本發(fā)明涉及生物與醫(yī)藥新劑型、制劑技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，同時(shí)還涉及一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，方法便捷高效，同步實(shí)現(xiàn)細(xì)胞源性微囊泡表面葉酸和磁雙重標(biāo)記；還涉及一種基于細(xì)胞源性微囊泡的靶向遞送載體在制備治療或預(yù)防腫瘤的局部化療藥物和基因治療載體中的應(yīng)用，適用于科研及臨床實(shí)踐中利用這一腫瘤靶向遞送載體用于藥物或治療基因的特異性靶向輸送，用以預(yù)防或治療以下疾?。?、宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、胃癌、腎癌、肺腺癌、腦瘤等高表達(dá)葉酸受體的惡性腫瘤；2、位于淺表部位的惡性腫瘤，如皮膚癌、口腔癌；3、位于淺表部位的脈管性疾病，如皮膚或黏膜血管瘤、靜脈畸形、淋巴管畸形。

背景技術(shù)：

化學(xué)療法是目前治療惡性腫瘤最廣泛采用的臨床選擇之一，然而過低的藥物靶向遞送效率嚴(yán)重限制了其治療效果。不僅如此，傳統(tǒng)的化學(xué)療法中，藥物在全身的非特異性分布還損害機(jī)體正常細(xì)胞和組織器官的功能，導(dǎo)致不可避免的副作用和嚴(yán)重的全身毒性。另一方面，近年來蓬勃發(fā)展的基因治療正成為未來腫瘤治療最具潛力的前進(jìn)方向。針對(duì)腫瘤發(fā)生的遺傳學(xué)背景，將外源性目的基因引入腫瘤細(xì)胞或其他體細(xì)胞內(nèi)以糾正過度活化或補(bǔ)償缺陷的基因功能，從而達(dá)到治療腫瘤的目的，即為腫瘤的基因治療。雖然RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與研究為基因治療帶來了新的契機(jī)，但是當(dāng)前的基因治療策略與化學(xué)治療一樣，仍然極大受限于過低的靶向性，從而限制了臨床療效，并造成了諸多難以避免的全身副作用。綜上，臨床急需更安全可靠、更生物友好、更具有靶向性的藥物或治療基因遞送載體，以降低全身的副反應(yīng)，增強(qiáng)治療效果。近年來，基于納米載體的藥物遞送系統(tǒng)得到了迅猛的發(fā)展，這一方面得益于腫瘤病變部位因紊亂的脈管系統(tǒng)增強(qiáng)了局部的“滲透和保留效果”，導(dǎo)致納米載體被動(dòng)聚集于實(shí)體瘤部位，另一方面也是因?yàn)椴煌男揎椃椒ㄙx予了納米載體主動(dòng)地腫瘤靶向性。這些基于納米載體的藥物遞送系統(tǒng)可以保護(hù)荷載藥物在遞送過程中免于生物降解，表現(xiàn)為更優(yōu)良的活體穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的藥物半衰期，從而大極大增加藥物在腫瘤病變部位的作用時(shí)間，改善臨床療效。

細(xì)胞源性的微囊泡，作為一種生物源性納米級(jí)別的膜性結(jié)構(gòu)(直徑約100-1000nm)，幾乎所有細(xì)胞均可分泌，可以實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞間傳遞多種生物活性分子(包括蛋白質(zhì)、RNAs、DNAs等)。它作為一種天然的生物信息傳遞平臺(tái)，已受到廣泛關(guān)注，并且其作為治療載體的應(yīng)用價(jià)值也逐漸被認(rèn)識(shí)和開發(fā)。相比于傳統(tǒng)的人工合成的納米載體，細(xì)胞源性微囊泡作為藥物或基因遞送載體具備以下優(yōu)點(diǎn)：

1、微囊泡的磷脂雙分子層外膜不僅可以作為天然的屏障，保護(hù)內(nèi)容物在循環(huán)過程中不被降解，還可以通過與受體細(xì)胞膜的相互作用或直接融合增強(qiáng)內(nèi)容物被受體細(xì)胞內(nèi)吞的效率；

2、得益于其來源和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，微囊泡具備穿透體內(nèi)生物屏障，將藥物直接遞送至顱內(nèi)等深在部位的潛能；

3、即使不經(jīng)過任何人工修飾，細(xì)胞源性微囊泡也具備固有的天然腫瘤靶向性；

4、微囊泡在體內(nèi)循環(huán)過程中具備良好的生物穩(wěn)定性；

5、微囊泡具備優(yōu)異的生物安全性，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)自體同源的微囊泡幾乎不存在免疫原性。

然而，伴隨著細(xì)胞源性微囊泡迅速轉(zhuǎn)化為實(shí)踐應(yīng)用的納米載體，面臨的問題不斷涌現(xiàn)，諸如缺乏方便快速的用于分離富集細(xì)胞源性微囊泡的技術(shù)和方法，缺乏可擴(kuò)展的高效裝載內(nèi)容物的方法，以及受限的腫瘤特異靶向性等，這些缺陷嚴(yán)重阻礙了這一新技術(shù)新領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用。

葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)R)是一類糖基磷脂酰肌醇錨定的膜蛋白，對(duì)葉酸(folate，F(xiàn)A)具有極高的親和性，并且通過受體介導(dǎo)的胞吞作用攝取葉酸。研究發(fā)現(xiàn)，葉酸受體選擇性高表達(dá)于卵巢腫瘤以及許多上皮來源惡性腫瘤，諸如子宮內(nèi)膜癌、腎癌、肺癌、乳腺癌、腦瘤等，而其在正常組織中呈現(xiàn)為極低甚至可忽略的表達(dá)水平。上述結(jié)果提示葉酸/葉酸受體(FA/FR)系統(tǒng)具備極大的腫瘤靶向性研究?jī)r(jià)值，一方面可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異高選擇性，降低對(duì)正常組織的毒副作用，另一方面又可以利用這一受體介導(dǎo)的胞吞作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)治療藥物的攝取，改善臨床療效。

