本發(fā)明涉及聚合物微球的制備方法，特別涉及一種以氫氧化鐵膠體為乳液法水相制備聚合物微球的方法。

背景技術(shù)：

在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域中，生物可降解聚合物微球具有藥物靶向運(yùn)輸、藥物緩釋以及模擬細(xì)胞外基質(zhì)以刺激細(xì)胞響應(yīng)的功能。乳液法是最常用于制備聚合物微球的方法，傳統(tǒng)乳液法制備生物醫(yī)用微球，總是需要在外水相中加入一定量的表面活性劑以穩(wěn)定油相乳液滴，如聚乙烯醇(Biomaterials, 2002, 23, 1649-1656)、甲基纖維素(Journal of Biomedical Materials Research, 1992, 26, 467-479)等。但是有研究表明殘留在微球上的表面活性劑會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不利的影響，比如會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)或者致癌(Advanced Drug Delivery Reviews, 2008, 60, 939-954)。有研究表明，采用Pickering乳液法制備的生物醫(yī)用聚合物微球可避免有毒表面活性劑所帶來的不利影響。

Pickering乳液法，即采用固體顆粒代替表面活性劑作為乳液的穩(wěn)定劑(Progress in Chemistry, 2009, 21, 1418-1426)。目前常用于Pickering乳液中的固體顆粒穩(wěn)定劑主要是納米級(jí)或者微米級(jí)顆粒，常用在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的Pickering乳液固體穩(wěn)定劑有羥基磷灰石(Acta Biomaterialia, 2011, 7, 821-828)、SiO₂(Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2012, 91, 97-105)、CaCO₃(International Journal of Pharmaceutics, 2008, 351, 104-112)等。采用該方法制備的聚合物微球，微球表面會(huì)摻有部分固體顆粒穩(wěn)定劑。

Fe元素是人體所必需的微量元素之一，是骨骼和牙齒中重要的微量元素，對(duì)骨組織具有一定的調(diào)節(jié)作用(Physical Review B, 2002, 66, 648-679)。研究表明摻雜Fe元素的骨水泥具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)能力(Acta Biomaterialia, 2010, 6, 607-616)。采用氫氧化鐵膠體作為Pickering乳液法的水相時(shí)，其中的Fe(OH)₃膠體納米粒子作為Pickering乳液法的固體穩(wěn)定劑，制備出聚合物微球。同時(shí)，F(xiàn)e(OH)₃膠體納米粒子可摻在聚合物微球表面，從而使微球表面含有微量的Fe元素，與傳統(tǒng)乳液法所制備的聚合物微球表面成分有所差異。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種以氫氧化鐵膠體為乳液法水相制備聚合物微球的方法。該方法可使聚合物微球表面摻入少量的鐵元素成分，同時(shí)這種方法制備得到的微球具有良好的細(xì)胞相容性，可以促使小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附和增殖。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種以氫氧化鐵為乳液法水相制備聚合物微球的方法，包括如下步驟：

（1）將聚合物材料添加到有機(jī)溶劑中，攪拌，得到聚合物油相溶液；

（2）將FeCl₃溶液加入到沸騰的去離子水中，持續(xù)加熱，水解反應(yīng)制備得到氫氧化鐵膠體溶液；

（3）將聚合物油相溶液分散到氫氧化鐵膠體溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌水包油的單乳液，揮發(fā)除去聚合物油相溶液中的有機(jī)溶劑，得到固化的聚合物微球，去離子水洗滌，干燥，得到所述聚合物微球。

進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述聚合物材料包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、聚左旋乳酸（PLLA）或聚己內(nèi)酯（PCL）。

進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述有機(jī)溶劑包括二氯甲烷。

更進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物的分子量M_w=30～100 kDa；所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物中，乳酸單體的比例為50%~90%。

更進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述聚左旋乳酸的分子量M_w=30～100 kDa。

更進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述聚己內(nèi)酯的分子量M_w=50～150 kDa。

更進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物與二氯甲烷的質(zhì)量體積比為1：5～20g/ml。

更進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述聚左旋乳酸與二氯甲烷的質(zhì)量體積比為1：5~25g/ml，優(yōu)選為1：10~25g/ml。

更進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述聚己內(nèi)酯與二氯甲烷的質(zhì)量體積比為1：5~25g/ml，優(yōu)選為1：10~25g/ml。

