本發(fā)明屬于中藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及補(bǔ)肺活血膠囊用于治療或預(yù)防肺部損傷藥物的用途，具體涉及補(bǔ)肺活血膠囊用于治療和/或預(yù)防PM2.5引起的肺部損傷的藥物的用途。
背景技術(shù)：
：近年來，大氣污染已經(jīng)對人體健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，在目前公認(rèn)的各種大氣污染物中，顆粒物與人體健康效應(yīng)各終點(diǎn)的流行病學(xué)聯(lián)系最為密切，且顆粒物已經(jīng)成為評價(jià)大氣污染的定量健康危害的標(biāo)志性污染物。越來越多的流行病學(xué)、毒理學(xué)資料研究已證實(shí)大氣顆粒物尤其是直徑<2.5um的顆粒物，與居民死亡和發(fā)病率的增加有關(guān)，能引起哮喘、肺功能下降、呼吸系統(tǒng)炎癥、甚至累及心血管系統(tǒng)，促使癌癥發(fā)生?！癙M2.5對大鼠的肺損傷及其機(jī)制的研究”，曲紅梅，蘭州大學(xué)研究生學(xué)位論文，2006年研究表明PM2.5染毒后引起肺灌洗液中ACP、AKP、ALB、TP、LDH含量的升高；IgG、IgA升高，并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系；肺泡巨嗜細(xì)胞吞噬能力降低，提示PM2.5顆粒物進(jìn)入機(jī)體后引起肺損傷，病引起肺實(shí)質(zhì)和生物膜的損害，激發(fā)了機(jī)體局部免疫和黏膜免疫并從不同程度降低非特異性免疫功能。目前，臨床上暫未有有效的治療PM2.5引起的肺部損傷疾病的藥物。補(bǔ)肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂組成，益氣活血，補(bǔ)肺固腎，用于肺心病(緩解期)屬氣虛血瘀證，癥見：咳嗽氣促，或咳喘胸悶，心悸氣短，肢冷乏力，腰膝酸軟，口唇紫紺，舌淡苔白或舌紫暗等?！把a(bǔ)肺活血膠囊的作用與臨床療效”，吳鏑等，中國實(shí)用醫(yī)藥，第7卷第8期，第148-149頁，2012年3月指出補(bǔ)肺活血膠囊具有益氣活血、補(bǔ)肺固腎的功效，可降低全血粘度、降低血?dú)庵卸趸挤謮骸⑻岣哐醴謮?、氧飽和量，增加心輸出量、冠脈血流量，降低血管外周阻力、冠脈阻力、心肌耗氧量，治療支氣管哮喘、塵肺、肺心病效果較好?！吨袊幍洹?015版第一部記載了補(bǔ)肺活血膠囊處方及其制備方法，黃芪720g、赤芍720g、補(bǔ)骨脂360g，取赤芍180g粉碎成細(xì)粉，備用；其余藥味加水煎煮二次，第一次加8倍量水，第二次加6倍量水，每次1小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.05～1.15(80℃)，加乙醇使含醇量達(dá)60％，充分?jǐn)嚢?，靜置24小時(shí)，濾取上清液，回收乙醇至無醇味，繼續(xù)濃縮至相對密度為1.35～1.40(80℃)，加入上述赤芍細(xì)粉，混勻，干燥，粉碎，用90％乙醇制粒，干燥，加輔料適量，混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得。且該內(nèi)容僅記載了對黃芪的主要有效成分黃芪甲苷和赤芍的主要有效成分芍藥苷的含量進(jìn)行了限定，并沒有對補(bǔ)骨脂的有效成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量進(jìn)行限定，我們發(fā)現(xiàn)通過該制備方法獲得的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量較低。此外，我們還發(fā)現(xiàn)目前已有的補(bǔ)肺活血膠囊在儲存過程中易引濕性，導(dǎo)致藥品不耐儲存，影響藥物的穩(wěn)定性。鑒此，臨床迫切需要療效明確、毒副作用小、服用方便且藥物易于儲存的可用于治療和/或預(yù)防PM2.5引起肺損傷的藥物，以滿足市場和患者之需。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供補(bǔ)肺活血膠囊用于制備治療和/或預(yù)防PM2.5引起的肺部損傷的藥物的用途，該中藥組合物選用藥材配伍相宜，符合中醫(yī)藥及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究理論，藥效好且毒副作用低。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：補(bǔ)肺活血膠囊用于制備治療和/或預(yù)防PM2.5引起的肺部損傷的藥物的用途，所述的補(bǔ)肺活血膠囊主要由黃芪、赤芍和補(bǔ)骨脂組成。優(yōu)選的，黃芪為50～100份(重量)、赤芍為50～100份(重量)、補(bǔ)骨脂為25～50份(重量)。