磁性納米顆粒結(jié)合外源性磁場(chǎng)(magnetic field，MF)已經(jīng)被用于改善藥物載體的靶向性，這一技術(shù)被稱為磁性藥物靶向。通過將磁性材料與細(xì)胞共培養(yǎng)，可以獲取內(nèi)部裝載有超順磁性納米顆粒的微囊泡，結(jié)合外源性磁場(chǎng)可以實(shí)現(xiàn)這些微囊泡在特定部位的富集。并且，裝載有磁性納米顆粒的微囊泡還可以作為造影劑用于核磁共振成像檢查以及熱溫治療。此外，利用外源性磁場(chǎng)促進(jìn)此種微囊泡在腫瘤部位的大量富集可以有效降低受體介導(dǎo)的靶向定位過程中發(fā)生的脫靶效應(yīng)。然而，此種修飾策略中細(xì)胞對(duì)磁性納米顆粒的吞噬以及微囊泡對(duì)內(nèi)吞磁性顆粒的包裹完全是非選擇性和不可控的。因此，這一“間接包裝”策略仍然存在效率不高，產(chǎn)量過低以及產(chǎn)物不均勻的弊病，這些都嚴(yán)重限制了它的臨床應(yīng)用。通過與膜上特異受體結(jié)合的免疫磁性分離方法已經(jīng)廣泛用于分離天然囊泡，并且相較于超速離心方法，其展現(xiàn)出了諸多優(yōu)勢(shì)(例如便捷，高效等)。然而，這種策略也極大的受限于因微囊泡特征性表面標(biāo)志物的缺乏而造成的產(chǎn)量過低。綜上，當(dāng)前急需一種生物友好的、高效的、通用的標(biāo)記策略以克服上述弊端，尤其是實(shí)現(xiàn)已改造微囊泡的可擴(kuò)展的生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供了一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，微囊泡的磷脂雙分子層外膜不僅可以作為天然的屏障，保護(hù)內(nèi)容物在循環(huán)過程中不被降解，還可以通過受體細(xì)胞膜的相互作用或直接融合增強(qiáng)內(nèi)容物被受體細(xì)胞內(nèi)吞的效率；得益于其來源和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，微囊泡具備穿透體內(nèi)生物屏障，將藥物直接遞送至顱內(nèi)等深在部位的潛能；即使不經(jīng)過任何人工修飾，細(xì)胞源性微囊泡也具備固有的天然腫瘤靶向性；此外本發(fā)明制備的細(xì)胞源性囊泡還具有受體/配體、磁雙重靶向，其靶向性得到進(jìn)一步提升；微囊泡在體內(nèi)循環(huán)過程中具備良好的生物穩(wěn)定性；微囊泡具備優(yōu)異的生物安全性，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)自體同源的微囊泡幾乎不存在免疫原性。本發(fā)明制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的藥物和治療基因靶向遞送載體可以有效增強(qiáng)荷載藥物或治療基因在腫瘤部位的富集，適用于多種腫瘤的治療；增強(qiáng)抗腫瘤療效。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，該方法一次性實(shí)現(xiàn)細(xì)胞源性微囊泡表面的葉酸和磁的雙重標(biāo)記；方法易行，操作簡(jiǎn)便，適用性廣，可用于獲得各種細(xì)胞源性功能化微囊泡；制備方法不依賴于復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)備，適合廣泛推廣；制備效率高，節(jié)省人力物力財(cái)力，在微囊泡收集前的培養(yǎng)過程中同步實(shí)現(xiàn)雙重修飾改造過程；利用前期修飾過程簡(jiǎn)化了微囊泡載體的分離步驟，同時(shí)避免了潛在的蛋白聚合物、凋亡小體等雜質(zhì)的污染，極大改善了產(chǎn)物純度；制備產(chǎn)物均一性好，且產(chǎn)量具備擴(kuò)展性；實(shí)現(xiàn)了快速方便、經(jīng)濟(jì)高效的制備一種具備葉酸和磁雙靶向性的藥物遞送載體。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供一種基于細(xì)胞源性微囊泡的藥物和治療基因靶向遞送載體在制備治療或預(yù)防腫瘤的局部治療藥物中的應(yīng)用。通過電穿孔方法向改造后的微囊泡載體中載入不同的敏感性化療藥物或治療基因，針對(duì)不同的腫瘤，配合外源性磁場(chǎng)的應(yīng)用，可以有效增強(qiáng)荷載藥物或治療基因在腫瘤部位的富集，適用于多種腫瘤的治療；增強(qiáng)抗腫瘤療效，改善了當(dāng)前化學(xué)治療或基因治療的臨床效果；在維持腫瘤局部有效治療濃度的同時(shí)可以降低血藥濃度，從而有效降低了藥物的全身副作用。這一應(yīng)用具備的優(yōu)勢(shì)為腫瘤的臨床治療帶來了新的希望。

為了達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

其技術(shù)構(gòu)思是：一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，由細(xì)胞源性微囊泡、磷脂-聚乙二醇-生物素(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]，DSPE-PEG-Biotin)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)、磷脂-聚乙二醇-葉酸(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[folate(polyethylene glycol)-2000]，DSPE-PEG-FA)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)和鏈霉親和素修飾氧化鐵納米顆粒(Streptavidin-conjugated iron oxide nanoparticles，SA-IONPs)(Enriching Biotechnology，Shanghai，China)四部分組成，修飾過程為：利用磷脂替換策略將DSPE-PEG-Biotin和DSPE-PEG-FA修飾在細(xì)胞膜表面，然后饑餓處理所得的細(xì)胞，使細(xì)胞分泌細(xì)胞源性囊泡至培養(yǎng)上清中，最后將SA-IONPs加入到上清中，使SA-IONPs與上清中的細(xì)胞源性囊泡結(jié)合，最后利用磁性分離的方法收集FA/IONP-MVs。

各部分結(jié)構(gòu)式如下：

細(xì)胞源性微囊泡(MVs)：(結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)。

DSPE-PEG-Biotin：

DSPE-PEG-FA：SA-IONPs：

一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs-DOX/siRNA/miRNA)：(結(jié)構(gòu)示意圖見圖2)。一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，其步驟是：

1、配置條件培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補(bǔ)充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v)抗生素，同時(shí)添加DSPE-PEG-Biotin,(50ug/mL)和DSPE-PEG-Folate(5ug/mL)，4℃保存，獲得條件培養(yǎng)基；

2、將步驟1中獲得的條件培養(yǎng)基用于細(xì)胞的培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)約46－50h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80％左右時(shí)更換培養(yǎng)基，用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)46－50h，以促進(jìn)細(xì)胞釋放微囊泡，收集培養(yǎng)上清，用于后續(xù)分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的培養(yǎng)上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，在4℃條件下繼續(xù)50000g離心60min，將獲取的沉淀用無菌PBS重懸，重懸后液體在4℃條件下繼續(xù)50000g離心60min，獲取的修飾后微囊泡用適宜體積無菌PBS重懸，凍存于-80℃。

4、將步驟3中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與抗生物素和抗葉酸的抗體在37℃條件下孵育28－32min，通過蔗糖密度梯度離心法去除游離抗體后，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和熒光顯微鏡觀察，確定上述制備的種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體上葉酸和生物素雙重標(biāo)記的效率為92％左右。獲得膜表面經(jīng)葉酸及氧化鐵納米顆粒雙重修飾效率達(dá)到約92％的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