進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述FeCl₃溶液中，F(xiàn)eCl₃的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是1%~10%。

進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述FeCl₃溶液與沸騰的去離子水的體積比為1：3~50。

進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述持續(xù)加熱的時(shí)間為0.5~3 min。

進(jìn)一步地，步驟（2）中，持續(xù)加熱的溫度保持在80℃以上。

進(jìn)一步地，步驟（3）中，所述聚合物油相溶液與氫氧化鐵膠體溶液的體積比為1：4~100。

進(jìn)一步地，步驟（4）中，所述持續(xù)攪拌的轉(zhuǎn)速為200～500 rpm，時(shí)間為2～24 h。

本發(fā)明采用Pickering乳液法原理，將氫氧化鐵膠體粒子作為Pickering乳液法的固體乳化劑，與聚合物的二氯甲烷溶液在攪拌下形成水包油乳液；在水包油乳液中，氫氧化鐵膠體粒子存在水相與油相液滴的界面上，不斷攪拌使二氯甲烷揮發(fā)以使聚合物微球固化，氫氧化鐵膠體粒子在微球固化過程中會(huì)留在微球表面，于是形成了表面含鐵元素成分的聚合物微球。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

（1）本發(fā)明方法制備的聚合物微球表面含有鐵元素成分，且具有良好的細(xì)胞相容性；相對(duì)傳統(tǒng)的聚乙烯醇(PVA)乳液法制備的微球，含有鐵元素成分的聚合物微球?qū)π∈蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1制備的水相中Fe(OH)₃膠體納米粒子的粒徑分布圖；

圖2為實(shí)施例1制備的Fe(OH)₃-PLGA微球的整體形貌圖；

圖3為實(shí)施例1制備的Fe(OH)₃-PLGA微球的表面XPS測(cè)試結(jié)果圖；

圖4為實(shí)施例1制備的Fe(OH)₃-PLGA微球與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)5天后的活死細(xì)胞染色圖；

圖5為實(shí)施例2制備的PVA-PLGA微球的整體形貌圖；

圖6為實(shí)施例1、2制備Fe(OH)₃-PLGA微球和PVA-PLGA微球的細(xì)胞增殖情況柱狀圖；

圖7為實(shí)施例3中制備的Fe(OH)₃-PLLA微球的整體形貌圖；

圖8為實(shí)施例4中制備的Fe(OH)₃-PCL微球的整體形貌圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

（1）稱取0.5 g PLGA（LA/GA =85/15, M_w=100 kDa）加入到5 ml 二氯甲烷中，在300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得到PLGA的油相溶液；

（2）取60 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的FeCl₃溶液加入到240 ml 沸騰的去離子水中，持續(xù)加熱2 min，制成氫氧化鐵膠體溶液，作為乳液的水相；

圖1為水相中Fe(OH)₃膠體納米粒子的粒徑分布圖，由圖1可知，大部分Fe(OH)₃膠體納米粒子粒徑分布于0~200nm之間，平均粒徑為38.05nm；

（3）在轉(zhuǎn)速為300 rpm攪拌條件下，將PLGA的油相溶液逐滴加入到氫氧化鐵膠體溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌單乳液5 h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到表面含鐵元素成分的PLGA微球；收集固化的PLGA微球，用去離子水洗滌3遍后，冷凍干燥，標(biāo)記為Fe(OH)₃-PLGA微球。

圖2為制備的Fe(OH)₃-PLGA微球的整體形貌圖，由圖2可知，制備得到的Fe(OH)₃-PLGA微球表面光滑。

圖3為制備的Fe(OH)₃-PLGA微球的表面XPS測(cè)試結(jié)果圖，測(cè)試結(jié)果顯示，在結(jié)合能為708.5eV處有屬于Fe元素2p軌道電子的峰出現(xiàn)，表明在微球表面含有鐵元素。

圖4為制備的Fe(OH)₃-PLGA微球與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)5天后的活死細(xì)胞染色圖，由圖4可知，在第5天的時(shí)候，微球表面黏附了大量的細(xì)胞，并且沒有發(fā)現(xiàn)死細(xì)胞，說明該微球具有良好的細(xì)胞相容性，對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有毒害作用。

實(shí)施例2

（1）稱取0.5 g PLGA（LA/GA =85/15, M_w=100 kDa）加入到5 ml 二氯甲烷中，在300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得到PLGA油相溶液；

