nèi),對黑色素瘤細(xì)胞的增殖率的抑制作用明顯,100μg/ml-500μg/ml的范圍內(nèi),細(xì)胞增殖率與三個實施例比較,均有極顯著性差異(P<0.01)。本發(fā)明提取物對細(xì)胞增殖無明顯影響,其安全性高。

      表6本發(fā)明提取物對黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響(%,n=6)

      注:與熊果苷比較,*P<0.05,**P<0.01。

      表6結(jié)果顯示,本發(fā)明三個實施例提取物對黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性均有明顯的抑制作用。其中,實施例2提取物在50-500μg/ml濃度范圍內(nèi),對酪氨酸酶活性均有明顯抑制作用,與熊果苷比較,其抑制率無顯著性差異,且其抑制作用也明顯強(qiáng)于實施例1提取物與實施例3提取物。實施例1提取物和實施例3提取物,在50-500μg/ml濃度范圍內(nèi),對黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性也有較好的抑制作用,但其作用弱于熊果酸,與其比較,有顯著性差異(P<0.05或0.01)。

      表7本發(fā)明提取物對黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的影響(%,n=6)

      注:與熊果苷比較,*P<0.05,**P<0.01。

      表7結(jié)果表明,本發(fā)明三個實施例提取物對黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑色素含量均有明顯的降低作用,其中,實施例2提取物的作用最為明顯,在50-500μg/ml濃度范圍內(nèi),均能降低黑色素含量,且與熊果苷比較,無顯著性差異;而實施例1和實施例3提取物均能降低黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑色素含量,但其效果弱于熊果苷,有顯著性差異(P<0.05或0.01)。

      黑色素瘤細(xì)胞實驗結(jié)果表明,本發(fā)明三個實施例提取物均能抑制黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性,降低細(xì)胞內(nèi)黑色素含量,而對細(xì)胞增殖率無明顯影響,其安全性高于熊果酸,而實施例2提取物對黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性抑制率以及黑色素含量的降低作用與熊果苷相當(dāng),說明本發(fā)明提取物是具有安全、有效的美白作用。

      實施例9

      本發(fā)明實施例1產(chǎn)品、實施例2產(chǎn)品、實施例3產(chǎn)品人體試用評價實驗

      1祛斑美白霜的制備

      本發(fā)明取上述復(fù)方中藥提取物配制成祛斑美白霜,配方如下(按質(zhì)量百分比計):

      A相:硬脂酸 3.0%

      凡士林 8.0%

      單硬脂酸甘油酯 3.0%

      液狀石蠟 10.0%

      十六醇 2.0%

      苯甲酸 0.2%

      B相:純化水 55.0%

      丙二醇 5.0%

      聚乙二醇1500 5.0%

      吐溫-40 3.0%

      三乙醇胺 0.5%

      亞硫酸鈉 0.1%

      C相:復(fù)方中藥提取物 5.0%

      D相:香精 0.2%

      制備工藝如下:

      將A相和B相分別加熱至80℃,充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?,?0℃條件下,將B相攪拌加入A相中,再加入C相,繼續(xù)攪拌,至溫度降至45℃時,加入D相,攪拌至室溫,即得祛斑美白霜。

      將實施例1提取物、實施例2提取物、實施例3提取物按照上述方法制成相應(yīng)的祛斑美白霜,進(jìn)行相應(yīng)的人體實驗。

      2材料與方法

      2.1樣品

      實施例1提取物祛斑美白霜、實施例2提取物祛斑美白霜、實施例3提取物祛斑美白霜、市售祛斑美白霜(主要成分:甘草、牛油果、珍珠等)。

      2.2實驗方法

      選取自愿試用者80人(男性40人,女性40人,年齡18-25歲),面部有斑點(diǎn)、色素沉淀、皮膚暗黃等問題,無化妝品過敏史。將志愿者分成4組,每組20人,男女比例各半。第一組,試用實施例1產(chǎn)品;第二組,試用實施例2產(chǎn)品;第三組,試用實施例3產(chǎn)品,第四組,試用市售祛斑美白霜。

      使用方法:早晚清潔面部后,取適量試用產(chǎn)品均勻涂抹于面部,輕輕拍打吸收,并輕輕按摩3-5分鐘,讓肌膚充分吸收,連續(xù)試用8周。通過問卷形式,調(diào)查試用者對所使用產(chǎn)品的主觀評價,包括祛斑效果,美白效果以及產(chǎn)品干澀、刺激感等指標(biāo)。結(jié)果見表8。

      3實驗結(jié)果

      表8試用者對產(chǎn)品評價調(diào)查表

      表8為試用者對試用產(chǎn)品的評價表,表中的結(jié)果顯示,本發(fā)明實施例1、實施例2和實施例3祛斑美白霜產(chǎn)品具有較好的祛斑和美白作用,特別是實施例2產(chǎn)品的祛斑、美白作用明顯優(yōu)于市售產(chǎn)品,其效果也優(yōu)于其他兩種實施例產(chǎn)品。三種實施例產(chǎn)品均無過敏和刺激感,產(chǎn)品安全性高。

      上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式,但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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