更優(yōu)選的，黃芪為72份(重量)、赤芍為72份(重量)、補(bǔ)骨脂為36份(重量)。補(bǔ)肺活血膠囊用于制備治療和/或預(yù)防PM2.5引起的肺部損傷的藥物的用途，所述的補(bǔ)肺活血膠囊含有重量百分比的下列活性物質(zhì)：≥0.18％的黃芪甲苷、≥2.0％的芍藥苷和≥0.75％的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。優(yōu)選的，含有≥0.20％的黃芪甲苷、≥2.3％的芍藥苷和≥0.85％的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素。補(bǔ)肺活血膠囊用于制備治療和/或預(yù)防PM2.5引起的肺部損傷的藥物的用途，所述的補(bǔ)肺活血膠囊降低PM2.5引起的小鼠肺部損傷的肺的氣道阻力，改善肺順應(yīng)性，改善肺通氣功能。補(bǔ)肺活血膠囊用于制備治療和/或預(yù)防PM2.5引起的肺部損傷的藥物的用途，所述的補(bǔ)肺活血膠囊降低PM2.5引起的小鼠肺部損傷的肺組織中的炎癥細(xì)胞因子濃度。補(bǔ)肺活血膠囊用于制備治療和/或預(yù)防PM2.5引起的肺部損傷的藥物的用途，所述的補(bǔ)肺活血膠囊修復(fù)PM2.5引起的小鼠的肺部損傷。補(bǔ)肺活血膠囊用于制備治療和/或預(yù)防PM2.5引起的肺部損傷的藥物的用途，所述的補(bǔ)肺活血膠囊的制備方法為：(1)將黃芪切片、赤芍和補(bǔ)骨脂粉碎成粗粉；(2)60％-70％乙醇回流提取2次，第一次加5倍量60％-70％乙醇，提取2h，第二次4倍量60％-70％乙醇，提取1h；(3)合并兩次的提取液，濾過，濾液減壓回收至無醇味，繼續(xù)減壓濃縮至相對密度為1.30-1.40的清膏；(4)加1.0～2.0倍重量份的淀粉，混勻，90％乙醇制粒，干燥，加入不超過5％的滑石粉和0.1％-2％的硬脂酸鎂，混勻，裝入膠囊，即得。補(bǔ)肺活血膠囊用于制備治療和/或預(yù)防PM2.5引起的肺部損傷的藥物的用途，所述的補(bǔ)肺活血膠囊的制備方法為：(1)將黃芪、赤芍和補(bǔ)骨脂粉碎，置于萃取釜中，以70％～90％乙醇為夾帶劑；(2)調(diào)節(jié)超臨界CO2流體溫度、壓力；(3)萃取溫度為30℃～50℃，萃取壓力為20MPa～40MPa，萃取時(shí)間為1h～3h；(4)收集萃取液，離心濃縮蒸干提取物；(5)加1.0～2.0倍重量份的淀粉，混勻，90％乙醇制粒，干燥，加入不超過5％的滑石粉和0.1％～2％的硬脂酸鎂，混勻，裝入膠囊，即得。優(yōu)選的，補(bǔ)肺活血膠囊的制備方法為：(1)將黃芪、赤芍和補(bǔ)骨脂粉碎，置于萃取釜中，以80％乙醇為夾帶劑；(2)調(diào)節(jié)超臨界CO2流體溫度、壓力；(3)萃取溫度30℃，萃取壓力20MPa，萃取時(shí)間2h；(4)收集萃取液，離心濃縮蒸干提取物；(5)加1.0～2.0倍重量份的淀粉，混勻，90％乙醇制粒，干燥，加入不超過5％的滑石粉和0.1％～1％的硬脂酸鎂，混勻，裝入膠囊，即得。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊選用優(yōu)質(zhì)中藥材制成，成本低廉且配伍相宜，符合中醫(yī)藥及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究理論，并利用現(xiàn)代醫(yī)藥制藥技術(shù)制成相關(guān)劑型，安全毒副作用低。(2)在PM2.5小鼠模型中，本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊與模型對照組相比，可顯著改善PM2.5小鼠的肺功能，病理切片及肺損傷修復(fù)指標(biāo)結(jié)果顯示，本發(fā)明中藥組合物可使模型小鼠肺損傷明顯改善，且可使炎癥細(xì)胞因子量顯著降低。(3)本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊采用醇提法提取，制備工藝簡單易操作，活性物質(zhì)黃芪甲苷、芍藥苷和補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量高，尤其是補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量明顯高于對照組合物。(4)本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊采用超臨界提取法提取，活性物質(zhì)黃芪甲苷、芍藥苷和補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量高。(5)本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊?guī)缀鯚o引濕性，穩(wěn)定性好，耐儲存。(6)本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊制備簡單，易于臨床應(yīng)用。