5、將步驟2中獲得的培養(yǎng)上清在3－5℃條件下用1800－2200g離心18－22min，然后取上清，每100mL培養(yǎng)上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育28－32min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標(biāo)記成功的微囊泡分離出來，用PBS重懸并洗脫數(shù)次(3－7次)，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經(jīng)插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

6、將步驟5中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體進(jìn)行透射電鏡觀察、動(dòng)態(tài)光散射分析和分子生物學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組未修飾微囊泡，以及經(jīng)常規(guī)超速離心分離的已修飾微囊泡，此種改造方法對(duì)微囊泡的水流動(dòng)力學(xué)直徑、界面電動(dòng)勢(shì)等物理性質(zhì)，以及內(nèi)部包裹的蛋白質(zhì)、核酸等特征性分子的表達(dá)無明顯影響。上述結(jié)果證明這一基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備過程具備良好的生物友好性。獲得理化特性及生物學(xué)特征未見明顯改變的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體。

7、將正常未修飾微囊泡和步驟5中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)不同濃度上述微囊泡載體對(duì)細(xì)胞增殖和活力等功能的影響。將正常未修飾微囊泡和上述制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體分別經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)，三周后對(duì)裸鼠進(jìn)行肝腎功能分析、血液學(xué)分析，以及腫瘤組織學(xué)分析，相較于性別、年齡和體重配對(duì)的對(duì)照組裸鼠，上述制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體對(duì)裸鼠的肝腎功能，血液成分等指標(biāo)均無明顯的影響，并且未發(fā)現(xiàn)潛在的免疫毒性，證明這一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體具備優(yōu)良的活體生物安全性，不存在明顯的副反應(yīng)。獲得無明顯活體毒副作用的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體。

8、將步驟5中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該遞送載體可有效被細(xì)胞攝取，并且其攝取效率受到培養(yǎng)基中游離葉酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，而在外源性磁場(chǎng)的作用下，又可削弱培養(yǎng)基中游離葉酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，促進(jìn)細(xì)胞攝取該遞送載體。獲得可有效被腫瘤細(xì)胞經(jīng)葉酸受體介導(dǎo)的胞吞作用攝取的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體。

9、將步驟5中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體用近紅外熒光探針DiR標(biāo)記后經(jīng)尾靜脈注射于移植瘤模型的裸鼠體內(nèi)，相較于對(duì)照組未修飾的微囊泡，上述基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體更顯著地聚集于腫瘤部位，并且在腫瘤部位施加外源磁場(chǎng)的作用下，此種聚集效率可明顯增強(qiáng)，通過對(duì)總熒光信號(hào)的分析，在注射后4h，對(duì)照組未修飾微囊泡在腫瘤部位的聚集效率為5.31％，單純修飾氧化鐵納米顆粒的微囊泡輔助外源性磁場(chǎng)約為13.23％，而靶向遞送載體輔助外源性磁場(chǎng)為25.89％，證明這一基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體具備優(yōu)異的活體內(nèi)腫瘤靶向性。獲得具備良好活體內(nèi)主動(dòng)及外源磁場(chǎng)介導(dǎo)的被動(dòng)腫瘤靶向性的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(其結(jié)構(gòu)示意圖見附圖圖3)。該載體的外膜是類似于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結(jié)合，包繞于載體外側(cè)；載體的內(nèi)部為各種來源于母細(xì)胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、microRNA和蛋白質(zhì)。

一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體在制備治療或預(yù)防腫瘤的局部化療藥物中的應(yīng)用，步驟如下：

1、配置條件培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1％(v/v)抗生素，同時(shí)添加DSPE-PEG-Biotin(50ug/mL)和DSPE-PEG-Folate(5ug/mL)，4℃保存，獲得條件培養(yǎng)基；

2、將步驟1中獲得的條件培養(yǎng)基用于細(xì)胞的培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)約46－50h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80％左右時(shí)更換培養(yǎng)基，用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM，Hyclone)繼續(xù)培養(yǎng)46－50h，以促進(jìn)細(xì)胞釋放微囊泡，收集培養(yǎng)上清，用于后續(xù)分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在3－5℃條件下用1800－2200g離心18－22min，然后取上清，每100mL培養(yǎng)上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育28－32min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標(biāo)記成功的微囊泡分離出來，用PBS重懸并洗脫數(shù)次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經(jīng)插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的微囊泡載體。

4、將步驟3中收集的腫瘤靶向遞送載體與水溶性抗腫瘤藥物，如阿霉素(Doxorubicin，DOX)(40μg/mL)混合，利用電穿孔方式載入抗腫瘤藥物，在37℃溫箱中孵育28－32min，在外源性磁場(chǎng)作用下分離腫瘤靶向遞送載體，去除游離藥物，用PBS重懸并洗脫數(shù)次(4－8次)，最后將沉淀用PBS重懸。獲得載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

5、將步驟4中獲得的載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞學(xué)、小動(dòng)物活體成像等多種技術(shù)手段檢驗(yàn)藥物載入效率以及載藥后腫瘤靶向遞送載體的保存穩(wěn)定性和活體穩(wěn)定性。

6、將步驟4中獲得的載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可有效的被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，并且其內(nèi)吞效率受到培養(yǎng)基中游離葉酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制以及外源性磁場(chǎng)的正向促進(jìn)。

7、將正常未修飾微囊泡、游離DOX、載有DOX的正常未修飾微囊泡、未載藥的靶向遞送載體以及步驟4中獲得的載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體分別經(jīng)尾靜脈注射于移植瘤裸鼠模型體內(nèi)，每三天監(jiān)測(cè)裸鼠體重及腫瘤大小變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述載藥后腫瘤靶向遞送載體發(fā)揮了最優(yōu)異的抗腫瘤生長(zhǎng)效果，并且在輔助外源性磁場(chǎng)的條件下，上述載藥后腫瘤靶向遞送載體幾乎完全抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)裸鼠體重?zé)o明顯影響。安樂處死裸鼠，收獲腫瘤行組織學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述載藥后腫瘤靶向遞送載體有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖。

所述的腫瘤為宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、胃癌、腎癌、肺腺癌、腦瘤等高

表達(dá)葉酸受體的惡性腫瘤；

所述的腫瘤位于淺表部位的惡性腫瘤，具體為皮膚癌、口腔癌；

所述的位于淺表部位的脈管性疾病，具體為皮膚或黏膜血管瘤、靜脈畸形、淋巴管畸形。

一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體在制備治療或預(yù)防腫瘤的基因治療藥物中的應(yīng)用，步驟如下：

