本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及多肽露那辛(lunasin)在制備抗動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，as)是指在動脈及其分支的動脈壁內(nèi)膜及內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積，單核/巨噬細胞浸潤并攝取脂質(zhì)形成泡沫細胞，同時伴有中層平滑肌細胞增殖并向內(nèi)膜下遷移，使內(nèi)膜增厚，形成黃色或灰黃色狀如粥樣物質(zhì)的斑塊。

血管內(nèi)皮細胞(vec)結(jié)構(gòu)與功能完整，是機體維持血管張力，調(diào)節(jié)止血與抗血栓形成功能平衡的重要環(huán)節(jié)，而慢性或反復血管內(nèi)皮細胞(vascularendothelialcell，vec))損傷則是as發(fā)生的始動因素。在吸煙、高脂、氧化應(yīng)激等因素刺激下，血管內(nèi)皮細胞(vec)受到損傷，就會發(fā)生血管內(nèi)皮功能障礙(dysfunction)，從而引發(fā)as等心腦血管疾病。

as可始發(fā)兒童期并持續(xù)進展，通常在中老年出現(xiàn)癥狀。在發(fā)達國家，as性心血管疾病是造成病殘或病死的重要病因，然而，近年來隨著國內(nèi)人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，as發(fā)病在我國亦呈不斷上升趨勢，其防治研究越來越受關(guān)注，因此研究新的有效的抗動脈粥樣硬化藥物具有重要的應(yīng)用價值。

露那辛(lunasin)是一種最初從大豆中分離得到的活性肽，由43個氨基酸殘基組成，其序列為：skwqhqqdscrkqlqgvnltpcekhimekiqgrgddddddddd(seqidno：1)，分子量為5kda(s.odani，jbiolchem262(1987)10502-10505.)。已有研究表明，lunasin具有抗腫瘤活性，在體外可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖(e.j.mcconnell，oncotarget6(2015)4649-4662.)，抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲(q.jiang，oncolrep36(2016)253-262.)，在體內(nèi)可抑制小鼠皮膚癌和乳腺癌的發(fā)生(c.c.hsieh，jfoodsci75(2010)h311-316.)。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并通過動物實驗證明多肽露那辛(lunasin)具有抗動脈粥樣硬化的藥理活性，可用于制備抗動脈粥樣硬化的藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了多肽露那辛(lunasin)在制備防治動脈粥樣硬化藥物方面的新用途。

此外，本發(fā)明還涉及多肽露那辛(lunasin)在制備預(yù)防和治療動脈粥樣硬化所致疾病的藥物中的應(yīng)用。其中，所屬疾病為心血管疾病，例如心絞痛、心肌梗死、外周血管疾病、高血壓或糖尿病血管病變等。

本發(fā)明通過體內(nèi)動物實驗證明多肽露那辛具有抗動脈粥樣硬化的藥理活性。本發(fā)明給予apoe^-/-小鼠高脂飼料6周以使其發(fā)生動脈粥樣硬化，隨后采用腹腔注射0.5μmol/kg·d露那辛4周后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多肽露那辛可顯著抑制apoe^-/-高脂動脈粥樣硬化模型小鼠動脈管壁粥樣硬化斑塊的形成并增強粥樣斑塊穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1：小鼠整體主動脈油紅“o”染色結(jié)果。圖1-1：小鼠主動脈油紅“o”染色。a：正常對照組(c57bl/6+ns)；b：陰性藥物組(c57bl/6+0.5μmol/kglunasin)；c：模型組(apoe^-/-+ns)；d：lunasin藥物組(apoe^-/-+0.5μmol/kglunasin)。圖1-2：主動脈斑塊面積統(tǒng)計結(jié)果。^####表示模型組與正常對照組比較，p＜0.0001；^***表示lunasin藥物組與模型組比較，p＜0.001(n＝3，means±sem)。

