發(fā)明設(shè)涉及生物材料領(lǐng)域，具體設(shè)計一種同種異體植入性生物材料的制備方法。

背景技術(shù)：

羊膜是胎膜的最內(nèi)層，屬于生物膜中的一種，是一類天然細胞外基質(zhì)類生物衍生材料。羊膜由滋養(yǎng)細胞層分化而來，表面光滑，半透明，有韌性及彈性，厚度為0.02-0.50mm，主要由I、III 型纖維膠原蛋白構(gòu)成，含有少量的VI、V 型膠原，其中含有多種生長因子，如成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)、轉(zhuǎn)移生長因子-β(transforming growth-β，TGF-β)、促進血管生成的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，還含有纖維連接蛋白(fibronectin,FN) 等。羊膜不表達HLA-A、B、C 及DR 抗原或β2 微球蛋白，透明且無血管、淋巴和神經(jīng)組織，其抗原性遠低于普通組織。大量研究表明，羊膜具有良好的細胞相容性和組織相容性，并具有部位特異的組織再生能力，為一新型的生物衍生材料。

羊膜作為生物材料應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床已經(jīng)有多年的歷史。早在20 世紀(jì)初期就有用含羊膜的胎膜供體移植于燒傷和潰瘍創(chuàng)面的報道，隨后在顱腦外科、腹腔外科、婦產(chǎn)科及眼科均有其應(yīng)用的報道。具體來說其主要用途有：①用于眼睛表面疾病如角膜修復(fù)、先天性青光眼、角膜潰瘍等；②用于修補鼓膜損傷；③用于外科手術(shù)后預(yù)防粘連；④用于燒傷后表面覆蓋等。

然而，目前對羊膜的處理大多含有使用機械力刮除方法，使羊膜存在細胞殘留、機械性能不足以及降解周期較短等缺陷，限制了其臨床應(yīng)用范圍。根據(jù)臨床報道，由于羊膜細胞的存在，在眼科，羊膜植片可能會發(fā)生植片排斥反應(yīng)、植片脫落、移位溶解、感染等并發(fā)癥，其安全性存在一定的風(fēng)險。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種脫細胞生物羊膜的制備方法，摒棄了傳統(tǒng)的機械力刮除的方法，采用了相對溫和的化學(xué)處理方法，一方面能有效、徹底地除去羊膜中細胞殘留等免疫原，另一方面還能較好的保留羊膜的生物活性和生物力學(xué)性能。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種脫細胞生物羊膜的制備方法，包括羊膜的清洗、化學(xué)處理和冷凍干燥，其特征在于，該方法按以下步驟進行：

（1）將新鮮羊膜用生理鹽水反復(fù)清洗，直至無殘留血液；

（2）將步驟（1）所得的羊膜用過氧化氫溶液浸泡2小時；

（3）將步驟（2）所得的羊膜用分析純的丙酮浸泡，水浴恒溫震蕩脫去脂肪成分；

（4）將步驟（3）所得的羊膜用十二烷基硫酸鈉溶液浸泡16-20小時；

（5）將步驟（4）所得的羊膜用酒精浸泡16-20小時；

（6）將步驟（5）所得的羊膜用大量純化水反復(fù)清洗至末道清洗液pH值為6.5-7.5；

（7）將步驟（6）所得的羊膜放入-70℃下的環(huán)境中冷凍16-25小時；

（8）將步驟（7）所得的羊膜放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥；

（9）將步驟（8）所得的羊膜進行輻照滅菌。

根據(jù)本發(fā)明的脫細胞生物羊膜的制備方法，較好的是，所述過氧化氫的質(zhì)量分數(shù)為5%-25%。

根據(jù)本發(fā)明的脫細胞生物羊膜的制備方法，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述水浴恒溫震蕩的溫度為25-37℃。

步驟（4）中所述十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為0.1%-0.5%。

根據(jù)本發(fā)明的脫細胞生物羊膜的制備方法，較好的是，所述酒精的質(zhì)量分數(shù)為75-85%。

根據(jù)本發(fā)明的脫細胞生物羊膜的制備方法，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述冷凍干燥時間為24小時。

根據(jù)本發(fā)明的脫細胞生物羊膜的制備方法，較好的是，所述輻照滅菌的劑量為20-30kGy。

本發(fā)明的技術(shù)原理：摒棄了機械力刮除的傳統(tǒng)方法，采用了相對溫和的化學(xué)處理的方法，可以有效地除去羊膜中的上皮細胞層、纖維母細胞層和海綿層，達到消除或減弱抗原性的目的，從而減弱羊膜在移植時引起的免疫排斥反應(yīng)；同時又能有效地保留基底膜中的各種膠原蛋白，可以較好地保留羊膜的生物活性。另外采用輻照的方式滅菌，能夠進一步降低羊膜的免疫原性，使植入的羊膜能夠被宿主細胞所適應(yīng)，大大降低免疫排斥反應(yīng)。

