本發(fā)明涉及脂肪干細(xì)胞美容微囊泡的培養(yǎng)制備方法，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
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多年來，美容、整形都是大家關(guān)注的焦點，找到切實有效、安全可靠的美容產(chǎn)品已變得尤為迫切。一直到20世紀(jì)的80年代，人們都覺得脂肪只是一個能量儲備的組織，多余的脂肪是肥胖的元兇，是各種疾病的源頭，于是想盡辦法減掉身上的脂肪，不惜通過手術(shù)的方式去除脂肪，直到2001年Zuk等人首次將脂肪干細(xì)胞從脂肪組織中提取出來，用于在很多醫(yī)療應(yīng)用，并已被廣泛承認(rèn)，自從那時候，脂肪干細(xì)胞的密集研究和成功的醫(yī)療應(yīng)用已在全球廣泛實施。
有研究表明脂肪來源干細(xì)胞具有組織修復(fù)能力，研究證實，脂肪來源干細(xì)胞輔助下的面部年輕化治療后患者的皮膚毛孔、斑點改善效果均較好。ADSCs細(xì)胞能夠在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，同時它具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細(xì)胞、適宜大規(guī)模培養(yǎng)、對機(jī)體損傷小等優(yōu)點，而且其來源廣泛，體內(nèi)儲備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來新的研究熱點之一。
傳統(tǒng)的脂肪移植手段由于存在免疫排斥、炎癥反應(yīng)等缺陷難以得到讓人滿意的療效。據(jù)統(tǒng)計，自體脂肪組織移植到缺損部位后，通常其中40％～60％會被吸收。通過患者自身的脂肪組織內(nèi)的干細(xì)胞，來構(gòu)建具有完整生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能工程脂肪組織無疑將是解決這一難題的最佳方案。
現(xiàn)在整形美容手術(shù)的最突出特征就是追求最小的侵入性手術(shù)操作，沿著最自然的技術(shù)方向發(fā)展。脂肪組織來源干細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)在整形美容外科占有重要的地位，并且未來更將如此。但是目前現(xiàn)有的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)過程較為復(fù)雜,不適合大范圍推廣。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
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針對上述問題，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供脂肪干細(xì)胞美容微囊泡的培養(yǎng)制備方法。
本發(fā)明的脂肪干細(xì)胞美容微囊泡的培養(yǎng)制備方法具體步驟為：步驟一：無菌條件下取健康女性腹部和腿部皮下脂肪約5g，浸沒于含0.5-1.5％的青鏈霉素的PBS溶液中采用無菌塑料瓶密封后送回實驗室；
步驟二：在超凈臺上將脂肪剪成1mm3×1mm3組織小碎塊，去除小血管，用PBS緩沖液洗凈血污；
步驟三：在37℃下，用0.25％的胰蛋白酶消化3-8min后,采用0.1％的I型膠原酶消化脂肪組織塊15-25min；
步驟四：將脂肪消化后的產(chǎn)物接種于1mm孔徑的尼龍網(wǎng)中在含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基中，放置在37℃下，5％CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
步驟五：24h后半量換液，48h后全量換液，以后每2d換液1次。約7-15天左右能在顯微鏡下觀察到貼壁脂肪干細(xì)胞，半量換液后繼續(xù)培養(yǎng)，去除油脂，三天后換液，脂肪干細(xì)胞已經(jīng)能穩(wěn)定生長，每三天換液一次，至脂肪干細(xì)胞生長鋪滿瓶底，即可進(jìn)行傳代；
步驟六：傳代時去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌貼壁脂肪干細(xì)胞一次，加入1.5-3.5ml的胰酶-EDTA，在37℃條件下作用3-8min左右，加入等體積含血清的培養(yǎng)基中止消化，吸管輕吹貼壁脂肪干細(xì)胞，使其從瓶壁上脫落下來形成細(xì)胞懸液，將脂肪干細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，在1000rpm下離心3-8min，棄上清，用適量L-DMEM培養(yǎng)基重懸脂肪干細(xì)胞，傳代比例為1:2，接種量為5ml/瓶，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)；
步驟七：收集脂肪干細(xì)胞，加入含有Lipofectamine 2000(Invitrogen美國)0.15-0.25mL的PBS緩沖液18-22ml，在37℃，5％CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1.5-2.5小時；
步驟八：取出脂肪干細(xì)胞懸液，離心5000rpm，7-12min，去除上清，加入1-3ml的PBS，-20℃和37℃反復(fù)凍融，進(jìn)行細(xì)胞裂解；
步驟九：加入PBS緩沖液15-20ml，制備成脂肪干細(xì)胞美容微囊泡，在10℃-20℃下長期保存，使用時融化即可。
本發(fā)明的有益效果：它能克服現(xiàn)有技術(shù)的弊端。具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細(xì)胞、適宜大規(guī)模培養(yǎng)、對機(jī)體損傷小等優(yōu)點，并且它取材來源廣泛，體內(nèi)儲備量大，適宜自體移植，它的培養(yǎng)過程較為簡單，操作容易，適合在美容業(yè)和醫(yī)療業(yè)中大范圍推廣。
具體實施方式：
本具體實施方式采用以下實施例來具體說明：步驟一：無菌條件下取健康女性腹部和腿部皮下脂肪約5g，浸沒于含0.5-1.5％的青鏈霉素的PBS溶液中采用無菌塑料瓶密封后送回實驗室；
步驟二：在超凈臺上將脂肪剪成1mm3×1mm3組織小碎塊，去除小血管，用PBS緩沖液洗凈血污；
步驟三：在37℃下，用0.25％的胰蛋白酶消化3-8min后,采用0.1％的I型膠原酶消化脂肪組織塊15-25min；
步驟四：將脂肪消化后的產(chǎn)物接種于1mm孔徑的尼龍網(wǎng)中在含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基中，放置在37℃下，5％CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
步驟五：24h后半量換液，48h后全量換液，以后每2d換液1次。約7-15天左右能在顯微鏡下觀察到貼壁脂肪干細(xì)胞，半量換液后繼續(xù)培養(yǎng)，去除油脂，三天后換液，脂肪干細(xì)胞已經(jīng)能穩(wěn)定生長，每三天換液一次，至脂肪干細(xì)胞生長鋪滿瓶底，即可進(jìn)行傳代；
步驟六：傳代時去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌貼壁脂肪干細(xì)胞一次，加入1.5-3.5ml的胰酶-EDTA，在37℃條件下作用3-8min左右，加入等體積含血清的培養(yǎng)基中止消化，吸管輕吹貼壁脂肪干細(xì)胞，使其從瓶壁上脫落下來形成細(xì)胞懸液，將脂肪干細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，在1000rpm下離心3-8min，棄上清，用適量L-DMEM培養(yǎng)基重懸脂肪干細(xì)胞，傳代比例為1:2，接種量為5ml/瓶，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)；
步驟七：收集脂肪干細(xì)胞，加入含有Lipofectamine 2000(Invitrogen美國)0.15-0.25mL的PBS緩沖液18-22ml，在37℃，5％CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1.5-2.5小時；
步驟八：取出脂肪干細(xì)胞懸液，離心5000rpm，7-12min，去除上清，加入1-3ml的PBS，-20℃和37℃反復(fù)凍融，進(jìn)行細(xì)胞裂解；
步驟九：加入PBS緩沖液15-20ml，制備成脂肪干細(xì)胞美容微囊泡，在10℃-20℃下長期保存，使用時融化即可。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。