本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性功能的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多藥耐藥性(MDR)是導(dǎo)致臨床上腫瘤化療失敗的主要原因，而三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒(ABC)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控的藥物外排是MDR機(jī)制中最普遍的一種。P-gp糖蛋白是膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中最重要的成員之一，P-gp蛋白能從ATP水解中獲得能量，從而將阿霉素、紫杉醇等小分子藥物排除到腫瘤細(xì)胞外，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中小分子藥物富集濃度大大降低，導(dǎo)致腫瘤化療失敗(Nano Today 2011，6，176-185；Curr.Opin.Struct.Biol.2000，10，649-655)。為解決上述問(wèn)題，前人將P-gp蛋白抑制劑(如異搏定、奎寧、環(huán)孢霉素A等)和小分子抗腫瘤藥物混合使用，以逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性(Biochem.Pharmacol.1989，38，1727-1736)。然而，由于小分子P-gp抑制劑和抗腫瘤藥物普遍存在著生物相容性差、體內(nèi)停留時(shí)間短和對(duì)正常組織的毒副作用等缺點(diǎn)，同時(shí)由于小分子P-gp抑制劑和抗腫瘤藥物之間物理化學(xué)性質(zhì)不同，導(dǎo)致兩者的藥代動(dòng)力學(xué)存在很大差異，使P-gp抑制劑和抗腫瘤藥物不能同時(shí)到達(dá)腫瘤部位，難以達(dá)到協(xié)同治療多藥耐藥性腫瘤的目的。

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，在癌癥的化療中，納米尺度物質(zhì)常常被用作藥物載體，將藥物有效地輸送到腫瘤部位。若將小分子抗腫瘤藥物和P-gp蛋白抑制劑負(fù)載在同一納米載體內(nèi)，同時(shí)輸送到腫瘤細(xì)胞，是一種有效克服腫瘤多藥耐藥性的方法，這些納米載體包括納米粒子(J.Control.Release 2009，136，21-29；Biomaterials 2010，31，358-365)、脂質(zhì)體(Drug Deliv.2009，16，261-267；Front Pharmacol.2014，5，1-22)和聚合物膠束(Science 1998，281，1312-1316；Biomaterials 2011，32，1738-1747)。使用納米載體共輸送小分子抗腫瘤藥物和P-gp蛋白抑制劑，不僅能夠提高藥物在腫瘤部位的富集濃度(Eur.J.Pharm.Biopharm.2010，75，341-353)，同時(shí)也可抑制P-gp蛋白的活性(Cancer Treat Rev.2008，34，592-602；Int.J.Nanomedicine 2012，7，187-197)。與小分子抗腫瘤藥物和P-gp蛋白抑制劑簡(jiǎn)單物理混合使用相比，納米載體輸送方法的治療效果有了較大提高。但仍存在如下諸多問(wèn)題，(1)在到達(dá)腫瘤部位之前，小分子抗腫瘤藥物和蛋白抑制劑可能會(huì)發(fā)生泄露(Eur.J.Biochem.1995，228，1020-1029)，難以確保兩者同時(shí)富集到腫瘤部位；(2)大部分載體的載藥量非常低；(3)小分子抗腫瘤藥物和蛋白抑制劑由于物理化學(xué)性質(zhì)的不同，兩者的藥代動(dòng)力學(xué)存在很大的差異；(4)納米載體本身沒(méi)有治療作用，且在代謝過(guò)程中可能會(huì)引起器官毒性和炎癥。因此，通過(guò)連接劑將小分子抗腫瘤藥物和P-gp蛋白抑制劑連接起來(lái)構(gòu)筑抗腫瘤納米藥物能夠有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性。