1、配置條件培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1％(v/v)抗生素，同時(shí)添加DSPE-PEG-Biotin(50ug/mL)和DSPE-PEG-Folate(5ug/mL)，4℃保存，獲得條件培養(yǎng)基；

2、將步驟1中獲得的條件培養(yǎng)基用于細(xì)胞的培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)約46－50h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80％左右時(shí)更換培養(yǎng)基，用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM，Hyclone)繼續(xù)培養(yǎng)46－50h，以促進(jìn)細(xì)胞釋放微囊泡，收集培養(yǎng)上清，用于后續(xù)分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在3－5℃條件下用1800－2200g離心18－22min，然后取上清，每100mL培養(yǎng)上清中添加400μL SA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育28－32min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標(biāo)記成功的微囊泡分離出來，用PBS重懸并洗脫數(shù)次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經(jīng)插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的微囊泡載體。

4、將步驟3中收集的腫瘤靶向遞送載體與治療基因(例如siRNA、miRNA等)混合，利用電穿孔方式載入抗腫瘤藥物，在37℃溫箱中孵育28－32min，在外源性磁場(chǎng)作用下分離腫瘤靶向遞送載體，去除游離治療基因，用PBS重懸并洗脫數(shù)次(4－8次)，最后將沉淀用PBS重懸。獲得載有抗腫瘤治療基因的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

5、將步驟4中獲得的載有抗腫瘤治療基因的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞學(xué)、小動(dòng)物活體成像等多種技術(shù)手段檢驗(yàn)治療基因載入效率以及載藥后腫瘤靶向遞送載體的保存穩(wěn)定性和活體穩(wěn)定性。

6、將步驟4中獲得的載有抗腫瘤治療基因的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可有效的被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，并且相應(yīng)治療基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高度富集，而其內(nèi)吞效率受到培養(yǎng)基中游離葉酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制以及外源性磁場(chǎng)的正向促進(jìn)。最后檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)靶基因的調(diào)節(jié)變化，以及對(duì)腫瘤增殖等功能活動(dòng)的影響。

7、將正常未修飾微囊泡、游離治療基因、裝載有治療基因的正常未修飾微囊泡、未載入治療基因的靶向遞送載體以及步驟4中獲得的載有治療基因的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體分別經(jīng)尾靜脈注射于移植瘤裸鼠模型體內(nèi)，每三天監(jiān)測(cè)裸鼠體重及腫瘤大小變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述載藥后腫瘤靶向遞送載體發(fā)揮了最優(yōu)異的抗腫瘤生長(zhǎng)效果，并且在輔助外源性磁場(chǎng)的條件下，上述載藥后腫瘤靶向遞送載體幾乎完全抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)裸鼠體重?zé)o明顯影響。安樂處死裸鼠，收獲腫瘤行組織學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述載藥后腫瘤靶向遞送載體有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖。

所述的腫瘤為宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、胃癌、腎癌、肺腺癌、腦瘤等高表達(dá)葉酸受體的惡性腫瘤；

所述的腫瘤位于淺表部位的惡性腫瘤，具體為皮膚癌、口腔癌；

所述的位于淺表部位的脈管性疾病，具體為皮膚或黏膜血管瘤、靜脈畸形、淋巴管畸形。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

1、本發(fā)明選擇細(xì)胞源性微囊泡構(gòu)建腫瘤靶向遞送載體，利用微囊泡的天然屬性，相較于人工合成的納米載體，在體內(nèi)具備良好的生物穩(wěn)定性和生物安全性，幾乎無免疫原性和細(xì)胞毒性，同時(shí)天然的磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)可以保護(hù)載入內(nèi)容物的循環(huán)穩(wěn)定性，并且可以直接穿透體內(nèi)的生物屏障，將荷載藥物遞送至顱內(nèi)等特殊臟器，發(fā)揮優(yōu)良的抗腫瘤效果；

2、利用膜修飾的方式一次性實(shí)現(xiàn)微囊泡表面葉酸和氧化鐵納米顆粒的雙重標(biāo)記，快捷高效；

3、利用膜修飾方式實(shí)現(xiàn)微囊泡表面氧化鐵納米顆粒標(biāo)記，相較于之前通過培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)微囊泡非選擇性隨機(jī)包裹氧化鐵納米顆粒的方式，本發(fā)明的標(biāo)記操作更高效、方便，標(biāo)記效率更高，標(biāo)記密度完全可控，且在胞膜上標(biāo)記，節(jié)省了微囊泡內(nèi)部的空間，為腫瘤治療藥物的荷載預(yù)留了場(chǎng)所；

4、利用膜修飾的方式實(shí)現(xiàn)微囊泡表面氧化鐵納米顆粒的標(biāo)記，繼而利用磁特性實(shí)現(xiàn)微囊泡載體的分離富集，相較于之前通過超速離心的方式或者免疫磁性方式分離微囊泡，本發(fā)明操作簡(jiǎn)潔高效，只需一步，分離用時(shí)少于1小時(shí)，可實(shí)現(xiàn)高達(dá)92％的微囊泡的分離富集，不再受限于表面標(biāo)志物的缺乏，提高了產(chǎn)量，可以滿足臨床用量的需求；避免了蛋白聚集物或諸如凋亡小體等其他顆粒的污染，保證產(chǎn)物的純度和均一性，有助于降低副反應(yīng)；溫和的分離操作環(huán)境避免了微囊泡的聚集或者破損，有助于保持其功能活性；

5、本發(fā)明利用膜修飾的方式實(shí)現(xiàn)微囊泡表面氧化鐵納米顆粒標(biāo)記，為該腫瘤靶向遞送載體賦予了磁特性，有助于后續(xù)應(yīng)用擴(kuò)展，例如后續(xù)可利用外源性磁場(chǎng)增強(qiáng)藥物的腫瘤靶向性創(chuàng)造了條件；

6、本發(fā)明利用膜修飾的方式實(shí)現(xiàn)微囊泡表面葉酸的標(biāo)記，操作簡(jiǎn)潔高效，標(biāo)記效率高，且標(biāo)記密度穩(wěn)定可控。由于大多數(shù)上皮來源腫瘤及卵巢腫瘤高表達(dá)葉酸受體，而正常組織則低表達(dá)葉酸受體，經(jīng)葉酸修飾的腫瘤靶向遞送載體可以經(jīng)由受體介導(dǎo)的途徑被腫瘤細(xì)胞迅速高效內(nèi)吞，有效增強(qiáng)該腫瘤靶向遞送載體的腫瘤靶向性，同時(shí)減少被正常組織的攝取，降低全身副反應(yīng)。