(7)本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊對活性物質(zhì)黃芪甲苷、芍藥苷和補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)附圖說明圖1為PM2.5模型小鼠肺病理切片。圖2為PM2.5模型小鼠肺損傷病理切片。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊的原料配方組合物1：黃芪500g，赤芍1000g，補(bǔ)骨脂360g。組合物2：黃芪1000g，赤芍1000g，補(bǔ)骨脂500g。組合物3：黃芪500g，赤芍500g，補(bǔ)骨脂250g。組合物4：黃芪720g，赤芍720g，補(bǔ)骨脂360g。實(shí)施例2本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊提取物的制備及活性物質(zhì)的含量本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊的制備：取實(shí)施例1組合物4的原料配方的黃芪切片、赤芍和補(bǔ)骨脂粉碎成粗粉，60％-70％乙醇醇回流提取2次，第一次加5量60％-70％乙醇，提取2h，第二次4倍量60％-70％乙醇，提取1h，合并兩次的提取液，濾過，濾液減壓回收至無醇味，繼續(xù)減壓濃縮至相對密度為1.30-1.40的清膏，即得。所述補(bǔ)肺活血膠囊提取物中含有下列活性物質(zhì)：黃芪甲苷、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，結(jié)果見表1，測定方法依照《中國藥典》(2015版)第一部的方法。表1本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊活性物質(zhì)含量對比組合物制備方法：黃芪720g，赤芍720g，補(bǔ)骨脂360g，取赤芍180g粉碎成細(xì)粉，備用；其余藥味加水煎煮二次，第一次加8倍量水，第二次加6倍量水，每次1小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.05～1.15(80℃)，加乙醇使含醇量達(dá)60％，充分?jǐn)嚢瑁o置24小時(shí)，濾取上清液，回收乙醇至無醇味，繼續(xù)濃縮至相對密度為1.35～1.40(80℃)，加入上述赤芍細(xì)粉，混勻，干燥，粉碎。表2本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊與對照組合物活性物質(zhì)含量比較實(shí)施例3本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊提取物的制備及活性物質(zhì)的含量本試驗(yàn)是對超臨界CO2萃取設(shè)備的工藝參數(shù)進(jìn)行綜合研究，尋找各種萃取條件(萃取溫度、壓力、夾帶劑和時(shí)間)對萃取量及有效物質(zhì)含量的影響，經(jīng)考察夾帶劑乙醇濃度影響較小(乙醇濃度為70％～90％，80％較優(yōu))，萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間和夾帶劑是主要的影響因素，因此以黃芪甲苷和提取物的得率為指標(biāo)用正交試驗(yàn)法考察四種因素對提取效果的影響?？疾煲蛩丶八揭姳?。表3本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊提取工藝考察因素水平表試驗(yàn)方法稱取黃芪720g，赤芍720g，補(bǔ)骨脂360g，粉碎后置于萃取釜中，調(diào)整CO2流體溫度，調(diào)節(jié)萃取溫度及壓力，按正交試驗(yàn)表4的要求萃取，平行三份，合并提取液。表4本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊超臨界提取工藝考察正交表表5方差分析表F0.05(2,2)＝19.00F0.01(2,2)＝99.00由表5方差分析可知：最佳選擇工藝應(yīng)為A3B2C2。即萃取溫度30℃，萃取壓力40MPa，萃取時(shí)間1h。根據(jù)上述優(yōu)選工藝，制得的補(bǔ)肺活血膠囊的活性物質(zhì)含量如下表6所示。表6本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊活性物質(zhì)含量實(shí)施例4本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊劑的制備根據(jù)實(shí)施例2或3的制備方法制得的清膏，加1.0～2.0倍重量份的淀粉，混勻，90％乙醇制粒，干燥，加入不超過5％的滑石粉和0.1％-2％的硬脂酸鎂，混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得。