在CN201210475046“一種具有P糖蛋白抑制功能的抗腫瘤前藥”公開(kāi)了由抗腫瘤藥物與具有P糖蛋白抑制功能的聚乙二醇琥珀酸酯通過(guò)連接器共價(jià)連接構(gòu)成的兩親性物質(zhì)，也同樣通過(guò)連接劑將小分子抗腫瘤藥物和P-gp蛋白抑制劑連接起來(lái)構(gòu)筑抗耐藥腫瘤納米藥物；然而聚乙二醇琥珀酸酯是一種大分子聚合物，僅具有P-gp蛋白抑制功能，且作用機(jī)制并不明確，同時(shí)需要借助載體(如：聚乙二醇)才可得到穩(wěn)定且分散均勻的納米顆粒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的是提供一種具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性功能的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥，以解決大多數(shù)抗腫瘤小分子藥物普遍存在的多藥耐藥性問(wèn)題，同時(shí)解決現(xiàn)有技術(shù)中逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性都需采用納米尺寸物質(zhì)作為載體，而這些納米載體將藥物送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)后，其自身需要通過(guò)腎臟等器官排出體外，有可能引起腎臟等器官發(fā)生炎癥或引起一些其它病癥等技術(shù)性問(wèn)題。

本發(fā)明的第二目的是提供一種具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性功能的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥的制備方法，以解決大多數(shù)抗腫瘤小分子藥物普遍存在的多藥耐藥性問(wèn)題，同時(shí)解決現(xiàn)有技術(shù)中逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性都需采用納米尺寸物質(zhì)作為載體，而這些納米載體將藥物送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)后，其自身需要通過(guò)腎臟等器官排出體外，有可能引起腎臟等器官發(fā)生炎癥或引起一些其它病癥等技術(shù)性問(wèn)題。

本發(fā)明的第三目的是上述的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥應(yīng)用于腫瘤和耐藥性腫瘤的治療，以解決大多數(shù)抗腫瘤小分子藥物普遍存在的多藥耐藥性問(wèn)題，同時(shí)解決現(xiàn)有技術(shù)中逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性都需采用納米尺寸物質(zhì)作為載體，而這些納米載體再將藥物送到癌細(xì)胞內(nèi)后，其自身需要通過(guò)腎臟等器官排出體外，有可能引起腎臟等器官發(fā)生炎癥或引起一些其它病癥等技術(shù)性問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性功能的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥，包括由抗腫瘤藥物與P-gp蛋白抑制劑奎寧通過(guò)連接劑共價(jià)連接而成的兩親性綴合物，所述兩親性綴合物在水中自組裝得到所述兩親性綴合物抗腫瘤納米藥；所述的抗腫瘤藥物為伊立替康、拓?fù)涮婵?、阿糖胞苷、吉西他濱、艾沙托立賓、曲沙他濱、匹杉瓊、喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿、7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿、紫杉醇、多西紫杉醇或阿霉素中的一種。

優(yōu)選為，所述的連接劑含有敏感鍵且至少含有兩個(gè)分別用于共價(jià)連接所述抗腫瘤藥物和所述P-gp蛋白抑制劑奎寧的反應(yīng)官能團(tuán)，所述的敏感鍵是在腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下易斷裂的化學(xué)鍵。

優(yōu)選為，所述的敏感鍵為二硫鍵、二硒鍵、酯鍵或酰腙鍵其中的一種。

優(yōu)選為，所述的連接劑為3，3′-二硫代二丙酸，4，4′-二硫代二丁酸、3，3′-二硒代二丙酸，丁二酸酐、馬來(lái)酸酐、二乙醇酸酐或2，2′-二硫二乙醇其中的一種。

優(yōu)選為，所述的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥的粒徑為小于200nm。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述的具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性功能的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)所述的P-gp蛋白抑制劑奎寧與所述的連接劑反應(yīng)，得到一中間體；

(2)將所述的中間體與所述的抗腫瘤藥物反應(yīng)，得到所述的兩親性綴合物；

(3)將所述的兩親性綴合物溶解在與水互溶的有機(jī)溶劑中，然后滴入緩慢攪拌的水中，最后除去有機(jī)溶劑，即得到所述的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥水溶液。

優(yōu)選為，所述的有機(jī)溶劑為N，，N′-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、四氫呋喃或乙腈其中的一種。