7、本發(fā)明利用電穿孔的方式實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物或治療基因的載入，操作簡(jiǎn)潔高效，相較于直接給藥，微囊泡的天然膜結(jié)構(gòu)可有效增強(qiáng)荷載物在體內(nèi)循環(huán)過程中的穩(wěn)定性，減少給藥濃度，降低副反應(yīng)。

8、本發(fā)明具備良好的可擴(kuò)展性，可根據(jù)病人選擇自體同源的微囊泡構(gòu)建腫瘤靶向遞送載體，同時(shí)根據(jù)腫瘤對(duì)藥物或治療基因的敏感性選擇合適的載入藥物，實(shí)現(xiàn)腫瘤的個(gè)體化治療。

附圖說明

圖1為一種細(xì)胞源性微囊泡(MVs)的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載(FA/IONP-MVs-DOX/siRNA/ miRNA)的結(jié)構(gòu)示意圖。其中：O代表氧原子，HO代表羥基，N代表氮原子，NH代表亞氨基，NH₂代表氨基，NH₄⁺代表銨根，C代表碳原子，P代表磷原子，S代表硫原子。

圖3為一種具備良好活體內(nèi)主動(dòng)及外源磁場(chǎng)介導(dǎo)的被動(dòng)腫瘤靶向性的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的結(jié)構(gòu)示意圖。該載體的外膜是類似于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結(jié)合，包繞于載體外側(cè)；載體的內(nèi)部為各種來源于母細(xì)胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、microRNA和蛋白質(zhì)。

圖4為一種膜表面經(jīng)插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的結(jié)構(gòu)示意圖。該載體的外膜是類似于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結(jié)合，包繞于載體外側(cè)；載體的內(nèi)部為來源于母細(xì)胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、microRNA和蛋白質(zhì)。

圖5為一種載有化療藥物的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的結(jié)構(gòu)示意圖。該載體外膜是類似于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結(jié)合，包繞于載體外側(cè)；載體內(nèi)部為來源于母細(xì)胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、micro-RNA和蛋白質(zhì)；此外，載體內(nèi)部還裝載有抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)。

圖6為一種載有針對(duì)survivin的抗腫瘤siRNA的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的結(jié)構(gòu)示意圖。該載體外膜是類似于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結(jié)合，包繞于載體外側(cè)；載體內(nèi)部為來源于母細(xì)胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、micro-RNA和蛋白質(zhì)；此外，載體內(nèi)部還裝載有具備抗腫瘤作用的siRNA。

圖7為一種本發(fā)明內(nèi)容模式圖。

圖8為一種細(xì)胞源性微囊泡表面DSPE-PEG-Biotin和DSPE-PEG-Folate同步標(biāo)記效率。

將經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，再饑餓48h后收獲的細(xì)胞上清經(jīng)常規(guī)高速離心后收獲修飾后細(xì)胞微囊泡，將其與抗生物素和抗葉酸熒光抗體孵育，通過蔗糖密度梯度離心法去除游離抗體后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雙陽性微囊泡的比例，結(jié)果提示微囊泡表面DSPE-PEG-Biotin和DSPE-PEG-Folate同步標(biāo)記效率約為92％。

圖9為一種利用外源性磁場(chǎng)快速分離該腫瘤靶向遞送載體的操作圖。

圖10為一種腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)在雙重標(biāo)記及磁介導(dǎo)的分離過程中對(duì)微囊泡固有生物學(xué)特性無明顯影響。

將常規(guī)超速離心的正常未修飾細(xì)胞微囊泡[MVs(DC)]，常規(guī)超速離心的葉酸和生物素雙修飾微囊泡[FA/Biotin-MVs(DC)]、經(jīng)常規(guī)超速離心的腫瘤靶向遞送載體[FA/IONP-MVs(DC)]和磁介導(dǎo)分離的腫瘤靶向遞送載體[FA/IONP-MVs(MS)]分別提取核酸和蛋白質(zhì)進(jìn)行RT-qPCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)不同組微粒所攜帶的標(biāo)志性核酸及蛋白質(zhì)的差異。結(jié)果表明這一腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)在雙重標(biāo)記及磁介導(dǎo)的分離過程中對(duì)微囊泡固有生物學(xué)特性無明顯影響。

圖11為一種腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)在不載入藥物的狀態(tài)下對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖或活力等功能影響相較于正常未修飾細(xì)胞微囊泡(MVs)無明顯差異，提示該腫瘤靶向遞送載體具備良好的生物安全性。

圖12為一種靜脈注射該腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)對(duì)移植瘤裸鼠模型的體重?zé)o明顯影響。

將PBS(Control)、正常未修飾微囊泡(MVs)和該腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)分別經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)入移植瘤裸鼠模型體內(nèi)，每三天一次，同時(shí)監(jiān)測(cè)裸鼠體重，結(jié)果表明三組無顯著差異。

圖13為一種相較于PBS(Control)或正常未處修飾細(xì)胞微囊泡(MVs)，尾靜脈注射該腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)對(duì)移植瘤裸鼠的肝腎功能及血液學(xué)指標(biāo)影響無顯著差異。

圖14為一種腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)能更高效的被細(xì)胞攝取，并且其攝取效率受共培養(yǎng)體系中游離葉酸(Free FA)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制和外源性磁場(chǎng)(MF)的正向促進(jìn)。

將正常未修飾細(xì)胞微囊泡(MVs)和制備的腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)用近紅外熒光探針DiR進(jìn)行標(biāo)記染色，然后將他們分別與腫瘤細(xì)胞HeLa共培養(yǎng)，在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取效率以及當(dāng)在共培養(yǎng)體系中添加游離葉酸(FA)前后，或施加外源性磁場(chǎng)(MF)前后的攝取效率變化。

圖15為一種腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)在移植瘤裸鼠體內(nèi)具備良好的腫瘤靶向性。

將正常微囊泡(MVs)，該腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)和單純氧化鐵納米顆粒標(biāo)記的微囊泡(IONP-MVs)分別用近紅外熒光探針DiR染色標(biāo)記后經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)移植瘤裸鼠體內(nèi)，然后在活體熒光成像系統(tǒng)中觀察注射前以及注射后1h、注射后2h、注射后4h裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)的分布，最后將裸鼠麻醉處死后單獨(dú)觀察每組裸鼠內(nèi)臟及腫瘤中熒光信號(hào)的分布。結(jié)果表明，在外源性磁場(chǎng)(MF)的輔助下，該腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)具備最優(yōu)異的腫瘤靶向性。

