本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，特別涉及一種中藥組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

流行性感冒(influenza)簡(jiǎn)稱(chēng)流感，是由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道感染。每年的季節(jié)性流行感冒病毒與其高突變率密切相關(guān)，嚴(yán)重的是其中一些突變可以導(dǎo)致動(dòng)物宿主的病原體侵染人類(lèi)進(jìn)而引起流感大流行，由此引起的嚴(yán)重并發(fā)癥會(huì)導(dǎo)致在危重患者中有較高的病死率。

多糖不僅是機(jī)體的重要結(jié)構(gòu)成分，而且也是一種重要的信息分子，參與細(xì)胞與細(xì)胞的識(shí)別，細(xì)胞粘附及細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸?shù)?。近年?lái)，大量藥理及臨床研究表明，多糖類(lèi)化合物是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑，它能多途徑、多層面調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，它不僅能激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能促進(jìn)細(xì)胞因子生成、活化補(bǔ)體，從而在抗腫瘤、抗病毒以及抗衰老等方面具有獨(dú)特的功效，目前普遍認(rèn)為多糖是一種無(wú)細(xì)胞毒的免疫促進(jìn)劑。在一般情況下，多糖對(duì)機(jī)體特異性免疫與非特異性免疫、細(xì)胞免疫與體液免疫均有影響。而本配方使用的香菇和茯苓提取物中主要含有的成分就是香菇多糖和茯苓多糖，已有研究表明這兩種多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，在抗病毒方面有良好的效果。

生姜為芳香性辛辣健胃藥，有溫暖、興奮、發(fā)汗、止嘔、解毒等作用，也常被用于治療風(fēng)寒感冒，已有研究表明，生姜具有較強(qiáng)的抗炎、抗病毒作用。陳皮，苦，能瀉能燥，辛能散，溫能和，可用于用于濕阻中焦、脘腹痞脹、便溏泄瀉，以及痰多咳嗽等癥。另外，陳皮還能燥濕而健脾開(kāi)胃，適用于脾胃虛弱、飲食減少、消化不良、大便泄瀉等癥，常與人參、白朮、茯苓等配合應(yīng)用。

但是，目前未見(jiàn)將香菇、茯苓、生姜、陳皮四種原料聯(lián)合抗病毒的報(bào)道。因此，提供一種能夠增強(qiáng)免疫功能、抗病毒的中藥組合物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種中藥組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明主要基于香菇、茯苓、生姜、陳皮這幾種藥物可以作為一種廣譜的免疫促進(jìn)劑的效應(yīng)，利用小鼠作為模型，篩選可增強(qiáng)流感病毒疫苗免疫效果的中藥組合物，從而增強(qiáng)流感疫苗免疫效果，幫助人類(lèi)抵抗流感威脅。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種組合物，由香菇、茯苓、生姜和陳皮組成。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，以質(zhì)量份計(jì)，所述組合物由如下組分組成：

香菇20～30份，茯苓20～30份，生姜5～20份，陳皮5～20份。

在本發(fā)明的另一些具體實(shí)施方案中，以質(zhì)量份計(jì)，所述組合物由如下組分組成：

香菇20～30份，茯苓20～30份，生姜5～10份，陳皮5～10份。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，以質(zhì)量份計(jì)，所述組合物包括如下組分：香菇30份，茯苓30份，生姜20份，陳皮20份。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，以質(zhì)量份計(jì)，所述組合物包括如下組分：香菇20份，茯苓30份，生姜10份，陳皮10份。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，以質(zhì)量份計(jì)，所述組合物包括如下組分：香菇30份，茯苓30份，生姜5份，陳皮5份。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，以質(zhì)量份計(jì)，所述組合物包括如下組分：香菇30份，茯苓20份，生姜5份，陳皮20份。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，以質(zhì)量份計(jì)，所述組合物包括如下組分：香菇20份，茯苓20份，生姜10份，陳皮5份。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述香菇為香菇原藥，所述茯苓為茯苓原藥，所述生姜為生姜原藥，所述陳皮為陳皮原藥。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述中藥組合物的制備方法為：分別取香菇20～30份，茯苓20～30份，生姜5～20份，陳皮5～20份，加入20倍水或乙醇水溶液(50％或70％)，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水或乙醇水溶液(50％或70％)，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，單味藥物的制備方法為：分別取香菇、茯苓、生姜或陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，再次煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備緩解疫苗免疫后動(dòng)物體重降低的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備提高疫苗免疫后動(dòng)物的特異性抗體水平的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備提高疫苗免疫后動(dòng)物的抗病毒能力的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，抗病毒能力為降低H1N1病毒感染小鼠肺部病毒含量以及改善肺部細(xì)胞因子IL-2水平。作為優(yōu)選，所述病毒為流感病毒。更優(yōu)選的，所述病毒為H1N1。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備提高疫苗免疫后動(dòng)物的IL-2含量的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述組合物在制備疫苗免疫增強(qiáng)劑的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種疫苗免疫增強(qiáng)劑，包括所述組合物及藥學(xué)上可接受的輔料。