本發(fā)明的有益效果在于將新鮮羊膜用生理鹽水清洗干凈，洗去羊膜上的殘留血液，再依次用過氧化氫、丙酮、十二烷基硫酸鈉、酒精處理，能夠有效地去除羊膜中的細胞膜和細胞基質(zhì)等免疫原，大大降低了羊膜的免疫原性，同時通過深低溫冷凍和冷凍干燥處理，可以進一步的降低羊膜的免疫原性，一方面能夠降低免疫排斥反應(yīng)，另一方面還能較好的保留羊膜的生物活性和生物力學(xué)性能。此外，本發(fā)明設(shè)計的化學(xué)處理方法步驟簡單移行，有利于實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)操作。

具體實施方式

為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

實施例1

將新鮮羊膜先用大量生理鹽水沖洗至無殘留血跡，將其放入質(zhì)量體積比為5:1的、質(zhì)量分數(shù)為5%的過氧化氫溶液中浸泡2小時；然后羊膜放入質(zhì)量體積比為5:1的分析純的丙酮中，水浴恒溫震蕩2小時，脫去脂肪成分；再將所得的羊膜用質(zhì)量體積比為5:1的、質(zhì)量分數(shù)為0.15%的十二烷基硫酸鈉溶液浸泡18小時；再用質(zhì)量體積比為5:1的、質(zhì)量分數(shù)為75%的酒精浸泡18小時脫去水分后用大量的純化水反復(fù)沖洗羊膜直至末道清洗液的pH值在6.5-7.5之間。

將清洗完成后的羊膜平鋪在不銹鋼凍干盤上面，放入-70℃以下的環(huán)境中冷凍24小時，然后將其放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥。冷凍干燥結(jié)束后在萬級潔凈環(huán)境中將其分割和包裝，最后將其進行輻照滅菌（劑量為25kGy）,即可得到脫細胞生物羊膜成品。

實施例2

將新鮮羊膜先用大量生理鹽水沖洗至無殘留血跡，將其放入質(zhì)量體積比為6:1的、質(zhì)量分數(shù)為5%的過氧化氫溶液中浸泡2小時；然后羊膜放入質(zhì)量體積比為6:1的分析純的丙酮中，水浴恒溫震蕩2小時，脫去脂肪成分；再將所得的羊膜用質(zhì)量體積比為6:1的、質(zhì)量分數(shù)為0.2%的十二烷基硫酸鈉溶液浸泡18小時；再用質(zhì)量體積比為5:1的、質(zhì)量分數(shù)為75%的酒精浸泡18小時脫去水分后用大量的純化水反復(fù)沖洗羊膜直至末道清洗液的pH值在6.5-7.5之間。

將清洗完成后的羊膜平鋪在不銹鋼凍干盤上面，放入-70℃以下的環(huán)境中冷凍24小時，然后將其放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥。冷凍干燥結(jié)束后在萬級潔凈環(huán)境中將其分割和包裝，最后將其進行輻照滅菌（劑量為25kGy）,即可得到脫細胞生物羊膜成品。

實施例3

將新鮮羊膜先用大量生理鹽水沖洗至無殘留血跡，將其放入質(zhì)量體積比為6:1的、質(zhì)量分數(shù)為10%的過氧化氫溶液中浸泡2小時；然后羊膜放入質(zhì)量體積比為6:1的分析純的丙酮中，水浴恒溫震蕩2小時，脫去脂肪成分；再將所得的羊膜用質(zhì)量體積比為6:1的、質(zhì)量分數(shù)為0.25%的十二烷基硫酸鈉溶液浸泡18小時；再用質(zhì)量體積比為5:1的、質(zhì)量分數(shù)為75%的酒精浸泡18小時脫去水分后用大量的純化水反復(fù)沖洗羊膜直至末道清洗液的pH值在6.5-7.5之間。

將清洗完成后的羊膜平鋪在不銹鋼凍干盤上面，放入-70℃以下的環(huán)境中冷凍24小時，然后將其放入冷凍干燥機中進行冷凍干燥。冷凍干燥結(jié)束后在萬級潔凈環(huán)境中將其分割和包裝，最后將其進行輻照滅菌（劑量為25kGy）,即可得到脫細胞生物羊膜成品。