在本發(fā)明的一具體實(shí)施方式中，由喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿、7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿、紫杉醇、多西紫杉醇或阿霉素制備兩親性綴合物抗腫瘤納米藥的過(guò)程中，步驟(2)還包括所述的中間體與所述的抗腫瘤藥物反應(yīng)后，加入質(zhì)子化試劑，得到所述的兩親性綴合物。

優(yōu)選為，所述的質(zhì)子化試劑為鹽酸或硫酸。

本發(fā)明的P-gp蛋白抑制劑奎寧為含羥基的疏水性蛋白抑制劑，同時(shí)將抗腫瘤藥物分為四類(lèi)：含羥基的親水性抗腫瘤藥，如伊立替康、拓?fù)涮婵?、阿糖胞苷、吉西他濱、艾沙托立賓、曲沙他濱；含氨基的親水性抗腫瘤藥，如匹杉瓊；含羥基的疏水性抗腫瘤藥，如喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿、7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿、紫杉醇、多西紫杉醇；含氨基的疏水性抗腫瘤藥，如阿霉素。本發(fā)明在制備方法上存在多種選擇，具體為：中間體的制備有以下三種方法，一、在室溫下，將奎寧加入于溶有4，4′-二硫代二丁酸、縮合劑和催化劑的有機(jī)溶劑中攪拌反應(yīng)，得到一端為羧基的中間體；二、在75℃下，將奎寧加入于溶有丁二酸酐、馬來(lái)酸酐或二乙醇酸酐、催化劑的有機(jī)溶劑中攪拌反應(yīng)，得到一端為羧基的中間體；三、在室溫下，將奎寧加入于溶有三光氣、縛酸劑的有機(jī)溶劑中攪拌反應(yīng)，然后在室溫下，再加入2，2′-二硫二乙醇反應(yīng)，得到一端為羥基的中間體。步驟(2)兩親性/非兩親性綴合物的制備有以下幾種：一、在室溫下，將末端為羧基的中間體與含羥基的親/疏水抗癌藥加入到有機(jī)溶劑中，再加入縮合劑和催化劑，攪拌反應(yīng)，得到兩親性綴合物/非兩親性綴合物；二、在室溫下，將末端為羥基的中間體加入到溶有三光氣、縛酸劑和催化劑的有機(jī)溶劑中反應(yīng)，然后在室溫下，加入含羥基的親/疏水性的抗癌藥反應(yīng)，得到兩親性綴合物//非兩親性綴合物；三、在室溫下，將末端含羥基的中間體加入到溶有對(duì)硝基苯基氯甲酸酯、三乙胺的有機(jī)溶劑中反應(yīng)，然后加入含氨基親/疏水性抗癌藥得到兩親性綴合物/非兩親性綴合物。

所述的縮合劑為N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的中的一種；所述的催化劑為4-二甲氨基吡啶(DMAP)；所述的縛酸劑選自4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三乙胺、N，N-二異丙基乙胺中的一種。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述的具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性功能的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥在治療腫瘤和耐藥性腫瘤上的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明的兩親性綴合物在水中可以自組裝形成納米顆粒，無(wú)需任何藥物輸送載體，就能共輸送蛋白抑制劑和抗腫瘤藥物，通過(guò)腫瘤組織的通透性增強(qiáng)與滯留效應(yīng)，該綴合物抗腫瘤納米藥可以更有效地進(jìn)入腫瘤多藥耐藥性細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用；當(dāng)兩親性綴合物抗腫瘤納米藥進(jìn)入腫瘤多藥耐藥性細(xì)胞后，在腫瘤微環(huán)境條件(酸性或還原性條件)下連接基團(tuán)發(fā)生斷裂，同時(shí)釋放出蛋白抑制劑和抗腫瘤藥物，蛋白抑制劑抑制P-gp蛋白的表達(dá)，防止抗腫瘤藥物被泵出到細(xì)胞外，從而提高腫瘤多藥耐藥性細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，達(dá)到逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的目的。

