本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種化學(xué)藥物3-溴丙酮酸，具體來說是3-溴丙酮酸在制備治療肺動(dòng)脈高壓的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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3-溴丙酮酸是一種烷化劑，是細(xì)胞代謝產(chǎn)物丙酮酸、乳酸的類似物，其能夠作用于糖酵解途徑，與己糖激酶(HK-2)活性部位的-XH基結(jié)合(EXH+BrCH₂-CO-COOH→EX-CH₂-CO-COOH+HBr)使該酶的活性被抑制，可有效地減少細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生。3-溴丙酮酸從化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)上都與乳酸非常相似，而乳酸是葡萄糖經(jīng)過糖酵解代謝后的最終產(chǎn)物，這使得3-溴丙酮酸可以借助與乳酸相同的載體進(jìn)出細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。3-溴丙酮酸對于肝癌、乳腺癌以及多藥耐藥表型的腫瘤細(xì)胞具有高效、低毒的作用。但對于肺血管疾病和肺動(dòng)脈高壓的治療作用目前尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供3-溴丙酮酸在制備治療肺動(dòng)脈高壓的藥物中的應(yīng)用，所述的這種3-溴丙酮酸在制備治療肺動(dòng)脈高壓病的藥物中的應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)中治療肺動(dòng)脈高壓藥物效果不佳的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了3-溴丙酮酸在制備治療肺動(dòng)脈高壓的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明通過大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，給予3-溴丙酮酸干預(yù)治療，明確了3-溴丙酮酸對于肺血管的作用。3-溴丙酮酸可降低肺動(dòng)脈高壓大鼠的平均肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力，增加心輸出量，抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖，促進(jìn)凋亡，顯著減輕肺血管重構(gòu)，通過抑制己糖激酶表達(dá)治療肺動(dòng)脈高壓。

附圖說明：

圖1是肺組織蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果。

圖2是肺組織免疫組織化學(xué)增殖因子(PCNA)結(jié)果。

圖3是肺組織免疫組織化學(xué)凋亡(TUNEL)結(jié)果。

圖4是肺組織己糖激酶(HK-1和HK-2)蛋白表達(dá)結(jié)果。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1

一、材料與方法

1.1建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型

雄性SPF級SD大鼠(上海中科院動(dòng)物房提供)，體重200-220g。一次性皮下注射野百合堿(Monocrotaline,MCT,60mg/kg)，3周后，隨機(jī)采用右心導(dǎo)管方法測定肺動(dòng)脈壓力及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，鑒定是否造模成功。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)

(1)模型組(MCT組)：10只大鼠，肺動(dòng)脈高壓模型建立成功后，灌胃給予生理鹽水，連續(xù)3周。

(2)3-溴丙酮酸小劑量組(3-BrPA 15mg·kg·d組)：10只大鼠，肺動(dòng)脈高壓模型建立成功后，灌胃給予通心絡(luò)，連續(xù)3周。

(3)3-溴丙酮酸大劑量組(3-BrPA 30mg·kg·d組)：10只大鼠，肺動(dòng)脈高壓模型建立成功后，灌胃給予通心絡(luò)，連續(xù)3周

(4)正常對照組(Control組)：10只大鼠，正常大鼠，灌胃給予生理鹽水(0.3ml·kg·d)，連續(xù)3周。

1.3血流動(dòng)力學(xué)測定

1.3.1右心導(dǎo)管法測定給藥3周后各組動(dòng)物的平均肺動(dòng)脈壓(mean pulomonary arterial pressure,mPAP)、右心室收縮末期壓力(right ventricle systolic pressure,RVSP)、心輸出量以及心率等參數(shù)。具體方法如下：大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(40mg·kg)腹腔麻醉，仰臥固定后分離右側(cè)頸外靜脈約1cm左右，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，并作“V”形切口，將與換能器連接并充滿肝素鹽水的右心導(dǎo)管(自制末端彎曲PE 50導(dǎo)管，內(nèi)徑0.6mm，外徑0.9mm)插入，動(dòng)物生理多導(dǎo)儀記錄右心室收縮末期壓力RVSP、肺動(dòng)脈收縮壓(pulmonary arterial systolic pressure,PASP)、肺動(dòng)脈舒張壓(pulmonary arterial diastolic pressure,PADP)，計(jì)算mPAP。

mPAP(mmHg)＝1/3PASP(mmHg)+2/3PADP(mmHg)