本發(fā)明提供的含有香菇、茯苓、生姜、陳皮提取物的中藥組合物的抗H1N1病毒作用具體可以體現(xiàn)在其能夠顯著提高H1N1病毒感染小鼠的存活率和生存質(zhì)量，改善H1N1病毒感染小鼠的肺炎性病變程度，并可顯著改善H1N1病毒感染小鼠血清中特異性抗體水平，顯著降低H1N1病毒感染小鼠肺部病毒含量以及改善肺部細(xì)胞因子IL-2水平。

考慮到中藥生姜和陳皮抗感冒藥效相對(duì)比較強(qiáng)，且味道較重，在制作這種配方時(shí)，我們將配方中的生姜和陳皮的劑量減少。本配方有效利用扶正祛邪的方式來(lái)提高機(jī)體抗病毒能力，增強(qiáng)免疫功能。配方中的香菇、茯苓具有扶正之功，生姜、陳皮具有驅(qū)邪之功，扶正和祛邪功效相輔相成，增強(qiáng)免疫功能和抗病毒作用。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開(kāi)了一種中藥組合物及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明提供的中藥組合物中所用原料藥或輔料均可由市場(chǎng)購(gòu)得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1：中藥組合物的制備方法

按照重量份分別為30份、30份、20份、20份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。

實(shí)施例2：中藥組合物的制備方法

按照重量份分別為20份、30份、10份、10份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。

實(shí)施例3：中藥組合物的制備方法

按照重量份分別為30份、30份、5份、5份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。

實(shí)施例4：中藥組合物的制備方法

按照重量份分別為30份、20份、5份、20份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍50％乙醇水溶液，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍50％乙醇水溶液，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。

實(shí)施例5：中藥組合物的制備方法

按照重量份分別為20份、20份、10份、5份稱(chēng)取香菇、茯苓、生姜和陳皮，加入20倍70％乙醇水溶液，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍70％乙醇水溶液，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得中藥組合物。

實(shí)施例6：香菇提取物的制備方法

稱(chēng)取適量的香菇，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得香菇提取物。

實(shí)施例7：茯苓提取物的制備方法

稱(chēng)取適量的茯苓，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得茯苓提取物。

實(shí)施例8：生姜提取物的制備方法

稱(chēng)取適量的生姜，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得生姜提取物。

實(shí)施例9：陳皮提取物的制備方法

稱(chēng)取適量的陳皮，加入20倍水，煎煮2h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，煎煮1h，過(guò)濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得陳皮提取物。

實(shí)施例10：中藥組合物對(duì)H1N1病毒感染小鼠的干預(yù)研究

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF小鼠，雌性，小鼠用標(biāo)準(zhǔn)全價(jià)飼料進(jìn)行飼胃，購(gòu)買(mǎi)小鼠當(dāng)天要根據(jù)小鼠體重對(duì)所有小鼠進(jìn)行分籠及編號(hào)，每只鼠籠5只小鼠。本次實(shí)驗(yàn)所需小鼠均從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心訂購(gòu)且均由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)及管理。

1.1.2供試品

本次研究配方藥物對(duì)流感疫苗免疫效力影響實(shí)驗(yàn)所用的藥物由公司提供，需在4攝氏度避光保存。

1.1.3主要試劑及儀器

流感病毒毒株：WSN(H1N1)、PR8(H1N1)；

0.5％牛蛋白血清(BSA)：購(gòu)自Biosharp公司；

小鼠IgG-HRP：購(gòu)自Southern Biotech公司；

小鼠細(xì)胞因子IL-2ELISA試劑盒，美國(guó)R&D Systems公司；

小鼠細(xì)胞因子IL-5ELISA試劑盒，美國(guó)R&D Systems公司；

禽流感病毒ELISA檢測(cè)試劑盒，武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司；

小鼠IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司；

電子天平BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

臺(tái)式高速離心機(jī)TG16-Ⅱ，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；

酶標(biāo)儀318C，美國(guó)Perkin Elmer公司；

1.1.4實(shí)驗(yàn)器材

灌胃針，1ml注射器，1.5mlEP管,移液槍?zhuān)x心機(jī)，小剪刀鑷子等。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理

