本發(fā)明屬于藥學(xué)科學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及一種抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
玻璃海鞘廣泛分布于山東沿海地區(qū)，它是發(fā)育與進(jìn)化生物學(xué)研究的重要生物，且近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、免疫調(diào)節(jié)以及生物催化等作用，因而引起人們廣泛關(guān)注。玻璃海鞘具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，因此被《Science》雜志稱為生物學(xué)研究的后起之秀，具有良好的應(yīng)用前景。
從薩氏海鞘(Cionasavignyi)中分離出的一種新型多肽CS5931具有顯著的抗腫瘤活性，N-末端序列分析發(fā)現(xiàn)，CS5931與人顆粒體蛋白(granulin，GRN)有同源性。本課題組已成功通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組薩氏海鞘多肽CS5931，其同樣具有顯著的抗腫瘤活性。為提高海鞘多肽的穩(wěn)定性和利用率，發(fā)揮其抗腫瘤的臨床作用，因此發(fā)明一種將海鞘多肽制成抗腫瘤的凍干藥物制劑具有十分重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑及其制備方法。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑，其特征在于：所述制劑包括海鞘多肽CS5931和賦形劑。
進(jìn)一步的，所述賦形劑選自糖類、多元醇類、聚合物類中的一種或幾種；所述糖類選自葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、菊糖、纖維素中的一種或幾種，多元醇選自甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、肌醇和硫醇中的一種或幾種，聚合物選自聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、右旋糖苷、聚乙二醇、明膠、β-環(huán)糊精、纖維素中的一種或幾種。
更進(jìn)一步的，所述海鞘多肽CS5931與賦形劑的重量份數(shù)1：1～4，優(yōu)選1：2。
本發(fā)明還提供了所述的抗腫瘤海鞘多肽CS5931凍干粉針制劑的制備方法，其特征在于：稱取海鞘多肽，加入適量注射用水溶解，加入賦形劑使溶解，補(bǔ)加注射用水至全量，用0.22μm濾膜無(wú)菌過(guò)濾，灌裝，將混合后的溶液裝入清潔無(wú)菌的西林瓶中，用膠塞半扣塞，冷凍干燥，即得。
進(jìn)一步的，凍干過(guò)程是：預(yù)凍：板層溫度為-35℃～-25℃，保溫4-5小時(shí)；低溫升華干燥：真空度0～30Pa，板層溫度為-35℃～0℃，保溫15-17小時(shí)；二次干燥：板層溫度20～30℃，保溫4-5小時(shí)以上。
更進(jìn)一步的，凍干過(guò)程是：預(yù)凍：板層溫度為-35℃，保溫4小時(shí)；低溫升華干燥：真空度0～30Pa，板層溫度為-35℃～0℃，保溫16小時(shí)；二次干燥：板層溫度25℃，保溫4小時(shí)以上。
本發(fā)明還提供了所述的抗腫瘤海鞘多肽CS5931的制備方法，其特征在于：將克隆編碼多肽CS5931的基因在大腸桿菌中表達(dá)，并通過(guò)DEAE離子交換和Superdex75分子篩凝膠層析制備目的多肽；經(jīng)變性復(fù)性后，制備好不帶His標(biāo)簽的有活性的目的多肽；具體步驟如下：
1)海鞘多肽CS5931大腸桿菌表達(dá)體系發(fā)酵：克隆編碼多肽CS5931的基因連接入質(zhì)粒PET-21a載體上，導(dǎo)入表達(dá)菌BL21(DE3)構(gòu)成工程菌BL21(DE3)/pET21a-CS5931(簡(jiǎn)稱pET21a-CS5931,下同)，將pET21a-CS5931接種在含有氨芐的培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，活化后的種子液轉(zhuǎn)接入含有氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種后4-5h時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4.5-8.5h；
所述的IPTG添加的終濃度為0.4mM-0.7mM；所述的活化后的種子液轉(zhuǎn)接入含有氨芐的LB培養(yǎng)基中的接種量在3-6％；所述的pET21a-CS5931活化后接種入LB培養(yǎng)基中發(fā)酵的裝液量在20-45％；所述IPTG加入后的發(fā)酵溫度為23℃-30℃；
2)海鞘多肽CS5931的分離純化：通過(guò)DEAE陰離子交換柱層析和Superdex75分子篩凝膠層析制備；使目的多肽得到純化；
3)所述的變性復(fù)性：向純化好的目的多肽溶液中分次緩慢加入8M尿素，1-3mML-半胱氨酸，0.3-0.6mML-精氨酸，0.3-0.6mMEDTA，反應(yīng)3-5h；多肽樣品變性完成后，將變性樣品放于透析袋中，在復(fù)性液中透析24-30h，期間換1次復(fù)性液；復(fù)性完成后，將復(fù)性液更換為透析液，透析3-5h，將透析完成的樣品濃縮凍干得到純化后的抗腫瘤海鞘多肽CS5931。
