本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的動(dòng)態(tài)過程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量合成、分泌，而降解絕對(duì)或相對(duì)不足，使ECM在肝臟內(nèi)彌漫沉積。其起始于肝細(xì)胞(HC)壞死，隨之是炎癥反應(yīng)、纖維生成介質(zhì)釋放，肝星狀細(xì)胞(FSC)激活，最終以肝臟結(jié)締組織成分的合成與降解明顯失去平衡。肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，是影響預(yù)后的重要因素。

過去的20年間，肝纖維化的研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，證實(shí)肝纖維化與一定程度的肝硬化都是可逆的。近年來陸續(xù)出現(xiàn)了一些抗肝纖維化治療方法，包括化學(xué)藥、生物制劑、中藥與基因療法等，但是理想的臨床治療手段仍然缺乏(劉平.加強(qiáng)抗肝纖維化作用機(jī)制的研究.中華肝病雜志，2005,8(13)：561)。目前防治肝纖維的關(guān)鍵是針對(duì)與肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)的環(huán)節(jié)，主要是：減輕肝損傷；抑制星狀細(xì)胞激活，減少細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生；調(diào)節(jié)細(xì)胞因子紊亂，促進(jìn)活化肝星狀細(xì)胞凋亡；抑制肝臟成纖維細(xì)胞的增殖以及星狀細(xì)胞激活大量分泌誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的增殖。

從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。

本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2011年發(fā)表(Meng Shao et al.,2010.Psiguadials A and B,Two Novel Meroterpenoids with Unusual Skeletons from the Leaves of Psidium guajava.Organic Letters 12(2010)5040–5043)的化合物，我們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗肝纖維化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其具有抗肝纖維化活性。

由于肝臟星狀細(xì)胞的激活，從而引起了多種生長(zhǎng)因子的大量分泌，這些生長(zhǎng)因子會(huì)誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長(zhǎng)因子之一就是TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個(gè)重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖的藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖，篩選常常在成纖維細(xì)胞上進(jìn)行，NIH/3T3細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為10％和90％。

本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。

藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗肝纖維化作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽具有同樣的藥效。

進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗成纖維細(xì)胞增殖的活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗肝纖維化藥物。

進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的活性，組合物是一個(gè)極具開發(fā)潛力的化合物,它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1化合物Psiguadial A的制備

化合物Psiguadial A(I)的制備方法參照Meng Shao等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Meng Shao et al.,2010.Psiguadials A and B,Two Novel Meroterpenoids with Unusual Skeletons from the Leaves of Psidium guajava.Organic Letters 12(2010)5040–5043)的方法。

實(shí)施例2 Psiguadial A的O-溴乙基衍生物(II)的合成

將化合物I(474mg，1.00mmol)溶于20mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.16g)，1,2-二溴乙烷(7.520g，40.00mmol)和12mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌8h。8h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(502mg，73％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.44(s,2H),7.24(s,2H),7.20(d,J＝10.0Hz,3H),4.31(s,4H),3.89(s,1H),3.74(s,4H),2.30(s,1H),2.12(s,1H),2.02(s,1H),1.92(s,1H),1.79(s,1H),1.73(s,1H),1.51(d,J＝19.8Hz,3H),0.99(s,3H),0.95(d,J＝4.7Hz,7H),0.85(s,3H),0.53(s,1H),0.43(s,1H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ188.69(s),170.54(s),165.42(s),163.38(s),142.72(s),129.71(s),127.96(s),127.08(s),118.00(s),116.82(s),114.82(s),72.73(s),40.19(s),34.75(s),34.32(s),31.75(s),30.93(s),28.09(s),26.43(s),24.48(s),23.74(s),21.18(s),20.77(s),19.99(s),14.39(s).

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₃₄H₄₁Br₂O₅:689.1300；found 689.1303.

實(shí)施例3 Psiguadial A的O-(哌嗪基)乙基衍生物(III)的合成

將化合物II(344mg，0.5mmol)溶于25mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg，5.0mmol)，碘化鉀(168mg，1.0mmol)和無水哌嗪(3446mg，40mmol)，混合物加熱回流4h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集黃色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物III的黃色粉末(254.8mg,73％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.46(s,2H),7.23(s,2H),7.20(d,J＝10.0Hz,3H),4.02(s,4H),3.96(s,1H),2.62(d,J＝8.0Hz,12H),2.31(s,8H),2.10(s,1H),2.01–1.85(m,3H),1.79(s,1H),1.66(s,1H),1.44(s,2H),1.38(s,1H),1.27(s,1H),1.05(s,2H),1.03(d,J＝45.8Hz,3H),0.93–0.70(m,9H),0.52(s,1H),0.23(s,1H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ188.62(s),170.44(s),165.27(s),163.22(s),142.59(s),129.52(s),127.80(s),126.91(s),117.86(s),116.67(s),114.65(s),69.34(s),54.61(s),54.05(s),45.17(s),40.02(s),34.61(s),34.17(s),30.77(s),27.92(s),26.29(s),24.33(s),23.57(s),21.00(s),20.62(s),19.84(s),14.21(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₂H₅₉N₄O₅:699.4485；found:699.4480。

實(shí)施例4 Psiguadial A的O-(1H-四氮唑基)乙基衍生物(IV)的合成

將化合物II(344mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg，5.0mmol)，碘化鉀(168mg，1.0mmol)和1H-四氮唑(1401mg，20mmol)，混合物加熱回流2h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。因?yàn)榛プ儺悩?gòu)作用，在反應(yīng)條件下會(huì)生成1H-四氮唑基和2H-四氮唑基兩種取代產(chǎn)物。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1，v/v)，收集黃色集中洗脫帶，再將洗脫帶濃縮，用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，依次收集兩個(gè)淡黃色的洗脫帶，濃縮前1個(gè)洗脫帶即得到化合物IV的淡黃色固體(89.9mg,27％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.47(s,2H),10.40(s,1H),10.26(s,1H),7.24(s,2H),7.21(d,J＝10.0Hz,3H),4.65(s,1H),4.60(s,1H),4.45(d,J＝2.6Hz,5H),4.42(s,1H),4.07(s,1H),2.20(s,1H),1.93–1.84(m,4H),1.72(s,1H),1.60–1.21(m,4H),0.99(s,3H),0.92–0.71(m,9H),0.55(s,1H),0.25(s,1H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ188.53(s),170.35(s),165.18(s),163.13(s),144.94(s),142.48(s),129.45(s),127.69(s),126.84(s),117.75(s),116.60(s),114.54(s),67.03(s),47.04(s),39.95(s),34.52(s),34.10(s),30.66(s),27.85(s),26.18(s),24.26(s),23.46(s),20.93(s),20.51(s),19.77(s),14.10(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₃₆H₄₃N₈O₅:667.3356；found:667.3352。

實(shí)施例5組合物抗肝纖維化活性

由于肝臟星狀細(xì)胞的激活，從而引起了多種生長(zhǎng)因子的大量分泌，這些生長(zhǎng)因子會(huì)誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長(zhǎng)因子之一就是TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個(gè)重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖的藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖，篩選常常在成纖維細(xì)胞上進(jìn)行，NIH/3T3細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株。

組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的10mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的90mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時(shí)用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。

實(shí)驗(yàn)例1：組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3增殖的抑制作用

一、實(shí)驗(yàn)方法：

NIH/3T3細(xì)胞株購(gòu)自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的亞融合的NIH/3T3細(xì)胞用0.25％胰酶消化，洗滌，離心后，用DMEM培養(yǎng)液(含10％FCS)制成1×10⁴cell/ml的細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定存活率大于95％，按每孔100ul加入96孔板中，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)24h同步處理后，棄上清，加入含有藥物的DMEM培養(yǎng)液(含10％FCS)200ul，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。棄去培養(yǎng)液，加入150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀490nm處讀取OD值，結(jié)果以O(shè)D₄₉₀表示。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、形態(tài)學(xué)觀察

NIH/3T3在用藥前伸展良好，折光性較弱，有方向性，呈放射狀，細(xì)胞增殖的速度快；而加組合物24h后，成纖維細(xì)胞數(shù)目減少，形狀變得不規(guī)則，突起變短，細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物增多?；衔颕II和化合物IV無此作用。

MTT法檢測(cè)組合物對(duì)NIH/3T3細(xì)胞增殖的抑制作用。

表1：MTT法檢測(cè)組合物對(duì)NIH/3T3增殖的抑制作用

注：*，與細(xì)胞陰性對(duì)照P<0.05

結(jié)果：組合物在20ug/ml對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。表明組合物體外對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用?；衔颕II和化合物IV無此作用。

實(shí)驗(yàn)例2：組合物對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β₁(TGF-β₁)誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用

TGF-β₁是促進(jìn)細(xì)胞增殖和膠原生成的強(qiáng)活性因子，在細(xì)胞中加入TGF-β₁10ng/ml刺激細(xì)胞增殖，再檢測(cè)藥物對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用，以分析判斷組合物的作用機(jī)理。

表2：MTT法檢測(cè)組合物對(duì)TGF誘導(dǎo)NIH/3T3增殖的抑制作用

注：*，與細(xì)胞+TGF對(duì)照P<0.05

結(jié)果：組合物在20ug/ml對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-β₁的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，化合物III和化合物IV無此作用。表明組合物體外對(duì)纖維細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過干預(yù)TGF信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

結(jié)論：組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用；組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-β₁的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。組合物可以用來制備抗肝纖維化藥物?；衔颕II和化合物IV對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖無顯著的抑制作用，對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-β₁的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖無顯著的抑制作用，不可以用來制備抗肝纖維化藥物。

實(shí)施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備

取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。

實(shí)施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備

取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。