本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊引濕性的測定實(shí)驗(yàn)方法：取干燥的具塞玻璃稱量瓶，試驗(yàn)前一天置于適宜的25℃±1℃恒溫干燥器(設(shè)定溫度為25℃±1℃，相對濕度為80％±2％)內(nèi)，精密成定重量。取供試品適量，平鋪于上述稱量瓶中，供試品厚度為約為1mm，精密成定重量。將稱量瓶敞口，并與瓶蓋同置于上述恒溫恒濕條件下24小時(shí)，蓋好稱量瓶蓋子，精密成定重量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊增重百分率不超過2％，表明本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊?guī)缀鯚o引濕性，見表7。表7本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊的引濕性實(shí)施例5本發(fā)明補(bǔ)肺活血膠囊對PM2.5小鼠模型的影響試驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^PM2.5小鼠模型試驗(yàn)，觀察補(bǔ)肺活血膠囊對模型動物肺部功能、肺組織損傷的作用。動物：試驗(yàn)用動物為SPF級健康ICR雌性小鼠60只，體重22-26g(由北京華阜康生物科技股份有限公司提供)。在溫度22℃-28℃，相對濕度50％-60％的清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，采用12/12照明。動物的使用和護(hù)理符合北京中日友好醫(yī)院動物倫理協(xié)會的人道關(guān)懷。藥物：由本發(fā)明實(shí)施例1的組合物4，根據(jù)其成人用量，配成0.41g生藥/ml，灌胃給藥。小鼠模型建立與藥物干預(yù)：健康ICR雌性小鼠60只，按體重隨機(jī)分為3組：正常對照組、PM2.5模型組、本發(fā)明中藥組合物組，每組20只?？瞻讓φ战M：分別于模型建立第1，8，15和22天經(jīng)鼻腔滴入0.9％生理鹽水(20μL/只)，其余時(shí)間正常飼養(yǎng)。PM2.5模型組：采用鼻腔滴注PM2.5懸液方法，分別于模型建立第1，8，15和22天經(jīng)鼻腔滴注PM2.5懸液(40mg/kg·bw，20μL/只)，第1天至第22天，經(jīng)口灌服0.9％生理鹽水0.2ml/只/d。本發(fā)明中藥組合物組：PM2.5小鼠模型建立方法同模型對照組，第1天至第22天，經(jīng)口灌服補(bǔ)肺活血中藥溶液(0.82g/Kg,0.2ml/只/d)。各個(gè)試驗(yàn)組均在最后一次染毒后48小時(shí)內(nèi)處死。試驗(yàn)結(jié)果及分析：1、小鼠模型肺功能分析(高劑量染毒對照組)2％戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠(0.4mL/40g)，取仰臥位固定于操作臺，剪開頸部皮毛，暴露氣管，并鈍性分離氣管，于氣管近頭部處剪一切口，將插管的氣管接頭處插入氣管，并用棉線固定，轉(zhuǎn)移小鼠至體描儀平臺，連接呼吸機(jī)與氣管接頭，記錄小鼠的肺功能相關(guān)指標(biāo)的變化。并用AniRes2005動物肺功能分析系統(tǒng)急性分析(肺功能儀：北京貝蘭博科技有限公司)。結(jié)果見表8。表8補(bǔ)肺活血膠囊對PM2.5模型小鼠肺功能的影響**表示與模型組相比P<0.01，*表示與模型組相比P<0.05由表8結(jié)果可知，與模型組相比補(bǔ)肺活血膠囊組對小鼠的氣道阻力(RL、RE)顯著降低(p<0.01)，肺順應(yīng)性(Cdyn)顯著改善(p<0.01)，肺通氣功能(PEF)顯著改善。表明，本發(fā)明中藥組合物可顯著改善PM2.5小鼠的肺功能。2、病理學(xué)分析(三種染毒劑量)脫頸處死小鼠，開胸暴露胸腔：分離靠近肺門處的左肺上葉固定于10％甲醛溶液24h，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察；取右側(cè)肺葉以備勻漿。結(jié)果見附圖1。結(jié)果分析：空白對照組小鼠肺組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；小支氣管粘膜及支氣管壁結(jié)構(gòu)完整；肺泡分布均勻、結(jié)構(gòu)完整，泡腔內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤；肺間質(zhì)炎癥狀態(tài)較輕；肺毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)完整，未見出血現(xiàn)象。PM2.5模型小鼠肺的主要病理表現(xiàn)為肺組織炎性改變，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤明顯增多。