采用Excel軟件的隨機(jī)數(shù)字功能，對(duì)SPF級(jí)小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分為空白對(duì)照組、疫苗對(duì)照組、維他命C對(duì)照組、實(shí)施例1組、實(shí)施例2組、實(shí)施例3組、實(shí)施例4組、實(shí)施例5組、實(shí)施例6組(香菇提取物組)、實(shí)施例7組(茯苓提取物組)、實(shí)施例8組(生姜提取物組)、實(shí)施例9組(陳皮提取物組)，每組15只。分別按照下列方法操作：

疫苗對(duì)照組：生理鹽水灌胃30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。

空白對(duì)照組：生理鹽水灌胃30天。

維他命C(VC)對(duì)照組：VC灌胃(0.5g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。(參照文獻(xiàn)《Red ginseng and vitamin C increase immune cell activity and decrease lung inflammation induced by influenza A virus/H1N1infection》、《大劑量維生素C輔助治療流行性感冒的臨床觀察》，維生素C用于抗病毒的成人每日服用量為3g左右，按照等效劑量折算為小鼠給藥劑量為0.5g/kg體重)

實(shí)施例1組：實(shí)施例1組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。

實(shí)施例2組：實(shí)施例2組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。

實(shí)施例3組：實(shí)施例3組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。

實(shí)施例4組：實(shí)施例4組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。

實(shí)施例5組：實(shí)施例5組合物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。

實(shí)施例6組(香菇提取物組)：實(shí)施例6香菇提取物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。

實(shí)施例7組(茯苓提取物組)：實(shí)施例7茯苓提取物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。

實(shí)施例8組(生姜提取物組)：實(shí)施例8生姜提取物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。

實(shí)施例9組(陳皮提取物組)：實(shí)施例9陳皮提取物灌胃(2g生藥/kg)30天，第15、23天，分別肌肉注射流感病毒疫苗。

第31天，每組取5只小鼠，取血、肺臟。

第32天(第0天)，所有組小鼠分別用50μl H1N1流感病毒滴鼻感染。

第35天(感染后第3天)，每組取3只小鼠，取血、肺臟。

第38天(感染后的第6天)，每組取3只小鼠，取血、肺臟。

第33天到第46天(感染后的2周內(nèi))，記錄體重；觀察小鼠精神狀態(tài)和臨床發(fā)病情況并進(jìn)行臨床打分。

第46天(感染后的第14天)，稱(chēng)重后處死小鼠，取血、肺臟。

1.2.2樣品采集及處理

血清采集

小鼠經(jīng)摘眼球取血，讓血液自由滴入1.5ml離心管中，4℃靜置2小時(shí)后3500rpm，10min，離心取血清，分裝在EP管中，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

小鼠經(jīng)尾靜脈采血時(shí)根據(jù)每次要采血的小鼠數(shù)量準(zhǔn)備好1.5ml EP管，在每個(gè)管中加入40ulEDTA抗凝劑待用。

2結(jié)果

2.1中藥組合物對(duì)病毒感染小鼠體重的影響

表1病毒感染后小鼠體重占初始體重百分比(n＝15)

注：與疫苗組比較，*P＜0.05；單味藥與實(shí)施例3比較，^#P＜0.05；

如表1所示，空白對(duì)照組小鼠體重有增長(zhǎng)但未出現(xiàn)明顯波動(dòng)；疫苗對(duì)照組小鼠在感染病毒后第一天體重明顯下降，第二天之后體重有了明顯恢復(fù)而且波動(dòng)不大，維持在原來(lái)體重的97％左右；維他命C對(duì)照組的小鼠在感染病毒后第一天體重明顯下降，第二天之后體重有回升且波動(dòng)不大，維持在原來(lái)體重的98％左右；各個(gè)實(shí)施例組小鼠在感染病毒后第一天體重明顯下降，第二天之后體重開(kāi)始明顯回升且逐漸恢復(fù)到初始體重，其中實(shí)施例3組小鼠體重恢復(fù)較為顯著，體重恢復(fù)到最大時(shí)達(dá)到初始體重的105％左右，證明實(shí)施例3的中藥組合物對(duì)感染病毒的小鼠體重有明顯的恢復(fù)效果，且實(shí)施例3組效果明顯(P＜0.05)優(yōu)于各單味藥組。