圖2：組織切片采用movat五色套染檢測結(jié)果。

圖3：巨噬細胞免疫熒光檢測結(jié)果。a.正常對照組(c57bl/6+ns)；b.陰性藥物組(c57bl/6+0.5μmol/kglunasin)；c.模型組(apoe^-/-+ns)；d.lunasin藥物組(apoe^-/-+0.5μmol/kglunasin)。

具體實施方式

實施例1動脈粥樣硬化動物模型的建立及給藥處理

20只6周齡apoe^-/-小鼠及12只c57bl/6小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：scxk(京)2012-0001。動物喂養(yǎng)于spf級動物房，維持室溫25℃，濕度40％-70％，明暗各12h，小鼠自由進食飲水。小鼠給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，apoe^-/-小鼠給予高脂飼料(researchdiets，d12108c)，c57bl/6小鼠給予基礎(chǔ)飼料，喂養(yǎng)6周后，apoe^-/-小鼠及c57bl/6各取4只，麻醉處死后，取主動脈根部用movat五色套染法染色檢測造模是否成功。確認造模成功后，apoe^-/-小鼠隨機分為模型組(生理鹽水)、給藥組(0.5μmol/kglunasin)，c57bl/6小鼠隨機分為正常對照組(生理鹽水)和陰性藥物組(0.5μmol/kglunasin)。多肽露那辛(lunasin)藥物采用本實驗室建立的基因工程方法(setrerrahmane，s.applbiochembiotechnol174(2014)，612-622)制備得到。采用腹腔注射方式給藥，1次/天，給藥劑量為0.5μmol/kg，連續(xù)給藥4周后，小鼠麻醉后處死，分離主動脈弓至髂總動脈分叉處的整條動脈進行油紅“o”染色，同時取主動脈根部進行組織切片和movat五色套染及巨噬細胞免疫熒光實驗。

實施例2小鼠整體主動脈油紅“o”染色：

實驗結(jié)束后小鼠麻醉后，小心解剖分離出完整主動脈，經(jīng)4％多聚甲醛固定后，流水沖洗10min，剝?nèi)ネ饽さ慕Y(jié)締組織，雙蒸水浸泡3min后，油紅“o”工作液中染色2h，70％乙醇浸泡標本至斑塊呈現(xiàn)紅色，底色呈現(xiàn)白色為止。蒸餾水沖洗后浸入甲醛中長期固定保存。

小鼠整體主動脈油紅“o”染后，主動脈內(nèi)斑塊呈紅色，結(jié)果如圖1所示：野生型c57bl/6正常對照組小鼠(1-1a)和陰性藥物組小鼠(1-1b)主動脈壁光滑、平整、有彈性，與周圍組織無粘連，幾乎無陽性as染色斑塊。模型組apoe^-/-小鼠主動脈壁粗糙，彈性欠佳，可見較多突向管腔，且主動脈紅色斑塊面積與正常組比較顯著增多(p＜0.0001)，而lunasin藥物組apoe^-/-小鼠主動脈內(nèi)紅色斑塊顯著減少(p＜0.001)。結(jié)果表明apoe^-/-小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)6周后可形成明顯動脈粥樣硬化斑塊，腹腔注射0.5μmol/kglunasin可顯著抑制其動脈斑塊的形成。

實施例3組織切片及movat五色套染檢測

緊貼主動脈根部離斷心臟，立即放入4％多聚甲醛中固定48h后，從心耳下冠狀面剖切心臟，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度4μm。切片常規(guī)脫蠟復水后采用russell改良movat五色套染法染色并用zeiss顯微鏡觀察拍照。具體操作步驟如下：