小支氣管粘膜部分損傷，主要表現(xiàn)為小支氣管壁增厚，伴有少量出血、滲出現(xiàn)象；肺泡腔增大，部分肺泡斷裂、融合，腔內(nèi)有分泌物，主要有單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，可見淋巴細(xì)胞增生，部分肺泡出現(xiàn)實(shí)變現(xiàn)象，肺泡間隔增寬；肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤；肺毛細(xì)血管部分出現(xiàn)出血，伴炎性滲出，管壁不同程度增厚。與PM2.5模型小鼠相比補(bǔ)肺活血膠囊組可使模型小鼠肺組織的炎性改變明顯減輕；小支氣管粘膜損傷程度較輕；肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，腔內(nèi)分泌物減少，炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕；肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤有所改善；肺毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)較為完整，可見少量出血現(xiàn)象。3、ELISA檢測(三種染毒劑量)取0.1g肺組織放入1.5mlEP管中，制備成10％肺組織勻漿液，離心4℃，12000r/min，20min，取上清。按ELISA試劑盒提示的操作步驟說明進(jìn)行肺組織勻漿上清液中相關(guān)炎性介質(zhì)含量。結(jié)果見表9-14。表9補(bǔ)肺活血膠囊組對不同濃度PM2.5模型小鼠肺組織中IL-1的影響低劑量染毒組中劑量染毒組高劑量染毒組空白組3616.25±1176.73**3616.25±1176.73**3616.25±1176.73**染毒組5253.98±1350.615327.92±1274.076005.13±1815.30中藥組合物組4457.90±1425.27**4187.91±998.28**4782.04±1187.23**定量分析用表示，**表示與模型組相比P<0.01，*表示與模型組相比P<0.05。表10補(bǔ)肺活血膠囊組對不同濃度PM2.5模型小鼠肺組織中IL-4的影響低劑量染毒組中劑量染毒組高劑量染毒組空白組252.51±37.50**252.51±37.50**252.51±37.50**染毒組358.45±32.57371.97±37.063395.20±68.29中藥組合物組256.42±65.80**233.86±50.61**299.63±53.85**定量分析用表示，**表示與模型組相比P<0.01，*表示與模型組相比P<0.05。表11補(bǔ)肺活血膠囊組對不同濃度PM2.5模型小鼠肺組織中IL-6的影響低劑量染毒組中劑量染毒組高劑量染毒組空白組3890.26±1015.36**3890.26±1015.36**3890.26±1015.36**染毒組5008.03±1518.925560.60±1738.325985.88±2086.78中藥組合物組4466.32±1440.85**4179.10±1136.73**5226.43±1973.88**定量分析用表示，**表示與模型組相比P<0.01，*表示與模型組相比P<0.05。表12補(bǔ)肺活血膠囊組對不同濃度PM2.5模型小鼠肺組織中IL-10的影響低劑量染毒組中劑量染毒組高劑量染毒組空白組2930.63±632.28**2930.63±632.28**2930.63±632.28**染毒組4194.15±487.224741.14±1082.316219±724.16中藥組合物組3120.58±691.67**3248.64±786.94**3647.24±1336.03**定量分析用表示，**表示與模型組相比P<0.01，*表示與模型組相比P<0.05。表13補(bǔ)肺活血膠囊組對不同濃度PM2.5模型小鼠肺組織中IL-17的影響低劑量染毒組中劑量染毒組高劑量染毒組空白組591.90±139.92**591.90±139.92**591.90±139.92**染毒組761.42±126.19883.38±116.301008.89±187.59中藥組合物組583.11±136.36**643.62±101.51**616.28±169.70**定量分析用表示，**表示與模型組相比P<0.01，*表示與模型組相比P<0.05。表14補(bǔ)肺活血膠囊組對不同濃度PM2.5模型小鼠肺組織中TNF-α的影響低劑量染毒組中劑量染毒組高劑量染毒組空白組10365.69±1530.90**10365.69±1530.90**10365.69±1530.90**染毒組15017.8±1284.7718838.35±716.0120278.18±1896.80中藥組合物組12732.06±1184.12**14130.99±3103.43**13216.5±1332.48**定量分析用表示，**表示與模型組相比P<0.01，*表示與模型組相比P<0.05。