與CN201210475046“一種具有P糖蛋白抑制功能的抗腫瘤前藥”相比，本發(fā)明的P-gp蛋白抑制劑奎寧是小分子蛋白抑制劑，作用機(jī)制明確；且本發(fā)明的抗腫瘤藥物既包括親水性的抗癌藥又包括疏水性的抗癌藥，而現(xiàn)有技術(shù)的聚乙二醇琥珀酸酯是親水性的，所以要做成兩親性的物質(zhì)，只能跟疏水性的抗腫瘤藥物連接在一起，因此，本發(fā)明抗腫瘤藥物選擇范圍較廣，可根據(jù)病人病理情況進(jìn)行選擇；和本發(fā)明的抗腫瘤納米藥不需要借助于載體(例如：聚乙二醇)就可得到穩(wěn)定且分散均勻的納米顆粒，而現(xiàn)有技術(shù)要借助聚乙二醇高分子聚合物作為藥物載體才能在緩沖液中形成均勻分散的體系，得到納米藥物。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的中間體Qu-ss-COOH的反應(yīng)路線(xiàn)圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1的兩親性藥-藥綴合物Ir-ss-Qu的反應(yīng)路線(xiàn)圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1的中間體Qu-ss-COOH的¹H NMR譜圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1的中間體Qu-ss-COOH的¹³C NMR譜圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1的兩親性藥-藥綴合物Ir-ss-Qu的¹H NMR譜圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1的兩親性綴合物Ir-ss-Qu納米藥的動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1的兩親性綴合物Ir-ss-Qu納米藥的透射電子顯微鏡圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例1的兩親性綴合物Ir-ss-Qu納米藥的體外藥物釋放曲線(xiàn)圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例1的兩親性綴合物Ir-ss-Qu納米藥對(duì)多藥耐藥性腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用的效果示意圖；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例1的兩親性綴合物Ir-ss-Qu納米藥對(duì)P-gp蛋白抑制的效果示意圖；

圖11為本發(fā)明實(shí)施例1的兩親性藥-藥綴合物CPT-ss-Qu的合成路線(xiàn)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。在實(shí)際應(yīng)用中本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明做出的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：本發(fā)明的一種由奎寧Qu(式1)和伊立替康Ir(式2)制備的兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥

一、兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)中間體Qu-ss-COOH的合成

如圖1所示，在室溫下，分別向250mL干燥潔凈的圓底燒瓶中，加入4，4′-二硫代二丁酸(4.77g，20mmol)、二環(huán)己基碳二亞胺(2.27g，11mmol)、4-甲氨基吡啶(1.22g，10mmol)和100mL無(wú)水四氫呋喃，攪拌反應(yīng)30min后，然后將溶有奎寧(Qu，3.24g，10mmol)的50mL四氫呋喃溶液逐滴加入到上述反應(yīng)體系中，繼續(xù)反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去有機(jī)溶劑，得到粗產(chǎn)物，然后經(jīng)硅膠柱純化(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝20∶1，v/v)，收集完畢后，旋蒸除去溶劑，即得到白色固體Qu-ss-COOH(3.12g，產(chǎn)率：65.8％)，如式3所示。

如圖3所示，中間體Qu-ss-COOH的¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：10.62(s，1H)，8.70(d，J＝4Hz，1H)，8.01(d，J＝8Hz，1H)，7.46(d，J＝2Hz，1H)，7.38(dd，J＝2Hz，J＝2Hz，1H)，7.25(s，1H)，6.81(s，1H)，5.65(m，1H)，4.99(t，J＝28Hz，2H)，4.00(s，3H)，3.48(s，1H)，3.39(s，1H)，3.23(t，J＝24Hz，1H)，2.91(t，J＝24Hz，1H)，21.70(m，1H)，2.55(m，1H)，2.46(s，1H)，2.36(t，J＝16Hz，2H)，2.08(m，2H)，1.94(m，4H)，1.82(m，1H)，1.72(m，1H)，1.62(m，1H)。