1.3.2心輸出量(Cardiac Output,CO)測定：熱稀釋法測定心輸出量。具體方法：將右心導(dǎo)管回抽至上腔靜脈，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，剪口，將穿有溫度探測器的PE管插入胸主動(dòng)脈或腹主動(dòng)脈。用1ml針筒抽取0-4℃肝素化生理鹽水，迅速向上腔靜脈推進(jìn)0.2-0.3ml，觀察并記錄溫度曲線的變化，計(jì)算心輸出量，同時(shí)計(jì)算肺血管阻力(pulmonary vessel resistance,PVR)。

PVR(Wood)＝mPAP(mmHg)/CO(ml·min)

1.4右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index,RVHI)測定

血流動(dòng)力學(xué)測定完畢后，開胸取出整個(gè)心臟，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，沿著房室溝剪去心房及大血管根部，沿后室壁間溝將右心室游離壁分離，濾紙吸水后稱量右心室游離壁(RV)及左心室+室間隔(LV+S)的重量，并計(jì)算右心室肥厚指數(shù)。

右心室肥厚指數(shù)(RVHI)＝RV/(LV+S)。

1.5肺組織蘇木精-伊紅(HE)染色

處死大鼠后，取右肺中葉以10％中性甲醛溶液固定1天，石蠟包埋，沿肺門水平橫切，厚度約為5μm，進(jìn)行HE染色。切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，蘇木精染色5min，自來水沖洗。根據(jù)染色的深淺，用0.5％鹽酸乙醇分化，自來水浸泡15min，置伊紅液2min，常規(guī)脫水，透明，封片。

1.6肺小動(dòng)脈血管形態(tài)分析

常規(guī)HE染色，隨機(jī)選取直徑100～200μm范圍的肺小動(dòng)脈，運(yùn)用IPP6.0圖像分析軟件測定血管壁厚度(wall thickness,WT)、血管外徑(external diameter,ED)、血管總面積(total area,TA)以及血管腔面積(lumen area,LA)，分析WT％和WA％等衡量血管重構(gòu)的指標(biāo)。

WT％＝(2×WT/ED)×100％

WA％＝[(TA-LA)/TA]×100％

1.7免疫組織化學(xué)檢查

將1.6中石蠟包埋組織切片用0.3％的過氧化氫甲醇溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，然后加入0.3％Triton X100增加細(xì)胞的通透性，清洗后，加入血清稀釋的一抗(分別為PCNA和TUNEL)，4℃存放24-48小時(shí)，加入相應(yīng)的二抗。最后，加入ABC復(fù)合物，清洗后加入顯色液顯影。

1.8Western Blot蛋白免疫印跡檢查

肺組織在組織勻漿器中，冰上勻漿后，加入蛋白裂解液及PMSF，離心40取上清。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法對上清進(jìn)行蛋白定量。取40μg蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37℃封閉，一抗4℃過夜，辣根過氧化酶標(biāo)記二抗孵育1小時(shí)，用圖像分析測定各帶灰度值作定量分析。檢測的蛋白包括：己糖激酶-1和-2(HK-1和HK-2)和β-actin。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)處理由SPSS10.0完成，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