（2）稱取1.50 g PVA加入到250 ml 90℃的去離子水中，持續(xù)加熱60min，使PVA充分溶解，冷卻后得到PVA的水相溶液；

（3）在轉(zhuǎn)速為300 rpm攪拌條件下，將PLGA的油相溶液逐滴加入到PVA水相溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌單乳液5 h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到表面不含鐵元素的PLGA微球；收集固化的PLGA微球，用去離子水洗滌3遍后，冷凍干燥，標(biāo)記為PVA-PLGA微球。

圖5為制備的PVA-PLGA微球整體形貌圖，由圖5可知，傳統(tǒng)的PVA乳液法制備得到的PVA-PLGA微球的表面光滑。

圖6為實(shí)施例1、2制備Fe(OH)₃-PLGA微球和PVA-PLGA微球的細(xì)胞增殖情況圖，由圖6可知，兩種方法制備的PLGA微球上，細(xì)胞均能呈現(xiàn)良好的增殖情況，且在相同時(shí)間點(diǎn)上，F(xiàn)e(OH)₃-PLGA微球的增殖情況比PVA-PLGA微球更好，具有顯著性差異。

實(shí)施例3

（1）稱取0.5 g PLLA（M_w=50 kDa）加入到5 ml 二氯甲烷中，在300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得到PLLA的油相溶液；

（2）取60 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的FeCl₃溶液加入到240 ml 沸騰的去離子水中，持續(xù)加熱2 min，制成氫氧化鐵膠體溶液，作為乳液的水相；

（3）在轉(zhuǎn)速為300 rpm攪拌條件下，將PLLA的油相溶液逐滴加入到氫氧化鐵膠體溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌單乳液5 h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到表面含鐵元素的PLLA微球；收集固化的PLLA微球，用去離子水洗滌3遍后，冷凍干燥，標(biāo)記為Fe(OH)₃-PLLA微球。

圖7為制備的Fe(OH)₃-PLLA微球的整體形貌圖，圖7顯示成功制備微Fe(OH)₃-PLLA微球。

制得的Fe(OH)₃-PLLA微球表面含有鐵元素成分，且具有良好的細(xì)胞相容性，對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有毒害作用。

實(shí)施例4

（1）稱取0.5 g PCL（M_w=80 kDa）加入到5 ml 二氯甲烷中，在300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得到PCL的油相溶液；

（2）取60 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的FeCl₃溶液加入到240 ml 沸騰的去離子水中，持續(xù)加熱2 min，制成氫氧化鐵膠體溶液，作為乳液的水相；

（3）在轉(zhuǎn)速為300 rpm攪拌條件下，將PCL的油相溶液逐滴加入到氫氧化鐵膠體溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌單乳液5 h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到表面含鐵元素的PCL微球；收集固化的PCL微球，用去離子水洗滌3遍后，冷凍干燥，標(biāo)記為Fe(OH)₃-PCL微球。

圖8為制備的Fe(OH)₃-PCL微球的整體形貌圖，圖8顯示成功制備出Fe(OH)₃-PCL微球。

制得的Fe(OH)₃-PCL微球表面含有鐵元素成分，且具有良好的細(xì)胞相容性，對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有毒害作用。

實(shí)施例5

（1）稱取0.25g PLGA（LA/GA =90/10, M_w=30 kDa）加入到5 ml 二氯甲烷中，在300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得到PLGA的油相溶液；

（2）取5 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FeCl₃溶液加入到15 ml 沸騰的去離子水中，持續(xù)加熱0.5 min，制成氫氧化鐵膠體溶液，作為乳液的水相；

（3）在轉(zhuǎn)速為300 rpm攪拌條件下，將PLGA的油相溶液逐滴加入到氫氧化鐵膠體溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌單乳液24 h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到表面含鐵元素成分的PLGA微球；收集固化的PLGA微球，用去離子水洗滌3遍后，冷凍干燥，標(biāo)記為Fe(OH)₃-PLGA微球。

制得的Fe(OH)₃-PLGA微球表面含有鐵元素成分，且具有良好的細(xì)胞相容性，對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有毒害作用。

實(shí)施例6

（1）稱取1g PLGA（LA/GA =50/50, M_w=70 kDa）加入到5 ml 二氯甲烷中，在300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得到PLGA的油相溶液；