如圖4所示，中間體Qu-ss-COOH的¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ(ppm)：177.55，171.57，158.89，147.04，144.48，142.59，139.67，131.64，126.44，122.89，117.94，116.16，101.17，72.18，58.01，56.44，55.27，42.86，38.41，37.74，34.01，32.48，27.53，26.37，25.12，23.76，22.01。

ESI-MS m/z(M+H⁺)calcd 545.2148，found 545.2158(M+H⁺)。

(2)兩親性藥-藥綴合物Ir-ss-Qu的合成

如圖2所示，在室溫下，向250mL干燥潔凈的圓底燒瓶中，分別加入中間體Qu-ss-COOH(2.32g，4.26mmol)、伊立替康(Ir，2.26g，3.85mmol)，二環(huán)己基碳二亞胺(0.79g，3.85mmol)、4-甲氨基吡啶(0.43g，3.5mmol)和100mL無(wú)水CH₂Cl₂，攪拌反應(yīng)24h后，過(guò)濾除去反應(yīng)體系中的不溶物，濃縮除去有機(jī)溶劑后，再將粗產(chǎn)物過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝20∶1，v/v)，收集完畢后，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得到淡黃色固體Ir-ss-Qu(3.8g，產(chǎn)率：69.7％)，如式4所示。

如圖5所示，兩親性藥-藥綴合物Ir-ss-Qu的¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：8.71(d，J＝4Hz，1H)，8.19(d，J＝12Hz，1H)，7.99(d，J＝8Hz，1H)，7.83(d，J＝4Hz，1H)，7.58(dd，J＝4Hz，J＝4Hz，1H)，7.42(d，J＝4Hz，1H)，7.35(d，J＝4Hz，J＝4Hz，1H)，7.32(d，J＝4Hz，1H)，7.15(s，1H)，6.48(d，J＝4Hz，1H)，5.82(m，1H)，5.67(d，J＝16Hz，1H)，5.40(d，J＝16Hz，1H)，5.23(d，J＝4Hz，2H)，5.01(m，2H)，4.40(dd，J＝16Hz，J＝12Hz，2H)，3.94(s，3H)，3.34(m，1H)，3.09(m，6H)，2.90(t，J＝24Hz，1H)，2.62(m，12H)，2.50(m，2H)，2.25(m，2H)，2.13(m，2H)，1.99(m，6H)，1.87(m，3H)，1.69(m，7H)，1.49(m，4H)，1.38(t，J＝16Hz，3H)，0.96(t，J＝16Hz，3H)。

兩親性藥-藥綴合物Ir-ss-Qu的¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ(ppm)：172.24，172.11，167.76，158.12，157.54，153.28，151.62，150.64，147.63，147.29，147.07，146.09，145.56，144.91，143.79，141.84，131.96，131.74，127.75，127.29，127.17，126.18，122.07，120.07，119.09，114.79，101.57，95.96，76.17，73.99，67.31，62.58，59.31，56.73，55.92，50.47，49.50，44.58，44.25，42.68，39.82，37.54，37.27，32.77，32.32，31.99，28.40，27.91，27.70，26.24，24.72，24.58，24.13，23.38，14.23，7.81。

ESI-MS m/z(M+H⁺)calcd1113.4849，found 1113.4860(M+H⁺)。

(3)兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥的制備

取5mg兩親性藥-藥綴合物Ir-ss-Qu溶解在1mL DMSO中，室溫?cái)嚢枞芙?min后，將上述溶液緩慢滴加到3mL劇烈攪拌的超純水中，滴加完后，繼續(xù)攪拌30min，然后將納米藥物溶液轉(zhuǎn)移到透析袋(MWCO＝1,000g mol^-1)中，并用去離子水透析24h，每3h換一次去離子水，將DMSO透析完后，得到兩親性綴合物Ir-ss-Qu納米藥。用動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布儀和透射電子顯微鏡對(duì)其粒徑及形貌進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖6和圖7所示，可以看到兩親性綴合物組裝成粒徑在110nm左右的球形納米藥。