圖16為一種腫瘤靶向遞送載體載入腫瘤化療藥物的效率。

利用電穿孔的方式向該腫瘤靶向遞送載體內(nèi)載入化療藥物DOX，然后采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析在電穿孔操作時(shí)不同藥物濃度(1μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL)對(duì)載入效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)載入效率與藥物濃度成正相關(guān)；將載入藥物后的腫瘤靶向遞送載體用CFSE進(jìn)行染色，然后在熒光顯微鏡下可以觀察到化療藥物DOX熒光信號(hào)和微囊泡信號(hào)的共定位。

圖17為一種載入化療藥物DOX后該腫瘤靶向遞送載體可有效地抗宮頸癌腫瘤生長(zhǎng)作用及低生物毒性。

將PBS、游離DOX(Free DOX)、載有DOX的正常未處理細(xì)胞微囊泡(MVs-DOX)、載有DOX的單純氧化鐵納米顆粒標(biāo)記的微囊泡(IONP-MVs-DOX)以及載入DOX后的腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs-DOX)分別經(jīng)尾靜脈注射入宮頸癌移植瘤裸鼠模型體內(nèi)，每3天一次，同時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤體積變化(寬*寬*長(zhǎng)/2)和裸鼠體重變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)配合腫瘤局部外源性磁場(chǎng)作用，載入化療藥物DOX后該腫瘤靶向遞送載體具備良好的抗腫瘤生長(zhǎng)作用，并且對(duì)裸鼠體重?zé)o明顯影響。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1:

一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，其步驟是：

1、條件培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補(bǔ)充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v)抗生素，同時(shí)添加DSPE-PEG-Biotin(50ug/mL)和DSPE-PEG-Folate(5ug/mL)，4℃保存，獲得條件培養(yǎng)基。

2、將步驟1中獲得的條件培養(yǎng)基用于細(xì)胞的培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)約48h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80％左右時(shí)更換培養(yǎng)基，用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，以促進(jìn)細(xì)胞釋放微囊泡，培養(yǎng)46-50h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于后續(xù)分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的培養(yǎng)上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，在4℃條件下繼續(xù)50000g離心60min，將獲取的沉淀用無菌PBS重懸，重懸后液體4℃條件下繼續(xù)50000g離心60min，獲取的微囊泡用適宜體積無菌PBS重懸，凍存于-80℃。

4、將步驟3中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與抗生物素和抗葉酸的抗體在37℃條件下孵育28－32min，通過蔗糖密度梯度離心法去除游離抗體后，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和熒光顯微鏡觀察，確定上述制備的種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體上葉酸和生物素雙重標(biāo)記的效率為92％左右。獲得膜表面經(jīng)葉酸及氧化鐵納米顆粒雙重修飾效率達(dá)到約92％的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。(圖2)

5、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養(yǎng)上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標(biāo)記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數(shù)次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經(jīng)插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存(該載體的結(jié)構(gòu)示意圖見圖4)。該載體的外膜是類似于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結(jié)合，包繞于載體外側(cè)；載體的內(nèi)部為來源于母細(xì)胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、microRNA和蛋白質(zhì)。

實(shí)施例2:

一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的體內(nèi)外生物安全性檢測(cè)，其步驟如下：

1、條件培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補(bǔ)充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v)抗生素，同時(shí)添加DSPE-PEG-Biotin(50ug/mL)和DSPE-PEG-Folate(5ug/mL)，4℃保存，獲得條件培養(yǎng)基。

2、將步驟1中獲得的條件培養(yǎng)基用于細(xì)胞的培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)約48h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80％左右時(shí)更換培養(yǎng)基，用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，以促進(jìn)細(xì)胞釋放微囊泡，培養(yǎng)46-50h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于后續(xù)分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養(yǎng)上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標(biāo)記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數(shù)次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經(jīng)插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

4、將步驟3中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體進(jìn)行透射電鏡觀察，動(dòng)態(tài)光散射分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組正常未修飾微囊泡，以及經(jīng)常規(guī)超速離心分離的已修飾微囊泡，此種制備方法對(duì)微囊泡的水流動(dòng)力學(xué)直徑、界面電動(dòng)勢(shì)等物理性質(zhì)無明顯影響。

5、將步驟3中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體進(jìn)行分子生物學(xué)分析，提取總蛋白質(zhì)進(jìn)行Westernblot分析，提取核酸進(jìn)行RT-qPCR分析，檢測(cè)細(xì)胞微囊泡攜帶的蛋白質(zhì)、核酸等特征性分子的表達(dá)，結(jié)果表明此種制備方法對(duì)微囊泡的內(nèi)容物無明顯影響。上述結(jié)果證明這一基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備過程是生物友好性的。(圖4)

6、將正常未修飾細(xì)胞微囊泡(20μg/mL)和步驟3中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(20μg/mL)分別與腫瘤細(xì)胞HeLa共培養(yǎng)，然后用細(xì)胞活力計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖和活力變化，發(fā)現(xiàn)即使在載體濃度高達(dá)40μg/mL的濃度，連續(xù)培養(yǎng)70－74h，該腫瘤靶向遞送載體對(duì)細(xì)胞的增殖和活力的影響均無顯著差異。(圖5)

7、將PBS(100μL，n＝5)，未修飾微囊泡(100μL，1mg/mL，n＝5)和上述制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(100μL，1mg/mL，n＝5)分別經(jīng)尾靜脈注射入周齡和體重配對(duì)的雌性C57BL/6小鼠體內(nèi)，每三天記錄一次小鼠體重，三周后對(duì)小鼠進(jìn)行肝腎功能分析、血液學(xué)分析、以及腫瘤組織學(xué)分析。相較于PBS組小鼠，未修飾微囊泡和上述制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體對(duì)小鼠的體重、肝腎功能、血液成分等指標(biāo)均無明顯的影響，并且未發(fā)現(xiàn)潛在的免疫毒性，證明這一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體具備優(yōu)良的活體生物安全性，不存在明顯的副反應(yīng)。(圖6、圖7)

實(shí)施例3:

一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的體內(nèi)外腫瘤靶向性檢測(cè)，其步驟如下：

1、條件培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補(bǔ)充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v)抗生素，同時(shí)添加DSPE-PEG-Biotin(50μg/mL)和DSPE-PEG-Folate(5μg/mL)，4℃保存，獲得條件培養(yǎng)基。

2、將步驟1中獲得的條件培養(yǎng)基用于細(xì)胞的培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)約48h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80％左右時(shí)更換培養(yǎng)基，用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，以促進(jìn)細(xì)胞釋放微囊泡，培養(yǎng)46-50h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于后續(xù)分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養(yǎng)上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標(biāo)記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數(shù)次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經(jīng)插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