由表9-14結(jié)果可知，與模型組相比，補(bǔ)肺活血膠囊組對不同濃度PM2.5模型小鼠肺組織中炎癥細(xì)胞因子(IL-1、4、6、10、17，TNF-α)抑制作用顯著，各炎癥細(xì)胞因子含量顯著降低(P<0.01)。4、Masson三色法步驟：(高劑量染毒組)(1)石蠟切片脫蠟至水；(2)依次自來水和蒸餾水洗；(3)用Regaud蘇木精染液5-10min；(4)充分水洗,如過染可鹽酸酒精分化；(5)蒸餾水洗；(6)用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液5-10min；(7)2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；(8)1％磷鉬酸水溶液分化3-5min；(9)不經(jīng)水洗,直接用苯胺藍(lán)液染5min；(10)以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；(11)95％酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。每張切片選取6個(gè)不重復(fù)的視野(×200倍)，MASSON染色以藍(lán)色膠原沉積為陽性信號，用ImageProplus多媒體彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行分析。計(jì)算小鼠肺組織膠原沉積面積與視野內(nèi)肺組織總面積的比值，并取平均值。結(jié)果見附圖2。由附圖2可知，A中可見HMBG1主要見于肺泡間隙，B中可見KGF主要出現(xiàn)在氣管壁及肺泡組織間隙中。C中可見補(bǔ)肺活血膠囊對PM2.5模型小鼠肺組織中膠原沉積及組織纖維化的影響，其中膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色，胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核黑藍(lán)色。5.免疫組化(高劑量染毒組)肺組織切片常規(guī)脫蠟后，按照免疫組化試劑盒具體操作步驟進(jìn)行檢測。采用美國MediaCybernetics公司生產(chǎn)的Image-ProPlus圖像分析軟件進(jìn)行分析，以累積光密度(IntegratedOpticalDensity，IOD)反映蛋白表達(dá)總量。表15補(bǔ)肺活血膠囊組對PM2.5模型小鼠肺損傷修復(fù)指標(biāo)影響MASSONHMGB1KGF空白組7.43±1.42**9804.32±5175.90**18232.15±8342.99**染毒組22.44±5.4321655.11±5053.6725278.79±10469.46中藥組合物組10.0±1.98**10323.82±5580.02**17697.89±6162.62**相關(guān)定量分析用表示，**表示與模型組相比P<0.01，*表示與模型組相比P<0.05。由表15可知，與模型組相比，補(bǔ)肺活血膠囊組隊(duì)對PM2.5模型小鼠肺損傷修復(fù)指標(biāo)顯著改善(P<0.01)。6.PCR檢測：(高劑量染毒組)取小鼠肺組織100mg，Trizol一步法抽提總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(其中2μgRNA、1μloligo(dT)、DEPC水至12μl)。小鼠肺組織β-actin引物序列：正向引物5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，反向引物5’-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’；IL-8引物序列：正向引物5’-CATCTTCGTCCGTCCCTGTG-3’，反向引物5’-GCCAACAGTAGCCTTCACCCA-3’；sIgA引物序列：正向引物5’-GCTACAGTGTGTCCAGCGTCCT-3’，反向引物5’-TGCCAGACTCAGGATGGGTAAC-3’。采用相對定量研究分析法，以2-△△Ct作指標(biāo)進(jìn)行分析。表16IL-8和sIgA的mRNA在不同組別小鼠肺組織勻漿液中的表達(dá)IL-8sIgA空白組0.58±0.43**0.039±0.029**染毒組1.80±0.700.347±0.101中藥組合物組1.14±0.36**0.157±0.104**IL-8和sIgA在小鼠中的表達(dá)量用表示，**表示與模型組相比P<0.01，n≥8IL-8和sIgA的mRNA在不同組別小鼠肺組織勻漿液中的表達(dá)?？瞻讓φ战M與模型組相比IL-8和sIgA的表達(dá)明顯降低，補(bǔ)肺活血膠囊物組干預(yù)組炎性介質(zhì)含量明顯低于模型組。當(dāng)前第1頁1 2 3