（2）取5 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FeCl₃溶液加入到250 ml 沸騰的去離子水中，持續(xù)加熱0.5 min，制成氫氧化鐵膠體溶液，作為乳液的水相；

（3）在轉(zhuǎn)速為500 rpm攪拌條件下，將PLGA的油相溶液逐滴加入到氫氧化鐵膠體溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌單乳液2 h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到表面含鐵元素成分的PLGA微球；收集固化的PLGA微球，用去離子水洗滌3遍后，冷凍干燥，標(biāo)記為Fe(OH)₃-PLGA微球。

制得的Fe(OH)₃-PLGA微球表面含有鐵元素成分，且具有良好的細(xì)胞相容性，對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有毒害作用。

實(shí)施例7

（1）稱取1g PLLA（M_w=30 kDa）加入到5 ml 二氯甲烷中，在300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得到PLLA的油相溶液；

（2）取100 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的FeCl₃溶液加入到400 ml 沸騰的去離子水中，持續(xù)加熱3 min，制成氫氧化鐵膠體溶液，作為乳液的水相；

（3）在轉(zhuǎn)速為500 rpm攪拌條件下，將PLLA的油相溶液逐滴加入到氫氧化鐵膠體溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌單乳液5 h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到表面含鐵元素的PLLA微球；收集固化的PLLA微球，用去離子水洗滌3遍后，冷凍干燥，標(biāo)記為Fe(OH)₃-PLLA微球。

制得的Fe(OH)₃-PLLA微球表面含有鐵元素成分，且具有良好的細(xì)胞相容性，對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有毒害作用。

實(shí)施例8

（1）稱取0.2 g PLLA（M_w=100 kDa）加入到5 ml 二氯甲烷中，在300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得到PLLA的油相溶液；

（2）取60 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的FeCl₃溶液加入到240 ml 沸騰的去離子水中，持續(xù)加熱2 min，制成氫氧化鐵膠體溶液，作為乳液的水相；

（3）在轉(zhuǎn)速為200 rpm攪拌條件下，將PLLA的油相溶液逐滴加入到氫氧化鐵膠體溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌單乳液5 h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到表面含鐵元素的PLLA微球；收集固化的PLLA微球，用去離子水洗滌3遍后，冷凍干燥，標(biāo)記為Fe(OH)₃-PLLA微球。

制得的Fe(OH)₃-PLLA微球表面含有鐵元素成分，且具有良好的細(xì)胞相容性，對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有毒害作用。

實(shí)施例9

（1）稱取1 g PCL（M_w=50 kDa）加入到5 ml 二氯甲烷中，在300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得到PCL的油相溶液；

（2）取60 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的FeCl₃溶液加入到240 ml 沸騰的去離子水中，持續(xù)加熱2 min，制成氫氧化鐵膠體溶液，作為乳液的水相；

（3）在轉(zhuǎn)速為300 rpm攪拌條件下，將PCL的油相溶液逐滴加入到氫氧化鐵膠體溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌單乳液5 h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到表面含鐵元素的PCL微球；收集固化的PCL微球，用去離子水洗滌3遍后，冷凍干燥，標(biāo)記為Fe(OH)₃-PCL微球。

制得的Fe(OH)₃-PCL微球表面含有鐵元素成分，且具有良好的細(xì)胞相容性，對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有毒害作用。

實(shí)施例10

（1）稱取0.2 g PCL（M_w=150 kDa）加入到5 ml 二氯甲烷中，在300 rpm轉(zhuǎn)速攪拌30 min，得到PCL的油相溶液；

（2）取60 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的FeCl₃溶液加入到240 ml 沸騰的去離子水中，持續(xù)加熱2 min，制成氫氧化鐵膠體溶液，作為乳液的水相；

（3）在轉(zhuǎn)速為300 rpm攪拌條件下，將PCL的油相溶液逐滴加入到氫氧化鐵膠體溶液中，得到水包油的單乳液；

（4）持續(xù)攪拌單乳液5 h，揮發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到表面含鐵元素的PCL微球；收集固化的PCL微球，用去離子水洗滌3遍后，冷凍干燥，標(biāo)記為Fe(OH)₃-PCL微球。

制得的Fe(OH)₃-PCL微球表面含有鐵元素成分，且具有良好的細(xì)胞相容性，對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有毒害作用。