本發(fā)明是復(fù)合型醫(yī)藥材料制備和應(yīng)用，涉及一種包埋藥物的顆粒型材料，一種靶向性載藥硅質(zhì)體及制備和應(yīng)用，是脂質(zhì)體技術(shù)與硅質(zhì)載體技術(shù)的交叉應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脂質(zhì)體具有仿生細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，進(jìn)入體內(nèi)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而激活機(jī)體的自身免疫功能，改變被包封藥物的體內(nèi)分布、使藥物在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中蓄積、從而提高藥物的治療指數(shù)、減少藥物治療劑量和降低藥物的毒性。研究表明，脂質(zhì)體包裹的阿霉素比游離毒性要降低50%~70%。多種脂質(zhì)體型藥物注射液已經(jīng)得到FDA批準(zhǔn)，如兩性霉素、多柔比星、柔紅霉素和紫衫醇等。然而，脂質(zhì)體作為藥物載體有著存在穩(wěn)定性差、制劑成本高等局限性。其脂質(zhì)表面特性如雙層膜流動性、表面電荷等給制備技術(shù)及工業(yè)化生產(chǎn)帶來很大難度。脂質(zhì)體與血漿蛋白之間相互作用容易導(dǎo)致脂質(zhì)體去穩(wěn)定化，在包埋一些兩親性藥物時(shí)極不穩(wěn)定。靶向型脂質(zhì)體，及靶向集團(tuán)修飾脂質(zhì)體技術(shù)，利用靶向型多肽修飾表面，主動靶向?qū)⑺幬餄饧ㄎ挥诎薪M織、靶器官、靶細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)部機(jī)構(gòu)中。靶向性脂質(zhì)體是指在脂質(zhì)體表面聯(lián)接識別分子（如Lyp-1，cRGD，angiopep-2，RPARPAR，RGERPPR，iNGR等），通過識別分子特異性專一地與靶細(xì)胞表面的互補(bǔ)相互作用，將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)到靶區(qū)釋放藥物。

硅質(zhì)體材料，即通過溶膠/凝膠法和自組裝過程形成的一種新型運(yùn)載材料，硅質(zhì)體中Si的含量低于4%，脂質(zhì)層中形成一層原子厚度的硅氧網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增加了穩(wěn)定性，解決了穩(wěn)定性差的問題。與脂質(zhì)體一樣，硅質(zhì)體具有脂質(zhì)雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)，生物相容性好，并且可以生物降解，不會殘留在生物體內(nèi)。它不僅可以包埋親水性、親油性藥物，甚至還可兩親性藥物。利用硅質(zhì)體作為藥物載體可以輸送小分子抗癌藥物、蛋白質(zhì)藥物、基因以及磁性顆粒等各種不同功能的物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)多種藥物或多種治療方法的聯(lián)合，使之成為診斷癌癥和殺死癌細(xì)胞的有力工具。通過調(diào)控硅質(zhì)體表面Si-O-Si的縮合度，可控制內(nèi)載藥物的釋放速率。研究證明，隨著Si-O-Si縮合度增加，藥物釋放速率降低。

阿霉素（Dox）作為臨床使用頻繁的化療藥物，具有抗癌譜廣、化療指數(shù)高，其副作用存在有骨髓移植、惡心、嘔吐、脫發(fā)、高熱等癥狀，累計(jì)劑量大時(shí)會發(fā)生心肌壞死甚至充血性心力衰竭。使用二氧化硅材料包埋阿霉素藥物形成的納米藥物具有緩釋功能，延長藥物作用時(shí)間，增加在體內(nèi)的半衰期，保護(hù)被包埋的藥物分子不受體內(nèi)酶的破壞，增強(qiáng)生物相容性等特點(diǎn)。本發(fā)明解決的技術(shù)問題是靶向脂質(zhì)體載體穩(wěn)定性弱，易氧化的問題，提供一種具有靶向指向作用的穩(wěn)定性好、生物相容性高、緩釋時(shí)間長、載藥量大、藥物包裹效率高的包覆方法, 同時(shí)工藝簡單、成本低的優(yōu)點(diǎn)。硅質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)克服脂質(zhì)體不穩(wěn)定的特點(diǎn)，同時(shí)又能發(fā)揮靶向性脂質(zhì)體細(xì)胞靶向的功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對脂質(zhì)體包封藥物穩(wěn)定性的不足，提供一種靶向性載藥硅質(zhì)體及制備和應(yīng)用。使用硅酸四乙酯水解后形成的二氧化硅殼層包載水溶性藥物分子，而后靶向性脂質(zhì)分子物理吸附于藥物顆粒表層形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，并使其具有特定的組織靶向性。

一種靶向性載藥硅質(zhì)體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）硅質(zhì)體原料的合成：

三頸瓶中加入十六烷胺和乙醇溶劑，充分溶解后加入1/2摩爾量的溴代十六烷，加入催化劑無水碳酸鈉，回流120h后停止反應(yīng)，反復(fù)精制得到雙十六烷胺；將雙十六烷胺與琥珀酸酐加入干燥的四氫呋喃中，充分反應(yīng)24h，濃縮，用氯仿溶解后依次用10%檸檬酸及飽和氯化鈉洗滌分液，溶劑蒸發(fā)后得粗產(chǎn)品，然后用乙腈重結(jié)晶精制；

（2）靶向性脂質(zhì)體原料的制備：

將腫瘤細(xì)胞穿膜肽溶于PBS溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復(fù)合物（DSPE-PEG-MAL），其摩爾當(dāng)量為腫瘤細(xì)胞穿膜肽的0.8倍，溶于二甲基甲酰胺，加入多肽水溶液中，超聲去除氣泡，攪拌反應(yīng)1小時(shí)至DSPE-PEG-Mal反應(yīng)完全，透析，截留分子量3500Da，透析介質(zhì)為水，去除過量的腫瘤細(xì)胞穿膜肽和DMF，冷凍干燥，得到腫瘤細(xì)胞穿膜肽-PEG-DSPE材料；

（3）靶向性脂質(zhì)插入硅質(zhì)復(fù)合體的制備：

將處方的摩爾組成為硅質(zhì)材料/膽固醇/ mPEG-DSPE/腫瘤穿膜肽-PEG-DSPE=55:45:2:1，將各組分用氯仿溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加水溶液至脂質(zhì)膜中，超聲分散并在水浴60度旋轉(zhuǎn)震蕩，得脂質(zhì)體混懸液；擠壓過50nm孔徑大小的碳酸脂膜，得到粒徑大小均勻的靶向性硅質(zhì)體；載藥時(shí)，將處方的摩爾組成為硅質(zhì)材料/膽固醇/ mPEG-DSPE/腫瘤穿膜肽-PEG-DSPE=55:45:2:1，將各組分用氯仿溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，再加入多柔比星等藥物，加水溶液至脂質(zhì)膜中，超聲分散并在水浴60度旋轉(zhuǎn)震蕩，得脂質(zhì)體混懸液；擠壓過50nm孔徑大小的碳酸脂膜，得到載藥型粒徑大小均勻的靶向性硅質(zhì)體。

所述的腫瘤細(xì)胞穿膜肽為Lyp-1，cRGD，angiopep-2，RPARPAR，RGERPPR，iNGR中的一種或其組合。

腫瘤細(xì)胞穿膜肽為多種類型以針對不同腫瘤細(xì)胞，具體為腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中的一種。

一種靶向性載藥硅質(zhì)體，其特征在于，根據(jù)上述任一所述方法制備得到。

一種靶向性載藥硅質(zhì)體的應(yīng)用。

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是克服靶向性脂質(zhì)體穩(wěn)定性弱，易氧化的問題。靶向脂質(zhì)體復(fù)合硅質(zhì)體包載阿霉素，提供一種具有靶向指向作用的穩(wěn)定性好、生物相容性高、緩釋時(shí)間長、載藥量大、藥物包裹效率高的包覆方法, 同時(shí)工藝簡單、成本低的優(yōu)點(diǎn)。

是脂質(zhì)體技術(shù)與無機(jī)顆粒載體技術(shù)的交叉應(yīng)用。通過將合成硅質(zhì)體材料與靶向脂質(zhì)體材料復(fù)合，硅質(zhì)水解于藥物外部形成殼層，隨后將含有不同靶向基團(tuán)的脂質(zhì)體形成外殼層，此復(fù)合機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)針對不同腫瘤組織靶向。本發(fā)明提供一種具有靶向指向作用的穩(wěn)定性好、生物相容性高、緩釋時(shí)間長、載藥量大、藥物包裹效率高的包覆方法。

本發(fā)明有如下優(yōu)勢：該方法使用的硅質(zhì)材料水化后形成穩(wěn)定SiO2為內(nèi)殼層，增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性，同時(shí)具有藥物緩釋效果；靶向性脂質(zhì)體作為外殼層包覆于SiO2@DOX外層，賦予特異性的細(xì)胞靶向性。操作簡便，成本低，容易工業(yè)化實(shí)現(xiàn)；

本復(fù)合結(jié)構(gòu)具有高生物相容性，也可包裹CdS量子點(diǎn)等發(fā)光材料，輕易實(shí)現(xiàn)靶向組織熒光成像。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1,2所得的硅質(zhì)體SEM照片。

圖2為實(shí)施例3,4所得的靶向脂質(zhì)/硅質(zhì)體TEM照片。

圖3為實(shí)施例1,2,3,4所得的共聚焦U87MG和NIH3T3細(xì)胞吞噬照片。

圖4為實(shí)施例2,4所得24小時(shí)載阿霉素對U87MG的殺傷率。

圖5為實(shí)施例1,3載體材料對NIH3T3的生存率。

具體實(shí)施方式

以下通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下的實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：

純硅質(zhì)體：采用薄膜水化法制備硅質(zhì)體，稱取3mg 硅質(zhì)材料在pH=3 的酸性乙醇溶液中酸化后置于25mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干以后加入4ml去離子水，將燒瓶放入55攝氏度恒溫水浴中水化薄膜約30min。水浴超聲后，即可得到硅質(zhì)體懸液。將硅質(zhì)體懸液稀釋滴在鋁箔干燥后，形貌SEM照片如圖。

實(shí)施例2：

純硅質(zhì)體@阿霉素：采用薄膜水化法制備硅質(zhì)體，稱取3mg 硅質(zhì)材料在pH=3 的酸性乙醇溶液中酸化后置于25mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干以后，加入一定量的阿霉素溶液（硅質(zhì)：阿霉素摩爾比為30:1）到圓底燒瓶中，緩慢旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（55攝氏度水浴，90r/min）除去溶劑，加入4ml去離子水，將燒瓶放入55攝氏度恒溫水浴中水化薄膜約30min。水浴超聲后，即可得到硅質(zhì)體@阿霉素懸液，將懸液加入離心管中，在6000rpm下離心10min，透析。除去硅質(zhì)體中未包裹的游離阿霉素。所得懸液室溫避光過夜使之形成硅酸鹽網(wǎng)絡(luò)，4攝氏度冰箱避光保存待用。

實(shí)施例3：

靶向性硅質(zhì): 采用薄膜水化法制備硅質(zhì)體，將處方的摩爾組成為硅質(zhì)材料/膽固醇/ mPEG-DSPE/腫瘤穿膜肽-PEG-DSPE=55:45:2:1，將各組分用氯仿溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。稱取3mg 上述材料在pH=3 的酸性乙醇溶液中酸化后置于25mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干以后加入4ml去離子水，將燒瓶放入55攝氏度恒溫水浴中水化薄膜約30min。水浴超聲后，即可得到靶向硅質(zhì)體懸液。

實(shí)施例4：

靶向性硅質(zhì)@阿霉素: 采用薄膜水化法制備靶向性硅質(zhì)體@阿霉素，將處方的摩爾組成為硅質(zhì)材料/膽固醇/ mPEG-DSPE/腫瘤穿膜肽-PEG-DSPE=55:45:2:1，將各組分用氯仿溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。純硅質(zhì)體@阿霉素：采用薄膜水化法制備硅質(zhì)體，稱取3mg 硅質(zhì)材料在pH=3 的酸性乙醇溶液中酸化后置于25mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干以后，加入一定量的阿霉素溶液（硅質(zhì)：阿霉素摩爾比為30:1）到圓底燒瓶中，緩慢旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（55攝氏度水浴，90r/min）除去溶劑，加入4ml去離子水，將燒瓶放入55攝氏度恒溫水浴中水化薄膜約30min。水浴超聲后，即可得到硅質(zhì)體@阿霉素懸液，將懸液加入離心管中，在6000rpm下離心10min，透析。除去硅質(zhì)體中未包裹的游離阿霉素。所得懸液室溫避光過夜使之形成硅酸鹽網(wǎng)絡(luò)，4攝氏度冰箱避光保存待用。

硅質(zhì)體及靶向型硅質(zhì)體納米粒子的形貌考察：將實(shí)施例1,2,3,4制得的硅質(zhì)體，硅質(zhì)體@阿霉素、靶向硅質(zhì)體和靶向硅質(zhì)體@阿霉素的照片，可以看到尺寸均分布在100-300nm之間如圖1,2 所示。

納米粒子的體外靶向性考察：在無血清培基中(200μL)，將實(shí)施例1,3 制得的具有熒光發(fā)光性能普通硅質(zhì)體₂@阿霉素，和靶向硅質(zhì)體@阿霉素分別與靶向性細(xì)胞U87mg (10⁵/mL)在CO₂孵育箱下25℃孵育24 hour ；然后用800μL 的PBS溶液液離心清洗細(xì)胞兩次，將非特異性吸附在細(xì)胞表面的納米顆粒清除；第二次離心后，用200μL 的PBS 重新將細(xì)胞分散并在在激光共聚焦顯微鏡下觀察普通硅質(zhì)體₂@阿霉素，和靶向硅質(zhì)體@阿霉素, 對靶向性細(xì)胞U87mg的識別情況，其觀察結(jié)果如圖3所示。普通硅質(zhì)材料，對U87mg細(xì)胞的吞噬率為45%，靶向硅質(zhì)體對細(xì)胞的吞噬率為90%；這說明實(shí)施例3中修飾到硅質(zhì)體表面的穿模肽會增強(qiáng)U87mg細(xì)胞攝取的EPR效應(yīng)。

硅質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞靶向殺傷效果的評價(jià)：參照實(shí)施例2, 4 的步驟制備普通硅質(zhì)體₂@阿霉素和靶向硅質(zhì)體@阿霉素。為考察其選擇性殺傷效果，選取對U87mg細(xì)胞，以2×10⁴個(gè)細(xì)胞/ 孔的濃度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)( 每孔100μL 培基)，加入10μL 不同濃度的藥物材料，在無血清培基中37℃、5％的CO₂條件下孵育32小時(shí)；共孵育后75μL 無血清培養(yǎng)基溶液去除，補(bǔ)充含10％血清的新鮮培基至100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h ；10μL Cell Counting Kit 單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒加入每孔，孵育4h ；直接在酶標(biāo)儀490nm 處讀數(shù)據(jù)，計(jì)算出細(xì)胞在不同濃度作用下的存活率。由圖4 可見，游離阿霉素藥物、普通硅質(zhì)體₂@阿霉素，和靶向硅質(zhì)體@阿霉素在1～ 50μnmol 的濃度范圍內(nèi)U87mg細(xì)胞的影響。隨著藥物濃度增大，細(xì)胞的存活率呈下降趨勢，細(xì)胞殺傷率高低順序依次為阿霉素 > 靶向硅質(zhì)體@阿霉素 > 硅質(zhì)體@阿霉素。

硅質(zhì)體安全性評價(jià)：參照實(shí)施例1,3 的步驟制備普通硅質(zhì)體₂、脂質(zhì)體和靶向硅質(zhì)體。為考察其選擇性殺傷效果，選取對NIH3T3細(xì)胞，以2×10⁴個(gè)細(xì)胞/ 孔的濃度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)( 每孔100μL 培基)，加入10μL 不同濃度的藥物材料，在無血清培基中37℃、5％的CO₂條件下孵育32小時(shí)；共孵育后75μL 無血清培養(yǎng)基溶液去除，補(bǔ)充含10％血清的新鮮培基至100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h ；10μL Cell Counting Kit 單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒加入每孔，孵育4h ；直接在酶標(biāo)儀490nm 處讀數(shù)據(jù)，計(jì)算出細(xì)胞在不同濃度作用下的存活率。由圖5 可見，細(xì)胞的存活率無明顯趨勢，說明硅質(zhì)體載體材料安全性高。