1、取適量bouin固定液放入微波爐中，中度加熱30～60s(入片時為50℃)，立即放入切片處理10min。流水沖洗10min。

2、海波溶液處理5min，蒸餾水沖洗3min×3次。

3、1％阿利新藍染色液中染色20min，流水沖洗2～5min。

4、用微波爐強火45～60℃預(yù)熱堿性乙醇溶液后，將切片放入堿性乙醇溶液中處理10min。流水沖洗5min。

5、切片入預(yù)先配制好的試劑weigert蘇木素染色液中，避光染色60min。流水沖洗3次，蒸餾水沖洗3min×3次

6、切片入預(yù)先配制好的試劑(e)-藏紅品紅染色液中，避光染色1min。蒸餾水沖洗2～3次，每次3～5min。

7、將切片入5％磷鎢酸溶液中處理5min，直接轉(zhuǎn)入弱酸分化液中處理5min。蒸餾水沖洗2～3次，每次3～5min。

8、脫水：95％乙醇1min，100％乙醇2次，每次1min。

9、將切片入藏紅花染色液中，染色5min。

10、脫水：無水乙醇2次，每次1min。二甲苯透明，中性樹膠封片。

movat五色套染后，細胞核和彈力纖維呈黑色，膠原蛋白和網(wǎng)狀纖維呈黃色，蛋白聚糖呈藍綠色，類纖維素、纖維素呈深紅色，心肌平滑肌呈紅色，泡沫細胞呈紫色。

結(jié)果如圖2所示：正常組小鼠和陰性藥物組小鼠可見主動脈內(nèi)膜厚度均一，表面光滑。模型組apoe^-/-小鼠主動脈根部經(jīng)movat五色套染后，可見主動脈瓣膜芽瓣增寬延長，內(nèi)膜增厚顯著，可看到明顯動脈粥樣硬化斑塊，表面有大量紫色泡沫細胞覆蓋，膽固醇酯及膽固醇結(jié)晶明顯增多，纖維帽較薄，脂質(zhì)侵蝕，鈣化，黃色膠原成分明顯減少，內(nèi)膜表面凸凹不平，顯示出易損斑塊特征。lunasin藥物治療后，與模型組比較，可顯著抑制內(nèi)膜的增厚，膽固醇酯及膽固醇結(jié)晶亦明顯減少，黃色膠原蛋白和黑色彈力纖維成分明顯增多，內(nèi)膜表面相對平整，斑塊穩(wěn)定性增加。

由此證明，lunasin可顯著抑制高脂飲食所致的apoe^-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成，并增強了斑塊的穩(wěn)定性，對動脈粥樣硬化的發(fā)展具有顯著的抑制作用。

實施例4巨噬細胞(mcp-1)免疫熒光檢測

按實施例3所述方法進行組織切片，并進行以下巨噬細胞(mcp-1)免疫熒光檢測實驗。

1、組織切片后，60℃烤1h；

2、依次脫蠟：二甲苯i15min，二甲苯ii15min，無水乙醇5min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，pbs5min；

3、脫蠟后的切片置于檸檬酸緩沖液中，加熱煮沸20min，自然冷卻后，pbs洗3次，5min/次；

4、3％h2o2室溫10min，pbs洗3次，5min/次；

5、10％山羊血清封閉，室溫30min；

6、棄封閉液，滴加mcp-1一抗(1∶200)，4℃孵育過夜；

7、37℃復溫45min，pbs洗3次，5min/次；

8、滴加alexafluor488標記的羊抗兔二抗(1∶500)，37℃避光孵育60min；

9、pbs洗3次，5min/次；

10、滴加dapi，染色10min，晾干，加甘油封片。倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

結(jié)果如圖3所示結(jié)果：正常對照組c57bl/6小鼠和陰性藥物組c57bl/6小鼠主動脈根部內(nèi)膜無增厚，亦未見綠色熒光巨噬細胞浸潤(圖3a-b)；模型組apoe^-/-小鼠主動脈根部內(nèi)膜明顯增厚，有明顯斑塊沉積，并且斑塊表面有大量綠色熒光的巨噬細胞浸潤(圖3c)；給予lunasin治療后，可顯著抑制apoe^-/-小鼠主動脈根部內(nèi)膜的增厚，并且斑塊表面呈綠色熒光的巨噬細胞亦有顯著減少(圖3d)。

綜上所述，模型組apoe^-/-小鼠主動脈根部內(nèi)壁有斑塊沉積，并且有大量巨噬細胞浸潤，lunasin治療4周后，可顯著減少巨噬細胞浸潤，抑制動脈粥樣斑塊的形成。