2.2中藥組合物對(duì)病毒感染小鼠血清中特異性抗體的影響

表2病毒感染前后小鼠血清中特異性抗體的變化

注：與疫苗組比較，*P＜0.05；單味藥與實(shí)施例3和5比較，^#P＜0.05；

The results represent means±SEM(n＝3)

如表2，在病毒感染前，空白對(duì)照組作為陰性對(duì)照，血清中不存在特異性抗體，各疫苗免疫組(單純的疫苗組和各實(shí)施例組)血清中的特異性抗體水平?jīng)]有明顯差異。病毒感染第3天開(kāi)始，各組的特異性抗體顯著增加，各個(gè)實(shí)施例組小鼠的特異性抗體顯著高于單純的疫苗組，尤其是實(shí)施例3組和實(shí)施例5組的小鼠特異性抗體水平較高，而空白對(duì)照組的抗體始終處于較低水平。在感染后第6、14天，與疫苗組相比，各個(gè)實(shí)施例組小鼠的特異性抗體水平仍舊穩(wěn)定處于較高的水平，顯著(P＜0.05)高于單純的疫苗組，尤其是實(shí)施例3組和5組的小鼠特異性抗體水平最高，且效果顯著(P＜0.05)優(yōu)于各單味藥組。

2.3中藥組合物對(duì)病毒感染小鼠肺勻漿中H1N1病毒含量的影響

表3病毒感染后小鼠肺部H1N1病毒含量的變化

注：與疫苗組比較，*P＜0.05；單味藥與中藥組合物3和5比較，^#P＜0.05；

The results represent means±SEM(n＝3)

從表3中可以看到，病毒感染后第3天開(kāi)始，疫苗對(duì)照組以及維他命C對(duì)照組小鼠肺部H1N1病毒含量稍微有所升高；感染后第6、14天，各實(shí)施例組肺部H1N1病毒含量均處于相對(duì)正常的水平，其中實(shí)施例3組和5組小鼠肺部H1N1病毒滴度相對(duì)較低，并且實(shí)施例3組和5組小鼠肺部H1N1病毒滴度顯著(P＜0.05)低于各單味藥組。

2.4中藥組合物對(duì)小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子IL-2的影響

表4病毒感染前后小鼠肺IL-2的變化

注：與疫苗組比較，*P＜0.05；單味藥與中藥組合物3比較，^#P＜0.05；

The results represent means±SEM(n＝3)

注：與疫苗組比較，*P＜0.05；The results represent means±SEM(n＝3)

單味藥與中藥組合物比較，#P<0.05，

小鼠感染病毒后，肺勻漿細(xì)胞因子的水平發(fā)生了明顯變化，IL-2隨著病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。由表4可知，在改善肺勻漿IL-2的水平方面，各個(gè)實(shí)施例的對(duì)小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子IL-2水平均有改善作用，尤其是實(shí)施例3組的小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子IL-2水平最高，并且實(shí)施例3的效果顯著(P＜0.05)優(yōu)于各單味藥組。

由以上結(jié)果可以看出，這種含有香菇、茯苓、生姜、陳皮提取物的中藥組合物能夠顯著提高H1N1病毒感染小鼠機(jī)體的免疫功能，改善H1N1病毒感染小鼠的肺炎性病變程度；進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這種含有香菇、茯苓、生姜、陳皮提取物的中藥組合物可以顯著改善H1N1病毒感染小鼠血清中特異性抗體水平，并能顯著降低H1N1病毒感染小鼠肺部病毒含量以及改善肺部細(xì)胞因子IL-2水平。因此，這種含有香菇、茯苓、生姜、陳皮提取物的中藥組合物在一定程度上可以增強(qiáng)流感病毒疫苗的免疫效果，表明這種含有香菇、茯苓、生姜、陳皮提取物的中藥組合物具有良好的抗病毒作用。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。