二、兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥的性能測(cè)試

(1)兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥的體外釋放行為

將2mL 0.5mg mL^-1的兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥物溶液裝入透析袋(MWCO＝3,500)中，然后將透析袋置于50mL含不同濃度谷胱甘肽(GSH)(0.0mM、1.0mM or 5.0mM)的磷酸緩沖液中，以1.0mM or 5.0mM谷胱甘肽的磷酸緩沖液為實(shí)驗(yàn)組，和以0.0mM谷胱甘肽的磷酸緩沖液為對(duì)照組。在恒溫37℃，每隔一定時(shí)間間隔，取出3mL磷酸緩沖液，同時(shí)分別補(bǔ)充加入3mL新鮮上述三種磷酸緩沖液到透析液中，最后在365nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定取出樣品的熒光發(fā)射強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出伊立替康(Ir)的濃度，釋放結(jié)果如圖8所示，可以看到在還原劑GSH作用下，雙硫鍵斷裂能有效的釋放出Ir。

(2)兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞(MCF-7/ADR)體外生長(zhǎng)抑制效果

將MCF-7/ADR細(xì)胞以每孔1×10⁴個(gè)細(xì)胞的密度，接種在96孔板中，每孔200μL，細(xì)胞置于5％CO2和37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基，并加入含有不同系列濃度的Ir、Ir/Qu混合物或兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥物溶液，每孔50μL，加完結(jié)束后，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h；然后每孔加入20μL預(yù)先配置好的MTT的PBS溶液(5mg mL^-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去DMEM培養(yǎng)液，每孔加入200μL DMSO，輕微振蕩10min溶解藍(lán)紫色甲瓚，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處吸光值(A)；計(jì)算細(xì)胞存活率，算出各給藥組對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性，算出IC₅₀值，進(jìn)而算出各給藥組對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)，耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)(IRDR)＝IC₅₀(游離的Ir組)/IC₅₀(各實(shí)驗(yàn)處理組)，結(jié)果如圖9和表1所示，通過(guò)所得的耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)可以得出，兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥有效的逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥性。

表1

(3)兩親性綴合物抗腫瘤納米藥對(duì)MCF-7/ADR腫瘤細(xì)胞P-gp蛋白的抑制效果

將MCF-7/ADR細(xì)胞以5.0×10⁵個(gè)/孔的密度接種到6孔板中，每孔2mL，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)基，然后分別加入濃度20μM游離的Qu，Ir、Ir/Qu混合物或兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥物為實(shí)驗(yàn)組，不加任何藥物的為對(duì)照組。在37℃孵育24h后，吸去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS漂洗兩遍，消化細(xì)胞，4℃下1000rpm離心10min，預(yù)冷的PBS洗2次，將細(xì)胞重懸于0.1mL PBS中，分別加入5μL PE-anti-human MDR1后，繼續(xù)孵育30min，然后加入0.4mL PBS，再次離心，PBS洗2次后用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀FL2通道測(cè)試并分析門(mén)內(nèi)1×10⁴個(gè)細(xì)胞的熒光。熒光的數(shù)值就代表細(xì)胞膜表面P-gp蛋白的表達(dá)量，測(cè)試結(jié)果如圖10所示，可以看出兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥能有效的抑制MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp蛋白的表達(dá)。

實(shí)施例2：本發(fā)明的一種由奎寧Qu(式1)和伊立替康Ir(式2)制備的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥

一、兩親性綴合物Ir-cc-Qu抗腫瘤納米藥的另一制備方法，具體包括以下步驟：本實(shí)施例2除了以下步驟，其他步驟與實(shí)施例1相同。

(1)中間體Qu-cc-COOH的合成

取100mL反應(yīng)瓶，向其分別加入奎寧(324mg，1mmol)、丁二酸酐(500mg，5mmol)、DMAP(122mg，1mmol)和50mL無(wú)水CH₂Cl₂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，75℃避光反應(yīng)48小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑CH₂Cl2，再將粗產(chǎn)物過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝20∶1，v/v)，收集完畢，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得到淡黃色固體Qu-COOH(237mg，yield：51.1％)。