進(jìn)一步，所述IPTG添加的終濃度為0.6mM時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)效果最好；所述IPTG的添加時(shí)間為接種后4.5h；所述活化后的種子液轉(zhuǎn)接入含有氨芐的LB培養(yǎng)基中接種量在4％，加入IPTG后發(fā)酵培養(yǎng)溫度30℃，所述的pET21a-CS5931活化后接種入LB培養(yǎng)基發(fā)酵的裝液量在20％；
進(jìn)一步，所述的復(fù)性液的成份及其終濃度為0.3-0.6mML-精氨酸、0.5M尿素、1-3mML-半胱氨酸或還原型谷胱甘肽作為還原劑，0.1-0.3mML-胱氨酸或氧化型谷胱甘肽作為氧化劑，還原劑和氧化劑兩者摩爾比為10:1，上述物質(zhì)溶解在TGE緩沖液中。
TGE緩沖液的成份及其終濃度為是：0.05-0.15MTris，0.25-0.75mMEDTA，0.05-0.15MNaCl，加1.0L蒸餾水，1M鹽酸調(diào)pH到8.0，加20-100mL甘油，混勻后定容至2L。透析液的成份及其終濃度為：0.05-0.15MTris，0.3-0.6mML-精氨酸、加600mL蒸餾水，1M鹽酸調(diào)PH到8.0，溶解后定容到1000mL。
進(jìn)一步，多肽CS5931大腸桿菌表達(dá)體系發(fā)酵：取-80℃保存的甘油菌pET21a-CS5931于含100μg/mLAmp的3mLLB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜后涂平板，37℃倒置培養(yǎng)12h，從平板上挑含有目的基因的表達(dá)菌BL21(DE3)的單菌落接于含100μg/mLAmp的10mLLB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min活化培養(yǎng)12h，將活化的種子液以4％的接種量轉(zhuǎn)接入50mLLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有100μg/mL的Amp，裝液量為20％，37℃，200r/min培養(yǎng)，待OD600達(dá)到0.6左右時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6.5h；
進(jìn)一步，所述的海鞘多肽CS5931的分離純化：將發(fā)酵所得菌體離心，收集菌體沉淀，稱量菌重；冰上融解菌體沉淀，按每克菌加3-5mL細(xì)菌裂解液的比例加細(xì)菌裂解液，冰上裂解40-60min；超聲波破碎菌體后，離心，取上清，用濾膜過(guò)濾；利用蛋白純化系統(tǒng)，以0.05-0.5M的NaCl緩沖液作為洗脫液進(jìn)行DEAE陰離子交換柱層析，收集0.15MNaCl緩沖液洗脫組分，待用；將上述收集的洗脫組分經(jīng)Superdex75分子篩凝膠層析，用超純水做洗脫液，流速為0.5-1.2mL/min，收集洗脫組分，待用。
采用凍干粉制劑，研究不同配方對(duì)制劑穩(wěn)定性的影響，研究了甘露醇、蔗糖等賦形劑對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響，通過(guò)外觀觀察、穩(wěn)定性試驗(yàn)等確定了凍干制劑的最佳配方。觀察凍干制劑的外觀，測(cè)定凍干制劑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
本發(fā)明經(jīng)大腸桿菌表達(dá)和層析分離純化制備不帶His標(biāo)簽的海鞘多肽CS5931；將純化得到的多肽樣品進(jìn)行變性復(fù)性處理，可得到具有較好的腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制作用的重組多肽CS5931，該方法制備的多肽保留了天然多肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生物活性；將海鞘多肽與輔料甘露醇制備成凍干粉制劑，在優(yōu)化的配比下制成的制劑溶解性及溶液穩(wěn)定性良好，且大大提高了抗腫瘤海鞘多肽藥物生物利用度。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1：多肽CS5931大腸桿菌表達(dá)體系
克隆編碼多肽CS5931的基因連接入質(zhì)粒PET-21a載體上，導(dǎo)入表達(dá)菌BL21(DE3)。取-80℃保存的甘油菌pET21a-CS5931于含100μg/mLAmp的3mLLB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜后涂平板，37℃倒置培養(yǎng)12h。從平板上挑單菌落接于含100μg/mLAmp的10mLLB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min活化培養(yǎng)12h。實(shí)驗(yàn)在250mL搖瓶中進(jìn)行，將活化的種子液轉(zhuǎn)接入50mLLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有100μg/mL的Amp，待培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6左右時(shí)加入0.6mMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)7h。
實(shí)施例2：海鞘多肽CS5931的分離純化
(1)將發(fā)酵所得菌體離心，收集菌體沉淀，稱量菌重。
(2)冰上融解菌體沉淀，按每克菌加3mL細(xì)菌裂解液的比例加細(xì)菌裂解液，冰上裂解40min。超聲波破碎菌體后，10000r/min離心90min，取上清，用0.45μm濾膜過(guò)濾。