2.1大鼠一般情況與死亡情況

對照組及通心絡(luò)給藥組大鼠體毛光澤，反應(yīng)敏捷，飲食正常。MCT組大鼠逐漸變得虛弱，反應(yīng)遲鈍，蜷縮少動(dòng)，體毛暗淡無光澤。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡情況：本實(shí)驗(yàn)共用40只SD大鼠，死亡2只，均為MCT組，分別死于實(shí)驗(yàn)第18天和20天。大鼠死亡前表現(xiàn)為呼吸困難、口唇發(fā)紺。解剖后可見胸腔積液，腹腔積液，肝臟淤血腫脹。取出心肺后，大體可見肺部瘀點(diǎn)瘀斑，短軸橫切心臟，可見右心室游離壁明顯肥厚，提示大鼠在肺動(dòng)脈高壓病程中發(fā)生了右心衰竭。

2.2血流動(dòng)力學(xué)變化

MCT組大鼠mPAP明顯高于對照組，模型建立成功。與MCT組相比，2個(gè)3-溴丙酮酸劑量組均可顯著降低肺動(dòng)脈高壓大鼠的mPAP和RVSP(p<0.01或p<0.05)，明顯改善肺動(dòng)脈高壓所致心輸出量減少，降低肺血管阻力(PVR)。(見表1)

表1各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

p*<0.05,compared with control group；p*<0.01,compared with MCT group；

p^#<0.05,compared with control group；p^##<0.05,compared with MCT group；

2.3右心室肥厚指數(shù)和肺血管重構(gòu)

一次性皮下注射MCT 21天后，可見明顯的右心室肥厚，RVHI為(0.32±0.03)，3-溴丙酮酸大劑量和小劑量組可明顯改善大鼠右心肥厚指數(shù)(p<0.05或p<0.01)。大鼠肺中小動(dòng)脈圖像分析結(jié)果可見，3-溴丙酮酸可明顯改善肺動(dòng)脈高壓大鼠的右心和肺血管重構(gòu)。MCT組大鼠肺中小動(dòng)脈WT％和WA％均明顯高于正常對照組。3-溴丙酮酸組大鼠肺中小動(dòng)脈WT％和WA％均明顯低于MCT組(p<0.01)。(見表2)

表2各組大鼠中RVHI,WT％W和WA％比較

p*<0.05,compared with control group；p*<0.01,compared with MCT group；

p^#<0.05,compared with control group；p^##<0.05,compared with MCT group；

肺組織HE染色顯示，對照組大鼠肺小動(dòng)脈內(nèi)皮連續(xù)性好，細(xì)胞分布均勻，薄厚一致；MCT組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性破壞，呈立方形或柱狀突向管腔，中層管壁厚度明顯增加，管腔面積明顯變小，伴有血管周圍炎。3-溴丙酮酸劑量組大鼠肺血管小動(dòng)脈內(nèi)皮連續(xù)性良好，管壁厚度較MCT組明顯減少，管腔變寬，血管周圍炎癥減輕。(見圖1)

2.4肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖染色(PCNA)結(jié)果表明，與正常組相比，MCT組增殖核抗原染色陽性的細(xì)胞核明顯增加(紅色箭頭所示)。與MCT組相比，使用了3-溴丙酮酸的各組增殖和抗原染色陽性的細(xì)胞核數(shù)量顯著降低。(見圖2)

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡染色(TUNEL)結(jié)果可見，MCT組與正常組增殖核抗原表達(dá)未見差異，表明MCT組肺血管出現(xiàn)凋亡抵抗。然而，與MCT組相比3-溴丙酮酸各組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的染色陽性細(xì)胞核，即平滑肌細(xì)胞凋亡(紅色箭頭所示)。(見圖3)

2.5己糖激酶蛋白表達(dá)下調(diào)

與Control組相比，MCT組大鼠己糖激酶-1和-2(HK-1和HK-2)蛋白表達(dá)量均顯著升高。然而，與MCT組相比，兩個(gè)3-溴丙酮酸劑量組的HK-1和HK-2蛋白表達(dá)量均明顯上調(diào)。(見圖4)

三、結(jié)論

3-溴丙酮酸可降低肺動(dòng)脈高壓大鼠的平均肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力，增加心輸出量，抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖，促進(jìn)凋亡，顯著減輕肺血管重構(gòu)，通過抑制己糖激酶表達(dá)治療肺動(dòng)脈高壓。