4、將正常未處理細(xì)胞微囊泡(20μg/mL)和步驟3中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(20μg/mL)分別用CFSE進(jìn)行熒光染色標(biāo)記，然后將他們分別與用cellmask進(jìn)行熒光染色標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞HeLa進(jìn)行共培養(yǎng)，然后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該遞送載體可有效被細(xì)胞攝??；然后在共培養(yǎng)體系中添加游離葉酸(1mM)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)該腫瘤靶向遞送載體的攝取效率受到培養(yǎng)基中游離葉酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制；如果在培養(yǎng)瓶的底部放置磁鐵(100×50×20mm，0.6T)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源性磁場(chǎng)的輔助作用又可削弱培養(yǎng)基中游離葉酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，促進(jìn)細(xì)胞攝取該遞送載體。(圖8)

5、將正常未修飾的微囊泡，單純氧化鐵顆粒標(biāo)記的微囊泡和步驟3中制備的一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體用近紅外熒光探針DiR(300μg/mL)標(biāo)記后經(jīng)尾靜脈注射于移植瘤模型的裸鼠體內(nèi)，然后于注射前、注射后1h、注射后2h和注射后4h分別用活體熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)分布。相較于對(duì)照組正常未修飾的微囊泡，上述基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體更顯著地聚集于腫瘤部位，并且在腫瘤部位施加外源磁場(chǎng)時(shí)，該聚集效率可明顯增強(qiáng)，通過對(duì)總熒光信號(hào)分析，在注射后4h，對(duì)照組未修飾微囊泡在腫瘤部位的聚集效率為5.31％，單純修飾氧化鐵納米顆粒的微囊泡輔助外源磁場(chǎng)為13.23％，而靶向遞送載體輔助外源磁場(chǎng)為25.89％，證明這一基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體具備優(yōu)異的活體內(nèi)腫瘤靶向性。(圖9)

所述的腫瘤為宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、胃癌、腎癌、肺腺癌、腦瘤等高表達(dá)葉酸受體的惡性腫瘤。

實(shí)施例4:

一種載有化療藥物的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，其步驟如下：

1、條件培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補(bǔ)充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v) 抗生素，同時(shí)添加DSPE-PEG-Biotin(50μg/mL)和DSPE-PEG-Folate(5μg/mL)，4℃保存，獲得條件培養(yǎng)基。

2、將步驟1中獲得的條件培養(yǎng)基用于細(xì)胞的培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)約48h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80％左右時(shí)更換培養(yǎng)基，用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM，Hyclone)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，以促進(jìn)細(xì)胞釋放微囊泡，培養(yǎng)46-50h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于后續(xù)分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養(yǎng)上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標(biāo)記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數(shù)次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經(jīng)插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的微囊泡載體。

4、將步驟3中收集的腫瘤靶向遞送載體(100μg，50μL)與不同濃度(0-60μg/mL)的水溶性抗腫瘤藥物，如阿霉素(Doxorubicin，DOX)(Actavis Italy S.p.A.)混合，添加電穿孔緩沖液，將體系配成250μL，利用電穿孔方式(條件為250V和350μF，Bio-Rad Gene PulserXcell^TM Electroporation System)載入抗腫瘤藥物，在37℃溫箱中孵育30min，在外源性磁場(chǎng)作用下分離腫瘤靶向遞送載體，去除游離藥物，用PBS重懸并洗脫數(shù)次(4－8次)，最后將沉淀用PBS重懸。利用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析不同藥物濃度對(duì)藥物載入效率的影響，最終確定40μg/mL的DOX濃度為最適宜的選擇，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。獲得載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。(圖10)

5、將步驟4中制備的一種載有化療藥物的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體在37℃條件下儲(chǔ)存7天，隨后用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析其載入的DOX的熒光信號(hào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于新制備的一種載有化療藥物的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，該條件下長(zhǎng)達(dá)7天的儲(chǔ)存未明顯改變其內(nèi)的DOX信號(hào)，表明本方法制備的一種載有化療藥物的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體具備極好的穩(wěn)定性(該載體的結(jié)構(gòu)示意圖見圖5)。該載體外膜是類似于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結(jié)合，包繞于載體外側(cè)；載體內(nèi)部為來源于母細(xì)胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、micro-RNA和蛋白質(zhì)；此外，載體內(nèi)部還裝載有抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)。

實(shí)施例5：

一種載有化療藥物的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，其步驟如下：

1、配置條件培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1％(v/v)抗生素，同時(shí)添加DSPE-PEG-Biotin(50μg/mL)和DSPE-PEG-Folate(5μg/mL)，4℃保存，獲得條件培養(yǎng)基。

2、將步驟1中獲得的條件培養(yǎng)基用于細(xì)胞的培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)約48h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80％左右時(shí)更換培養(yǎng)基，用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM，Hyclone)繼續(xù)培養(yǎng)48h，以促進(jìn)細(xì)胞釋放微囊泡，收集培養(yǎng)上清，用于后續(xù)分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養(yǎng)上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標(biāo)記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數(shù)次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經(jīng)插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的微囊泡載體。

4、將步驟3中收集的腫瘤靶向遞送載體(100μg，50μL)與水溶性抗腫瘤藥物，如阿霉素(Doxorubicin，DOX)(Actavis Italy S.p.A.)(40μg/mL)混合，添加電穿孔緩沖液，將體系配成250μL，利用電穿孔方式(條件為250V和350μF，Bio-Rad Gene PulserXcell^TMElectroporation System)載入抗腫瘤藥物，在37℃溫箱中孵育30min，在外源性磁場(chǎng)作用下分離腫瘤靶向遞送載體，去除游離藥物，用PBS重懸并洗脫數(shù)次(4－8次)，最后將沉淀用PBS重懸。獲得載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

5、將游離DOX、載有DOX的正常未修飾的微囊泡(20μg/mL)、載有DOX的單純氧化鐵顆粒標(biāo)記的微囊泡(20μg/mL)和步驟4中制備的一種載有化療藥物DOX的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(20μg/mL)與腫瘤細(xì)胞HeLa共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)的起始一小時(shí)，在培養(yǎng)皿底部放置一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)，經(jīng)過4h的共培養(yǎng)后用PBS洗滌3次，再用4％多聚甲醛固定10min，最后對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色，隨后在熒光顯微鏡下觀察不同組內(nèi)細(xì)胞中DOX的熒光信號(hào)密度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)步驟4中制備的一種載有化療藥物DOX的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體被細(xì)胞攝取然后釋放DOX的效率最高，表明其良好的腫瘤靶向性。