(3)利用AKTA-purifier蛋白純化系統(tǒng)，以0.05-0.5M的NaCl緩沖液作為洗脫液進(jìn)行DEAE陰離子交換柱層析，收集0.15MNaCl緩沖液洗脫組分，待用；
(4)將上述收集的洗脫組分經(jīng)Superdex75分子篩凝膠層析，用超純水做洗脫液，流速為0.5-1.2mL/min，收集洗脫組分，即為純化好的目的多肽。
實(shí)施例3：海鞘多肽CS5931的變性和復(fù)性
向純化得到的目的多肽溶液中分次緩慢加入8M尿素，2mML-半胱氨酸，0.5mML-精氨酸，0.5mMEDTA，反應(yīng)4h；蛋白樣品變性完成后，將變性樣品放于透析袋中，在復(fù)性液中透析24h，期間換1次復(fù)性液；然后更換透析液，在透析液中透析3-5h，除去樣品中的鹽等雜質(zhì)。復(fù)性液的配方為所述的復(fù)性液的配制方法為0.5mML-精氨酸、0.5M尿素、2mML-半胱氨酸，或2mM還原型谷胱甘肽，0.2mML胱氨酸或0.2mM氧化型谷胱甘肽，兩者摩爾比為10:1，用TGE緩沖液定容至2L。TGE緩沖液的配方為24.2gTris，0.244gEDTA，5.85gNaCl，加1.0L蒸餾水，1M鹽酸調(diào)PH到8.0，加20mL甘油，混勻后定容至2L。
實(shí)施例4：海鞘多肽凍干粉針劑的制備
1.海鞘多肽和輔料的類型及比例
按照凍干粉針劑的特點(diǎn)，所制備的樣品外觀應(yīng)潔白、細(xì)膩、加水能迅速溶解，所得溶液應(yīng)澄明。為使本發(fā)明的凍干粉針具有上述特點(diǎn)，設(shè)定4個(gè)不同的樣品，詳細(xì)見表1。
表1海鞘多肽和輔料的類型及比例
結(jié)果表明采用50mg CS5931+100mg蔗糖(配方2)或50mg CS5931+100mg(配方4)甘露醇效果最好。
2.凍干工藝：冷凍干燥包括預(yù)凍、低溫升華和解吸干燥3個(gè)階段，根據(jù)這3個(gè)階段的冷凍干燥原理，設(shè)計(jì)3個(gè)凍干工藝分別考察樣品的各項(xiàng)指標(biāo)，按表2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳的凍干工藝。結(jié)果見表3。
表2凍干工藝參數(shù)
考察3種工藝所得樣品的各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果見表3
表3凍干樣品的結(jié)果比較
據(jù)表3結(jié)果可知，凍干工藝3所得樣品的成型性和機(jī)械強(qiáng)度均較前兩個(gè)工藝好，溶解性方面3個(gè)工藝相差不大，綜合考慮，凍干工藝3作為本品的凍干工藝。
3.穩(wěn)定性考察：
將樣品分別置于強(qiáng)光(4500±500)LX、RH75、RH92.5、高溫(60℃)下放置10d，分別于0，5，10d取樣考察樣品形狀、pH值、溶液的澄清度、水分、含量。
表4配方2穩(wěn)定性考察試驗(yàn)結(jié)果
表5配方4穩(wěn)定性考察試驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)研究表明：本發(fā)明的兩種配方的海鞘多肽粉針劑在強(qiáng)光、高溫、高濕等條件下各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯化，具較佳的穩(wěn)定性。
4.藥效學(xué)研究(體外抗腫瘤活性)
采用MTT法測(cè)定凍干制劑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去除原細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗2次，加入適量胰蛋白酶液進(jìn)行消化，離心收集細(xì)胞。去除上清液，加入適量新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔180μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度，使每孔中的細(xì)胞數(shù)目在5000個(gè)左右。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞覆蓋微孔50％左右的面積時(shí)，每孔加入20μL待測(cè)樣品，設(shè)置3個(gè)平行孔。陰性空白對(duì)照每孔加入20μLPBS。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h，每孔加入MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng)，小心吸除150μL培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜150μL，置多功能微孔板檢測(cè)儀中低速振蕩10min，使藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解。用多功能微孔板檢測(cè)儀測(cè)定490nm/562nm波長(zhǎng)處各孔的吸光值。取三個(gè)平行孔的平均OD值，按照如下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率，當(dāng)細(xì)胞抑制率為50％時(shí)，所對(duì)應(yīng)的藥物濃度為半數(shù)抑制濃度IC50。
細(xì)胞抑制率(％)＝(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/OD對(duì)照組×100％
不同樣品對(duì)結(jié)腸癌表現(xiàn)出不同的抗腫瘤活性，結(jié)果見表6，說(shuō)明配方4具有更好的抗腫瘤作用。
表6海鞘多肽凍干制劑對(duì)結(jié)腸癌的增殖抑制作用