(2)兩親性藥-藥綴合物Ir-cc-Qu的合成

取50mL干燥潔凈的圓底燒瓶，向其分別加入Qu-COOH(232mg，0.426mmol)、Ir(226mg，0.385mmol)，二環(huán)己基碳二亞胺(0.079g，0.385mmol)、4-甲氨基吡啶(0.043g，0.35mmol)和10mL無(wú)水CH₂Cl₂，室溫下攪拌反應(yīng)24h后，過(guò)濾除去反應(yīng)體系中的不溶物，濃縮除去有機(jī)溶劑后，將粗產(chǎn)物過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝20∶1，v/v)，收集完畢，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得到淡黃色固體Ir-cc-Qu(0.35g，產(chǎn)率：67.1％)，如式5所示。

實(shí)施例3：本發(fā)明的一種由奎寧Qu(式1)和伊立替康Ir(式2)制備的兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥

一、兩親性綴合物Ir-ss-Qu抗腫瘤納米藥的又一制備方法，具體包括以下步驟：本實(shí)施例3除了以下步驟，其他步驟與實(shí)施例1相同

(1)中間體Qu-ss-OH的合成

取240mL反應(yīng)瓶，向其分別加入奎寧(972mg，3mmol)、三光氣(311.6mg，1.05mmol)、DMAP(1.22mg，10mmol)和120mL無(wú)水CH₂Cl₂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫避光反應(yīng)1小時(shí)后，加入溶有2，2′-二硫二乙醇(2.26g，3.85mmol)的50mL CH₂Cl₂溶液，繼續(xù)反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，用1N HCl洗滌3次，然后用10％的飽和NaHCO₃溶液洗滌3次，飽和食鹽水洗滌1次，去離子水洗滌2次，用無(wú)水Na₂SO₄干燥過(guò)夜，過(guò)濾收集有機(jī)層，旋蒸除去有機(jī)溶劑后，將粗產(chǎn)物過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝20∶1，v/v)，收集濃縮，即得到淡黃色固體Qu-ss-OH(877mg，yield：58％)。

(2)兩親性藥-藥綴合物Ir-ss-Qu的合成：

取90mL反應(yīng)瓶，向其分別加入Qu-ss-OH(504mg，1mmol)，三光氣(95.6mg，0.4mmol)、DMAP(0.488mg，4mmol)和60mL無(wú)水CH₂Cl₂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫避光反應(yīng)1小時(shí)后，加入溶有伊立替康Ir(2.32g，5mmol)的50mL THF溶液，繼續(xù)反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，用1N HCl洗滌3次，然后用10％的飽和NaHCO₃溶液洗滌3次，飽和食鹽水洗滌1次，去離子水洗滌2次，用無(wú)水Na₂SO₄干燥過(guò)夜，過(guò)濾收集有機(jī)層，旋蒸除去有機(jī)溶劑后，將粗產(chǎn)物過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝20∶1，v/v)，收集濃縮后，即得到淡黃色固體Qu-ss-Ir(721.6mg，yield：64.6％)，如式6所示。

實(shí)施例4：本發(fā)明的一種由奎寧Qu(式1)和匹杉瓊制備的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥

一、兩親性綴合物匹杉瓊-ss-Qu抗腫瘤納米藥的制備方法，具體包括以下步驟：

(1)中間體Qu-ss-NPC的合成

先合成Qu-ss-OH，Qu-ss-OH的合成步驟同實(shí)施例3中步驟(1)；然后取100mL反應(yīng)瓶，向其分別加入Qu-ss-OH(504mg，1mmol)、對(duì)硝基苯基氯甲酸酯(NPC-Cl，201mg，1mmol)、三乙胺(0.15mL，1.1mmol)和60mL無(wú)水CH₂Cl₂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫避光反應(yīng)24小時(shí)后，旋蒸除去有機(jī)溶劑，將粗產(chǎn)物過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5，v/v)，收集濃縮后，即得到淡黃色固體(532mg，yield：79.6％)。