6、步驟4中制備的一種載有化療藥物DOX的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(20μg/mL)與腫瘤細(xì)胞HeLa進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察在共培養(yǎng)體系中添加游離葉酸或不添加游離葉酸，以及在培養(yǎng)初期輔助外源性磁場(chǎng)或不適用外源性磁場(chǎng)的條件下，該遞送載體被腫瘤細(xì)胞攝取的效率變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)該腫瘤靶向遞送載體的攝取效率受到培養(yǎng)基中游離葉酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，同時(shí)外源性磁場(chǎng)的輔助作用又可削弱培養(yǎng)基中游離葉酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，促進(jìn)細(xì)胞攝取該遞送載體。

實(shí)施例6：

一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體在制備治療或預(yù)防宮頸癌的局部化療藥物中的應(yīng)用，其步驟如下：

1、將Hela細(xì)胞(200μL溶液含10⁷個(gè)腫瘤細(xì)胞)種植于裸鼠(體重約18～20g)皮下，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，模型構(gòu)建成功后每三天記錄腫瘤體積(寬*寬*長(zhǎng)/2)，待腫瘤體積達(dá)到150mm³后將裸鼠隨機(jī)均分為7組，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2、將7組裸鼠分別用尾靜脈注射PBS(100μL；G1)，尾靜脈注射游離DOX(100μL、5mg/kg；G2)，尾靜脈注射正常未修飾微囊泡(100μL；G3)，尾靜脈注射載有DOX的正常未修飾微囊泡(100μL；G4)，尾靜脈注射單純氧化鐵顆粒修飾的載藥微囊泡加外源磁場(chǎng)(100μL；G5)，尾靜脈注射葉酸和氧化鐵納米顆粒雙修飾的載藥微囊泡(100μL；G6)，尾靜脈注射葉酸和氧化鐵顆粒雙修飾的載藥微囊泡加外源性磁場(chǎng)(100μL；G7)這7種治療方式處理，以DOX的用量為5mg/kg確定每組載體的具體用量，藥物注射每3天一次，共持續(xù)4次，同時(shí)每3天記錄裸鼠體重和腫瘤體積(寬*寬*長(zhǎng)/2)。

3、最后，將裸鼠麻醉處死，獲取腫瘤組織，拍照并稱量腫瘤重量，并對(duì)獲取的腫瘤組織進(jìn)行組織學(xué)分析(TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè))。

4、相較于其他組，上述載藥后腫瘤靶向遞送載體輔助外援磁場(chǎng)發(fā)揮了最優(yōu)異的抗腫瘤生長(zhǎng)效果，幾乎完全抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)裸鼠體重?zé)o明顯影響。腫瘤組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)上述載藥后腫瘤靶向遞送載體有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖。(圖11)

實(shí)施例7：

一種載有治療基因的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，其步驟如下：

1、配置條件培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補(bǔ)充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v)抗生素，同時(shí)添加DSPE-PEG-Biotin(50μg/mL)和DSPE-PEG-Folate(5μg/mL)，4℃保存，獲得條件培養(yǎng)基。

2、將步驟1中獲得的條件培養(yǎng)基用于細(xì)胞的培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)約48h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80％左右時(shí)更換培養(yǎng)基，用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM，Hyclone)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，以促進(jìn)細(xì)胞釋放微囊泡，培養(yǎng)46-50h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于后續(xù)分離獲得功能化微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養(yǎng)上清中添加400μL SA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標(biāo)記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數(shù)次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經(jīng)插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的微囊泡載體。

4、將步驟3中收集的腫瘤靶向遞送載體(100μg)與針對(duì)survivin的抗腫瘤siRNA(500nM)混合，添加電穿孔緩沖液，將體系配成250μL，利用電穿孔方式(條件為250V和350μF，Bio-Rad Gene PulserXcellTM Electroporation System)載入抗腫瘤治療基因，在37℃溫箱中孵育30min，在外源性磁場(chǎng)作用下分離腫瘤靶向遞送載體，去除游離治療基因，用PBS重懸并洗脫數(shù)次(4－8次)。獲得載有針對(duì)survivin的抗腫瘤siRNA的基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存(該載體結(jié)構(gòu)示意圖見圖6)。該載體外膜是類似于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結(jié)合，包繞于載體外側(cè)；載體內(nèi)部為來源于母細(xì)胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、micro-RNA和蛋白質(zhì)；此外，載體內(nèi)部還裝載有具備抗腫瘤作用的siRNA。

實(shí)施例8：

一種基于細(xì)胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體在制備治療或預(yù)防宮頸癌的局部基因治療藥物中的應(yīng)用，其步驟如下：

1、將Hela細(xì)胞(200μL溶液含10⁷個(gè)腫瘤細(xì)胞)種植于裸鼠(體重約18～20g)皮下，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，模型構(gòu)建成功后每三天記錄腫瘤體積(寬*寬*長(zhǎng)/2)，待腫瘤體積達(dá)到150mm³后將裸鼠隨機(jī)均分為7組，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2、將7組裸鼠分別用尾靜脈注射PBS(100μL，n＝6)，尾靜脈注射游離針對(duì)survivin的抗腫瘤siRNA(100μL，20μM，n＝6)，尾靜脈注射正常未修飾微囊泡(100μL，1mg/mL，n＝6)，尾靜脈注射載有針對(duì)survivin的抗腫瘤siRNA的正常未修飾微囊泡(100μL，1mg/mL，n＝6)，尾靜脈注射單純氧化鐵顆粒修飾的載有針對(duì)survivin的抗腫瘤siRNA微囊泡加外源磁場(chǎng)(100μL，1mg/mL，n＝6)，尾靜脈注射葉酸和氧化鐵納米顆粒雙修飾的載有針對(duì)survivin的抗腫瘤siRNA微囊泡(100μL，1mg/mL，n＝6)，尾靜脈注射葉酸和氧化鐵顆粒雙修飾的載藥微囊泡加外源性磁場(chǎng)(100μL，1mg/mL，n＝6)這7種治療方式處理，藥物注射每3天一次，共持續(xù)4次，同時(shí)每3天記錄裸鼠體重和腫瘤體積(寬*寬*長(zhǎng)/2)。

3、最后，將裸鼠麻醉處死，獲取腫瘤組織，拍照并稱量腫瘤重量，并對(duì)獲取的腫瘤組織進(jìn)行組織學(xué)分析(TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)，survivin、Ki-67等指標(biāo)表達(dá)檢測(cè))。

4、相較于其他組，上述載藥后腫瘤靶向遞送載體輔助外援磁場(chǎng)發(fā)揮了最優(yōu)異的抗腫瘤生長(zhǎng)效果，幾乎完全抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)裸鼠體重?zé)o明顯影響。腫瘤組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)上述載藥后腫瘤靶向遞送載體有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖。