本發(fā)明涉及一種竹柳皮抗炎活性提取物的制備方法和應(yīng)用，該提取物分離自竹柳皮乙酸乙酯部位，具有抗炎鎮(zhèn)痛活性，屬于天然產(chǎn)物有效成分的提取、分離純化領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

竹柳(Salix ssp.)又稱(chēng)美國(guó)竹柳，為楊柳科(Saliaceae)柳屬(Salix)植物，是美國(guó)寒柳、朝鮮柳和筐柳雜交的優(yōu)良品系(王子成，2008)，其在繼承傳統(tǒng)柳屬植物眾多的優(yōu)良品性的同時(shí)表現(xiàn)出生長(zhǎng)快、材質(zhì)好、抗性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)(張健等，2009)，是常用的速生用材林樹(shù)種和生物質(zhì)能源樹(shù)種(徐克順，2011)。

近年來(lái)，竹柳種植面積在我國(guó)迅速擴(kuò)大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，其成片林已超過(guò)1300hm²(胡國(guó)濤等，2016)，竹柳的儲(chǔ)備量豐富，但目前竹柳的產(chǎn)業(yè)化尚不成熟，鮮有深加工產(chǎn)品和高附加值產(chǎn)品。而同屬柳樹(shù)作為藥用的歷史悠久，明代《本草綱目》中就記載“柳為本經(jīng)下品，其性苦寒、無(wú)毒，可治療風(fēng)水黃疽，瘡癰腫痛，痰熱淋疾，濕痹等疾癥”，且其各部分都可入藥，可謂“全身都是寶”?，F(xiàn)代有關(guān)柳屬植物的化學(xué)和藥理活性的研究表明，其化學(xué)成分包括黃酮類(lèi)、酚苷類(lèi)、苯丙素類(lèi)、醌類(lèi)、甾體類(lèi)、萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等，具有抗炎、止痛、抗氧化、抗菌、抗誘變、降壓、利尿等藥理作用(劉墨祥等，1997；封士蘭等，2001；趙紅娟等，2010；毛竹君等，2013)。故作為同屬的竹柳，雖然目前與其化學(xué)成分和生物活性方面相關(guān)的研究鮮有報(bào)道。但已有研究表明竹柳表現(xiàn)出與同屬植物相似的生物活性，有巨大的潛力可開(kāi)發(fā)成高附加值的藥品。

CN105237594A公開(kāi)了一種從竹柳皮中提取水楊苷的制備方法，該方法是：將竹柳樹(shù)皮粉碎后，采用連續(xù)微波干燥法，制得竹柳樹(shù)皮粉，用無(wú)離子水超聲逆流提取后得提取液，提取液經(jīng)純化、濃縮、干燥后獲得水楊苷。該發(fā)明中僅就竹柳中的水楊苷進(jìn)行了提取，而未對(duì)竹柳中其他有效成分進(jìn)行提取研究。且現(xiàn)有技術(shù)中也未有將柳或竹柳乙酸乙酯提取物用于銀屑病治療的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的竹柳化學(xué)成分、生物活性等相關(guān)研究的不足以及以竹柳為原料開(kāi)發(fā)的醫(yī)藥產(chǎn)品的空白，提供一種從竹柳皮中提取抗炎鎮(zhèn)痛活性組分的方法，即，竹柳皮抗炎活性提取物的制備方法，并研究了該活性組分在醫(yī)藥產(chǎn)品領(lǐng)域中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，

本發(fā)明的第一個(gè)方面在于提供一種竹柳皮抗炎活性提取物的制備方法，其特征是，將竹柳皮粉末，用5至20倍乙醇超聲提取1～5次，每次30-120min，得提取液；將提取液減壓濃縮至無(wú)乙醇?xì)埩?，加入蒸餾水溶解，用乙酸乙酯萃取，經(jīng)兩次純化后既得。

具體步驟如下：

A)提?。褐窳し勰?，粒度10～40目，按照料液比1:5～1:20加入乙醇溶液，超聲提取條件為，頻率9～18KHz，溫度20～50℃，時(shí)間30～120min，超聲次數(shù)1～5次，獲得提取液；提取液減壓濃縮至無(wú)乙醇?xì)埩簦尤脒m量蒸餾水溶解，用1～3倍量乙酸乙酯萃取1～3次，萃取液減壓濃縮，真空干燥(600～1000Pa，40～50℃，120～180min)；得到粗提物粉末；

B)VLC(減壓硅膠柱層析)純化：100～300目硅膠濕法裝柱，徑高比1:5，步驟A)所得粉末干法上樣，以石油醚為洗脫劑，除去乙酸乙酯萃取物中的低極性雜質(zhì)；以石油醚和乙酸乙酯體積比為2:8的混合液為洗脫劑，洗脫液減壓濃縮至一定體積，真空干燥(600～1000Pa，40～50℃，120～180min)，得到初次純化的竹柳皮抗炎活性提取物粉末；

C)Sephadex LH-20純化：凝膠柱徑高比1:18，步驟B)所得粉末用少量氯仿-甲醇混合液溶解，濕法上樣，以氯仿-甲醇(1:1)為洗脫劑，流速為0.3～0.5BV·h^-1，等度洗脫，HPLC檢測(cè)合并，得到除去色素的具有抗炎鎮(zhèn)痛活性的竹柳皮活性提取物溶液；

D)干燥及保存：步驟C)的溶液減壓濃縮至一定體積，真空干燥(600～1000Pa，40～50℃，120～180min)，經(jīng)消毒、殺菌后，得竹柳皮抗炎活性提取物粉末。

優(yōu)選的，所述步驟A)中乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為70％，原料粒度為24目，料液比為1：10，超聲頻率18KHz，超聲溫度30℃，超聲時(shí)間60min，超聲次數(shù)3次。萃取劑(乙酸乙酯)的用量與溶解提取物所用蒸餾水的用量相同，萃取3次，于800Pa，45℃條件下真空干燥150min；

優(yōu)選的，所述步驟B)中硅膠粒度為200～300目；以石油醚為洗脫劑洗脫2BV，除去低極性雜質(zhì)；以體積比為2:8的石油醚和乙酸乙酯混合液為洗脫劑洗脫3BV，合并洗脫液，于40℃條件下減壓濃縮，于800Pa，45℃條件下真空干燥120min；

優(yōu)選的，所述步驟C)的濕法上樣樣品濃度為50mg/mL，流速為0.4BV·h^-1，洗脫3BV，收集2h后的洗脫液；HPLC檢測(cè)的色譜條件為0-20min，20-45％甲醇水，20-70min，45-80％甲醇水，70-80min，80-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，柱溫：25℃，YMC-pack ODS A色譜柱(250×4.6mm，5μm)；

優(yōu)選的，所述步驟D)真空干燥條件為1000Pa，40℃，120min；所述的消毒、滅菌包括輻射滅菌、水蒸氣滅菌、熱空氣滅菌、80％乙醇溶液中的一種或幾種組合。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)竹柳皮抗炎活性提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹、大鼠棉球肉芽腫慢性炎癥以及小鼠醋酸扭體均有較好的抑制活性。通過(guò)人體試驗(yàn)表明該提取物可以直接作為單方制劑或是與其他組分復(fù)配用于急、慢性炎性疾病的治療，特別是由慢性炎癥導(dǎo)致的銀屑病的治療。

因此，本發(fā)明第二個(gè)方面提供含有竹柳皮抗炎活性提取物的制劑，由竹柳皮抗炎活性提取物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組成。所述制劑為片劑、糖衣丸、膠囊、注射劑、溶液、乳液、油膏、乳膏、氣霧劑或栓劑。

本發(fā)明第三個(gè)方面提供了竹柳皮抗炎活性提取物或含有竹柳皮抗炎活性提取物的制劑，在醫(yī)藥產(chǎn)品領(lǐng)域中的應(yīng)用。優(yōu)選的，在制備防治銀屑病的藥物中的應(yīng)用。

所述藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，選自填充劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助懸劑、潤(rùn)濕劑、溶劑、表面活性劑或矯味劑中的一種或幾種。所述填充劑選自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素或葡萄糖等；所述粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、淀粉、糊精、明膠或聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解劑選自微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙基纖維素或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉；所述潤(rùn)滑劑選自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸鈣、碳酸氫納、微粉硅膠、滑石粉或硬脂酸鎂；所述助懸劑選自微粉硅膠、蜂蠟、纖維素、固態(tài)聚乙二醇；所述潤(rùn)濕劑選自甘油、吐溫80、乙氧基氫化蓖麻油或卵磷脂；所述溶劑選自乙醇、液態(tài)聚乙二醇、異丙醇、吐溫-80、甘油、丙二醇或植物油，所述植物油選自大豆油、蓖麻油、花生油、調(diào)和油等；所述表面活性劑選自十二烷基苯磺酸鈉、硬脂酸、聚氧乙烯一聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯(吐溫)等；所述矯味劑選自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、檸檬酸或糖精鈉。

本發(fā)明具有如下有益效果：

1.本發(fā)明創(chuàng)造性的以速生用材林樹(shù)種和生物質(zhì)能源樹(shù)種的竹柳為研究對(duì)象，首次對(duì)竹柳皮進(jìn)行乙酸乙酯提取方法進(jìn)行探索研究，獲得竹柳皮進(jìn)行乙酸乙酯提取物，即本發(fā)明竹柳皮抗炎活性提取物。為竹柳在醫(yī)藥產(chǎn)品領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，有助于竹柳附加值的提高。

2.本發(fā)明對(duì)竹柳皮乙酸乙酯提取物進(jìn)行了藥理及毒性研究，證明該提取物可以直接作為單方制劑或是與其他組分復(fù)配用于急、慢性炎性疾病的治療，特別是由慢性炎癥導(dǎo)致的銀屑病的治療。

3.本發(fā)明竹柳皮乙酸乙酯提取物抗炎鎮(zhèn)痛活性高，無(wú)毒副作用，安全性好，且采用全程低溫操作工藝保證提取物化學(xué)穩(wěn)定性，所用溶劑可以循環(huán)使用，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明竹柳皮抗炎活性提取物制備方法中的步驟A所得樣品HPLC色譜圖。

圖2為本發(fā)明竹柳皮抗炎活性提取物制備方法中的步驟B所得樣品HPLC色譜圖。

圖3為本發(fā)明竹柳皮抗炎活性提取物制備方法中的步驟C所得乙酸乙酯提取物的HPLC色譜圖。

圖4為實(shí)施例1、對(duì)比實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例2的竹柳皮抗炎活性提取物對(duì)小鼠耳腫脹、大鼠棉球肉芽腫以及小鼠扭體反應(yīng)抑制率結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體試驗(yàn)方法和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案及其所產(chǎn)生的技術(shù)效果進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

A)提?。壕芊Q(chēng)取粉碎后過(guò)24目篩的竹柳皮粉末100g，加入十倍量的70％乙醇溶液作為提取溶劑，超聲波提取3次，每次60min，超聲溫度為30℃，過(guò)濾，提取液合并，45℃減壓濃縮至無(wú)乙醇?xì)埩?，加?0mL蒸餾水溶解制成100mg/mL的樣品溶液，用相同體積的乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并，40℃減壓濃縮至一定體積，于800Pa，45℃條件下真空干燥150min；樣品色譜圖如圖1所示。

B)VLC(減壓硅膠柱層析)純化：采用200-300目硅膠濕法裝柱，徑高比1:5，將A步驟所得粉末干法上樣，以石油醚為洗脫劑洗脫2BV，除去低極性雜質(zhì)；以體積比為2:8的石油醚和乙酸乙酯混合液為洗脫劑洗脫3BV，合并洗脫液，于40℃條件下減壓濃縮，于800Pa，45℃條件下真空干燥120min；樣品色譜圖如圖2所示。

C)Sephadex LH-20純化：凝膠柱徑高比為1:18，將B步驟所得粉末用石體積比為1:1的氯仿和甲醇溶液溶解制成50mg/mL樣品溶液，以體積比為1:1的氯仿和甲醇的混合液為洗脫劑，按0.4BV·h^-1的流速洗脫3BV，收集2h后的洗脫液，HPLC檢測(cè)(色譜條件為0-20min，20-45％甲醇水，20-70min，45-80％甲醇水，70-80min，80-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，柱溫：25℃，YMC-pack ODS A色譜柱(250×4.6mm，5μm))，得到除去色素的竹柳乙酸乙酯提取物溶液；色譜圖如圖3所示。

D)干燥及保存：溶液減壓濃縮至一定體積，1000Pa，40℃，真空干燥120min，輻射滅菌，最終以粉末形式保存竹柳乙酸乙酯提取物。

實(shí)施例2

A)提?。壕芊Q(chēng)取粉碎后過(guò)40目篩的竹柳皮粉100g，加入5倍量的70％乙醇溶液作為溶劑，超聲波提取4次，每次45min，超聲溫度為40℃，過(guò)濾，提取液合并，45℃減壓濃縮至無(wú)乙醇?xì)埩簦尤?0mL蒸餾水溶解制成100mg/mL的樣品溶液，用2倍量的乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并，40℃減壓濃縮至一定體積，于1000Pa，40℃條件下真空干燥120min；

B)VLC(減壓硅膠柱層析)純化：采用200-300目硅膠濕法裝柱，徑高比1:5，將A步驟所得粉末干法上樣，以石油醚為洗脫劑洗脫2BV，除去低極性雜質(zhì)；以體積比為2:8的石油醚和乙酸乙酯混合液為洗脫劑洗脫3BV，合并洗脫液，于40℃條件下減壓濃縮，于1000Pa，40℃條件下真空干燥120min；

C)Sephadex LH-20純化：凝膠柱徑高比為1:18，將B步驟所得粉末用石體積比為1:1的氯仿和甲醇溶液溶解制成50mg/mL樣品溶液，以體積比為1:1的氯仿和甲醇的混合液為洗脫劑，按0.5BV·h^-1的流速洗脫3BV，收集1.6h后的洗脫液，HPLC檢測(cè)(色譜條件為0-20min，20-45％甲醇水，20-70min，45-80％甲醇水，70-80min，80-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，柱溫：25℃，YMC-pack ODS A色譜柱(250×4.6mm，5μm))，得到除去色素的竹柳乙酸乙酯提取物溶液；

D)干燥及保存：溶液減壓濃縮至一定體積，1000Pa，40℃，真空干燥120min，輻射滅菌，最終以粉末形式保存竹柳乙酸乙酯提取物。

實(shí)施例3

A)提?。壕芊Q(chēng)取粉碎后過(guò)15目篩的竹柳皮粉100g，加入20倍量的70％乙醇溶液作為溶劑，超聲波提取3次，每次45min，超聲溫度為50℃，過(guò)濾，提取液合并，45℃減壓濃縮至無(wú)乙醇?xì)埩?，加?0mL蒸餾水溶解制成100mg/mL的樣品溶液，用相同體積的乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并，40℃減壓濃縮至一定體積，于600Pa，40℃條件下真空干燥180min；

B)VLC(減壓硅膠柱層析)純化：采用200-300目硅膠濕法裝柱，徑高比1:5，將A步驟所得粉末干法上樣，以石油醚為洗脫劑洗脫2BV，除去低極性雜質(zhì)；以體積比為2:8的石油醚和乙酸乙酯混合液為洗脫劑洗脫3BV，合并洗脫液，于40℃條件下減壓濃縮，于600Pa，40℃條件下真空干燥150min；

C)Sephadex LH-20純化：凝膠柱徑高比為1:18，將B步驟所得粉末用石體積比為1:1的氯仿和甲醇溶液溶解制成50mg/mL樣品溶液，以體積比為1:1的氯仿和甲醇的混合液為洗脫劑，按0.5BV·h^-1的流速洗脫3BV，收集1.6h后的洗脫液，HPLC檢測(cè)(色譜條件為0-20min，20-45％甲醇水，20-70min，45-80％甲醇水，70-80min，80-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，柱溫：25℃，YMC-pack ODS A色譜柱(250×4.6mm，5μm))，得到除去色素的竹柳乙酸乙酯提取物溶液；

D)干燥及保存：溶液減壓濃縮至一定體積，1000Pa，40℃，真空干燥120min，輻射滅菌，最終以粉末形式保存竹柳乙酸乙酯提取物。

對(duì)比實(shí)施例1

按實(shí)施例1中的A)和D)步驟制得相應(yīng)粉末。

對(duì)比實(shí)施例2

按實(shí)施例1中的A)、B)和D)步驟制得相應(yīng)粉末。

實(shí)驗(yàn)例1

本發(fā)明竹柳皮抗炎活性提取物抑制二甲苯致小鼠耳腫脹試驗(yàn)：

取體重18～22g雄性昆明種小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，包括實(shí)施例1組(以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，對(duì)比實(shí)施例1組(以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，對(duì)比實(shí)施例2組(以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林，以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，空白組(10％DMSO)。各組按20mL·kg^-1的劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7d，末次給藥30min后，在小鼠右耳涂20μL二甲苯致炎，左耳為空白。2h后將小鼠斷頸椎處死，剪下兩耳，用直徑9mm打孔器切下雙耳片稱(chēng)重，以右耳重量減去左耳重量的差值作為炎性腫脹程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并按下述公式計(jì)算各組小鼠耳腫脹抑制率。

各組對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和圖4。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與空白對(duì)照組相比，各給藥組均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制小鼠耳腫脹活性，且呈現(xiàn)顯著性差異，表明竹柳乙酸乙酯部位活性組分能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹；實(shí)施例1的抑制率與陽(yáng)性對(duì)照組相比，未見(jiàn)顯著性差異，但較對(duì)比實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例2的抑制率顯著升高(P＜0.01)，且對(duì)比實(shí)施例1的抑制率與對(duì)比實(shí)施例2相比，也呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)，表明竹柳乙酸乙酯萃取物經(jīng)上述純化步驟后可顯著提高其對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的抑制活性，也表明本發(fā)明所述的竹柳皮抗炎活性提取物制備方法的科學(xué)性和合理性。

表1各組對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響(n，)

注:*代表與空白對(duì)照組相比，P＜0.01；代表與陽(yáng)性對(duì)照組相比，P＜0.01；代表與實(shí)施例1相比，P＜0.01；Δ代表與對(duì)比實(shí)施例1相比，P＜0.01。

實(shí)驗(yàn)例2

本發(fā)明竹柳皮抗炎活性提取物抑制大鼠棉球肉芽腫慢性炎癥試驗(yàn)：

取體重180±10g SD大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只，包括實(shí)施例1組(以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，對(duì)比實(shí)施例1組(以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，對(duì)比實(shí)施例2組(以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，陽(yáng)性對(duì)照組(醋酸地塞米松，以10％DMSO溶解，制成濃度為1mg/mL供試樣品溶液)和模型組(10％DMSO)。

模型組大鼠用乙醚麻醉，無(wú)菌條件下在腹部切開(kāi)一個(gè)小口，用鑷子將20mg的滅菌棉球從小切口處植入大鼠兩側(cè)腹股溝下，隨即縫合并用碘液對(duì)縫合處進(jìn)行消毒。其余樣品組均以相同的方式造模。各給藥組在手術(shù)次日按20mL·kg^-1的劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)10d，末次給藥60min后，斷頸椎處死大鼠，在原切口出切開(kāi)皮膚，將棉球連同周?chē)Y(jié)締組織同時(shí)取出，剔除周?chē)荆?0℃烘箱烘干24h，稱(chēng)重。以肉芽腫重量作為炎癥程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并按下述公式計(jì)算各組棉球肉芽腫抑制率。

各組大鼠棉球肉芽腫結(jié)果見(jiàn)表2和圖4。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與空白對(duì)照組相比，各給藥組均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制大鼠棉球肉芽腫的活性，且呈現(xiàn)顯著性差異，表明竹柳乙酸乙酯部位的活性組分能抑制大鼠棉球肉芽腫的活性；實(shí)施例1的抑制率與陽(yáng)性對(duì)照組相比，未見(jiàn)顯著性差異，但與對(duì)比實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例2相比，實(shí)施例1組的大鼠棉球肉芽腫重量明顯減少，且呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)，表明本發(fā)明竹柳皮抗炎活性提取物能顯著抑制大鼠棉球肉芽腫引起的慢性炎癥，也表明本發(fā)明所述的竹柳皮抗炎活性提取物制備方法的科學(xué)性和合理性。

表2各組大鼠棉球肉芽腫重量的比較(n，)

注:*代表與空白對(duì)照組相比，P＜0.01；代表與實(shí)施例1相比，P＜0.01。

實(shí)驗(yàn)例3

本發(fā)明竹柳皮抗炎活性提取物抑制小鼠醋酸扭體試驗(yàn)：

取體重18～22g昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只，包括實(shí)施例1組(以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，對(duì)比實(shí)施例1組(以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，對(duì)比實(shí)施例2組(以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林，以10％DMSO溶解，制成濃度為10mg/mL供試樣品溶液)，空白組(10％DMSO)。各組按20mL·kg^-1的劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7d，末次給藥30min后，按0.2mL·10g^-1的劑量向每只小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液(臨用前現(xiàn)配制)，觀察并記錄注射醋酸溶液15min內(nèi)的各組小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)(腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高等)的次數(shù)，并按照下述公式計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率。

各組對(duì)小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和圖4。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與空白對(duì)照組相比，各給藥組均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制小鼠扭體的活性，且呈現(xiàn)顯著性差異，表明竹柳乙酸乙酯部位活性組分能顯著抑制醋酸引起的小鼠疼痛；實(shí)施例1的抑制率與陽(yáng)性對(duì)照組相比，未見(jiàn)顯著性差異，但較對(duì)比實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例2的抑制率顯著升高(P＜0.01)，且對(duì)比實(shí)施例1的抑制率與對(duì)比實(shí)施例2相比，也呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)，表明竹柳乙酸乙酯萃取物經(jīng)上述純化步驟后可顯著提高鎮(zhèn)痛活性，也表明本發(fā)明所述的竹柳皮抗炎活性提取物制備方法的科學(xué)性和合理性。

表3各組對(duì)小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響(n，)

注:*代表與空白對(duì)照組相比，P＜0.01；代表與陽(yáng)性對(duì)照組相比，P＜0.01；代表與實(shí)施例1相比，P＜0.01；Δ代表與對(duì)比實(shí)施例1相比，P＜0.01。

實(shí)驗(yàn)例4

本發(fā)明竹柳皮抗炎活性提取物急性毒性試驗(yàn)：

取體重18～22g昆明種小鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分為2組，每組20只，包括實(shí)施例1組(以10％DMSO溶解，制成濃度為200mg/mL供試樣品溶液)和空白組(10％DMSO)。試驗(yàn)前12h小鼠禁食不禁水，各組按20mL·kg-1的劑量灌胃給藥，對(duì)給藥后15d內(nèi)小鼠的體重、行為、四肢活動(dòng)、進(jìn)食、呼吸、排泄、死亡等情況進(jìn)行觀察，與空白組相比，樣品組未見(jiàn)明顯異常，15d后脫頸椎處死，對(duì)小鼠心、肝、脾、肥、腎等器官進(jìn)行觀察，與空白組相比，樣品組未見(jiàn)明顯異常，表明在觀察期間未觀察到竹柳乙酸乙酯提取物的明顯毒副作用。

實(shí)驗(yàn)例5

本發(fā)明竹柳皮抗炎活性提取物臨床應(yīng)用-治療銀屑病的人體試驗(yàn)

①竹柳乙酸乙酯提取物片劑的制備

稱(chēng)取按實(shí)施例1制備的竹柳乙酸乙酯提取物粉末80g，粉碎，過(guò)80目篩，加入12g玉米淀粉(稀釋劑)、8g微晶纖維素(粘合劑和崩解劑)，混合45min，將混合物加入制粒機(jī)中加熱造粒，預(yù)混合5min，當(dāng)出風(fēng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，噴90wt％乙醇溶液，于50℃下干燥使物料含水量控制在5.0wt％以下，然后過(guò)14目尼龍篩進(jìn)行整粒，向整粒后的顆粒中加入0.5g硬脂酸鎂(潤(rùn)滑劑)，混合10min，壓片，得片重為0.5g的竹柳乙酸乙酯提取物片劑。

②一般資料

銀屑病患者100例，年齡18～65歲，病程在1個(gè)月到10年之間。

③主要癥狀

紅色丘疹或斑丘疹，針頭至綠豆大小，邊界清楚，上覆銀白色或云母樣鱗屑，可刮除，伴有不同程度的瘙癢，多發(fā)于四肢身側(cè)、肘部、膝部、腰背部及頭皮。

④實(shí)驗(yàn)分組

將患者隨機(jī)分為兩組，包括治療組和對(duì)照組，每組50例。治療組服用按上述方法制備的竹柳乙酸乙酯提取物片劑進(jìn)行治療，每日3次，每次1～2片，一個(gè)月為一個(gè)療程，對(duì)照組外涂維A酸軟膏，每天3次，連涂一個(gè)月為一個(gè)療程。3個(gè)療程后觀察患者病情變化。

⑤療效判斷標(biāo)準(zhǔn)

痊愈：服藥后癥狀消失；

有效：服藥后癥狀減輕；

無(wú)效：癥狀略有減輕或無(wú)變化。

各組對(duì)銀屑病的治療效果見(jiàn)表4。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明片劑對(duì)銀屑病具有較好的治療效果(總有效率＞90％)，且其治療效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照的治療效果(總有效率＞64％)，且治療組患者，在服藥觀察期間未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)或毒副反應(yīng)，表明該片劑在臨床上可用于銀屑病的治療。

表4各組對(duì)銀屑病的治療效果