(2)兩親性藥-藥綴合物匹杉瓊-ss-Qu的合成

將Qu-ss-NPC(532mg，0.79mmol)、匹杉瓊(440mg，0.79mmol)和三乙胺(0.58mL，4mmol)加入到30mL DMF溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h后，濃縮除去DMF后，分別使用(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝10∶1，5∶1，v/v)作為淋洗劑過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化，收集濃縮得到藍(lán)色固體匹杉瓊-ss-Qu(277.3mg，41％)，如式7所示。

實(shí)施例5：本發(fā)明的一種由奎寧Qu(式1)和喜樹(shù)堿CPT制備的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥

先合成Qu-ss-COOH，Qu-ss-COOH的合成步驟同實(shí)施例1中步驟(1)；如圖11所示，然后取250mL干燥潔凈的圓底燒瓶，向其分別加入Qu-ss-COOH(1.16g，2.13mmol)、喜樹(shù)堿(CPT，0.69g，2mmol)、二環(huán)己基碳二亞胺(0.5g，2.5mmol)、4-甲氨基吡啶(0.24g，2mmol)和100mL無(wú)水CH₂Cl₂，室溫下攪拌反應(yīng)24h后，過(guò)濾除去反應(yīng)體系中的不溶物，濃縮除去有機(jī)溶劑后，將粗產(chǎn)物過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝15∶1，v/v)，收集完畢后，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得到淺黃色固體CPT-ss-Qu(1.25g，產(chǎn)率：73％)。然后將綴合物CPT-ss-Qu中的Qu進(jìn)行質(zhì)子化，得到兩親性綴合物CPT-ss-Qu，如式8所示。

實(shí)施例6：本發(fā)明的一種由奎寧Qu(式1)和紫杉醇PTX制備的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥

先合成Qu-ss-COOH，Qu-ss-COOH的合成步驟同實(shí)施例1中步驟(1)，然后取250mL干燥潔凈的圓底燒瓶，向其分別加入Qu-ss-COOH(0.25g，0.45mmol)、紫杉醇(PTX，0.42g，0.5mmol)、二環(huán)己基碳二亞胺(103mg，0.5mmol)、4-甲氨基吡啶(48mg，0.4mmol)和100mL無(wú)水CH₂Cl₂，室溫下攪拌反應(yīng)72h后，過(guò)濾除去反應(yīng)體系中的不溶物，濃縮除去有機(jī)溶劑后，將粗產(chǎn)物過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝10∶1，v/v)，收集完畢后，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得到白色固體粉末PTX-ss-Qu(0.372g，產(chǎn)率：64％)。然后將綴合物PTX-ss-Qu中的Qu進(jìn)行質(zhì)子化，即得到兩親性綴合物PTX-ss-Qu，如式9所示。

實(shí)施例7：本發(fā)明的一種由奎寧Qu(式1)和阿霉素制備的兩親性綴合物抗腫瘤納米藥

先合成Qu-ss-NPC，Qu-ss-NPC的合成步驟同實(shí)施例4中步驟(1)，然后將Qu-ss-NPC(669mg，1mmol)，阿霉素(579mg，1mmol)，三乙胺(0.15mL，1mmol)加入到50mL DMF溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h后，濃縮除去DMF，再分別使用(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝20∶1，v/v)作為淋洗劑過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化，收集濃縮得到紅色固體粉末綴合物(0.84g，78％)，然后將綴合物中的Qu進(jìn)行質(zhì)子化，即得到兩親性綴合物阿霉素-ss-Qu，如式10所示。

以上公開(kāi)的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實(shí)施例并沒(méi)有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實(shí)施方式。顯然，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說(shuō)明書(shū)選取并具體描述這些實(shí)施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實(shí)際應(yīng)用，從而使所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書(shū)及其全部范圍和等效物的限制。